CN113817720A - 有机微孔滤网滤纸条的制备及其在快速检测柑橘黄龙病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有机微孔滤网滤纸条，包括有机微孔滤网，有机微孔滤网一端为手持端、另一端为暴露端；手持端具有三明治结构，包括中间的有机微孔滤网以及附着在有机微孔滤网两面的滤纸；暴露端仅为有机微孔滤网。利用该有机微孔滤网滤纸条，于特定缓冲液中研磨和裂解获得的植物组织液中吸附样品DNA，通过洗涤液去除杂质，再将吸附的样品DNA洗脱到去离子水中，完成样品DNA捕获。据此，将其用于柑橘黄龙病的LAMP方法中，能够快速、简便、经济地在田间快速检测黄龙病菌，对于柑橘黄龙病防控具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于柑橘黄龙病检测技术领域，尤其涉及一种有机微孔滤网滤纸条的制备及其在快速检测柑橘黄龙病中的应用，具体是利用有机微孔滤网滤纸条捕获样品DNA的方法以及据此检测柑橘黄龙病的LAMP方法。
背景技术
柑橘黄龙病发生严重，破坏性强，症状复杂，难以田间诊断，有效监测黄龙病的发生和分布是有效控制黄龙病的关键。因此，寻求更加准确、便捷、高效和低成本的检测技术对于防控此病具有非常重要的意义。目前在国际上主要采用PCR、巢式PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)、串联重复序列的聚合酶链式置换反应(TR-PCDR)和液滴数字PCR等技术检测柑橘黄龙病。上述检测技术虽然灵敏度高，但是操作步骤复杂，需要昂贵的仪器设备，无法在田间应用，检测成本也较高。其中，在田间检测中最难实现的是DNA的快速提取。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种快速、简便、经济且易实现样品DNA提取的有机微孔滤网滤纸条的制备及其在快速检测柑橘黄龙病中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
有机微孔滤网滤纸条，包括有机微孔滤网，有机微孔滤网一端为手持端、另一端为暴露端；手持端具有三明治结构，包括中间的有机微孔滤网以及附着在有机微孔滤网两面的滤纸；暴露端仅为有机微孔滤网。
上述有机微孔滤网滤纸条的制备方法，将有机微孔滤网的两面与滤纸粘贴形成三明治结构，再裁剪成条状，一端暴露有机微孔滤网，另一端为为较有机微孔滤网更直挺的具有三明治结构的滤纸，两面滤纸中间夹着有机微孔滤网，便于手持。
上述有机微孔滤网滤纸条在捕获样品DNA中的应用。
有机微孔滤网滤纸条捕获样品DNA的方法，利用有机微孔滤网滤纸条，于研磨和裂解获得的植物组织液中吸附样品DNA，通过洗涤液去除杂质，再将吸附的样品DNA洗脱到去离子水中，完成样品DNA捕获；植物组织液由植物组织置于特定缓冲液中研磨和裂解而得；特定缓冲液包含20mM Tris-HCl(pH8.0)、25mM NaCl、2.5mM EDTA、0.05％SDS、2％DTT、3％PVP。
上述有机微孔滤网滤纸条在快速检测柑橘黄龙病中的应用。
快速检测柑橘黄龙病的LAMP方法，利用上述的有机微孔滤网滤纸条捕获样品DNA用于柑橘黄龙病的LAMP检测中。
快速检测柑橘黄龙病的LAMP方法，包括以下步骤：
(1)有机微孔滤网滤纸条法捕获核酸
撕取0.2g左右待测组织样品置于预装有裂解液的研磨袋中，用光滑硬物(如砝码等)将待测组织样品研磨破碎，然后用巴氏吸管吸取研磨得到的汁液于2mL离心管中，将有机微孔滤网滤纸条放入汁液中蘸3次，再置于预装有1mL洗涤液的2mL离心管中清洗3次，随后于含25μL LAMP反应液0.5mL离心管中蘸洗3次进行洗脱；
(2)LAMP反应
LAMP反应程序为：65℃，30min；85℃，7min。
裂解液为特定缓冲液，包含20mM Tris-HCl(pH8.0)、25mM NaCl、2.5mM EDTA、0.05％SDS、2％DTT、3％PVP；洗涤液为75％乙醇。
LAMP反应液：10×ThermoPol Buffer 2.5μL、dNTP(10mM)3.0μL、MgSO4(100mM)1.5μL、Tween-20(0.5％)0.5μL、FIP/BIP(10mM)4.0μL、F3/B3(10mM)4.0μL、Bst DNA聚合酶0.75μL、ddH2O 8.75μL，共25.0μL。
引物F3、FIP、BIP、B3分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。
针对目前田间检测中DNA快速提取的问题，发明人设计了一种有机微孔滤网滤纸条，包括有机微孔滤网，有机微孔滤网一端为手持端、另一端为暴露端；手持端具有三明治结构，包括中间的有机微孔滤网以及附着在有机微孔滤网两面的滤纸；暴露端仅为有机微孔滤网。利用该有机微孔滤网滤纸条，于特定缓冲液中研磨和裂解获得的植物组织液中吸附样品DNA，通过洗涤液去除杂质，再将吸附的样品DNA洗脱到去离子水中，完成样品DNA捕获。应用该有机微孔滤网滤纸条可实现田间检测中DNA快速提取，省去了操作复杂的DNA提取步骤，进而节省DNA提取所需的试剂成本，具有操作简便快捷、灵敏度高、结果可视化和检测成本低等优点，还可以兼容LAMP和PCR等分子检测方法。据此，将其用于柑橘黄龙病的LAMP检测方法中，能够快速、简便、经济地在田间快速检测黄龙病菌，对于柑橘黄龙病防控具有重要意义。
附图说明
图1是本发明有机微孔滤网滤纸条的结构示意图，图中：1有机微孔滤网，2滤纸。
图2是本发明有机微孔滤网滤纸条的纵切面结构示意图，图中：1有机微孔滤网，2滤纸。
图3是柑橘黄龙病检测LAMP反应产物显色图，图中：第1管为无模板空白对照反应产物；第2管为CTAB法提取的健康柑橘样品DNA的LAMP反应产物；第3管为CTAB法提取的柑橘黄龙病阳性样品DNA的LAMP反应产物；第4管为试剂盒法提取的柑橘黄龙病阳性样品DNA的LAMP反应产物；第5管为有机微孔滤网滤纸条捕获的柑橘黄龙病阳性样品DNA的LAMP反应产物；第6管为有机微孔滤网滤纸条捕获的健康柑橘样品DNA的LAMP反应产物；第7管为有机微孔滤网滤纸条捕获的柑橘黄龙病阳性样品DNA的LAMP反应产物；第8管为有机微孔滤网滤纸条捕获的健康柑橘样品DNA的LAMP反应产物。
具体实施方式
一、试验材料
柑橘叶片样品：实验室保存的健康柑橘叶片样品和感染柑橘黄龙病的样品。
试剂和药品：引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其它试剂和药品为国产分析纯。
耗材：有机微孔滤网(材质为尼龙，规格为10cm×10cm)购自PRAISE BLOTECH公司，0.2mL PCR管和2mL离心管购自美国AXYGEN公司，研磨袋、滤纸和微量巴氏吸管(10μL)为国产耗材。
有机微孔滤网滤纸条(如图1和图2所示)：将有机微孔滤网的两面与滤纸用固体胶粘贴形成三明治结构(中间为有机微孔滤网、两面为滤纸)，再裁剪成条状，一端暴露有机微孔滤网，另一端为较有机微孔滤网更直挺的滤纸，便于手持。
二、试验方法
1.引物的设计与合成
根据文献及GenBank网站上已报道的柑橘黄龙病菌的基因组保守区序列，应用GLAPD软件进行全基因组分析，设计表1所示4条黄龙病LAMP检测引物。
表1黄龙病LAMP检测引物
2.LAMP反应液的制备
取LAMP反应液预混液25μL(10×ThermoPol Buffer 2.5μL、10mM dNTP 3.0μL，100mM MgSO4 1.5μL，0.5％Tween-20 0.5μL，10mM FIP/BIP 4.0μL，10mM F3/B3 4.0μL，BstDNA聚合酶0.75μL，ddH2O 8.75μL)于无菌的0.5mL离心管中，置于冰上备用。
3.有机微孔滤网滤纸条捕获柑橘叶片样品DNA
撕取0.2g左右待测组织样品置于预装有裂解液[20mM Tris-HCl(pH8.0)、25mMNaCl、2.5mM EDTA、0.05％SDS、2％DTT、3％PVP]的研磨袋中，用光滑硬物(如砝码等)将待测组织样品研磨破碎，然后将研磨得到的汁液用微量巴氏吸管吸到干净的2mL离心管中，有机微孔滤网滤纸条放入汁液中蘸洗3次，再置于预装有1mL洗涤液(75％乙醇)的2mL离心管中清洗3次，随后于含25μL LAMP反应液0.5mL离心管中蘸洗3次进行洗脱。
3.LAMP与LAMP扩增产物检测
由于LAMP反应灵敏，极易造成气溶胶污染，所以在洗脱样品DNA后需在反应液上加入油层体积厚度约1mm的石蜡油封闭反应液体系，然后在管壁上滴加SYBR Green Ⅰ，用封口膜将反应管口封住，将装有上述含有样品DNA的反应液的离心管置于恒温金属浴上，LAMP反应程序为：65℃，30min；85℃，7min。
反应结束后将SYBR Green Ⅰ染料甩入体系中，混匀，置于常温下几分钟等待显色反应，出现绿色表明为阳性，橙色则表明为阴性，以此判断待测样品是否感染柑橘黄龙病。
如图3所示，结果表明本发明的样品DNA提取方法结合LAMP检测方法能有效检测柑橘黄龙病；同时，有机微孔滤网滤纸条捕获样品DNA与CTAB法提取、试剂盒法结果一致，而且操作更简便、快速，成本更经济。
序列表
<110> 广西大学
<120> 有机微孔滤网滤纸条的制备及其在快速检测柑橘黄龙病中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgatcagca tggaacgg 18
Claims (10)
1.一种有机微孔滤网滤纸条，其特征在于包括有机微孔滤网，有机微孔滤网一端为手持端、另一端为暴露端；所述手持端具有三明治结构，包括中间的有机微孔滤网以及附着在有机微孔滤网两面的滤纸；所述暴露端仅为有机微孔滤网。
2.权利要求1所述有机微孔滤网滤纸条的制备方法，其特征在于：将有机微孔滤网的两面与滤纸粘贴形成三明治结构，再裁剪成条状，一端暴露有机微孔滤网，另一端为三明治结构的滤纸，两面滤纸中间夹有有机微孔滤网。
3.权利要求1所述有机微孔滤网滤纸条在捕获样品DNA中的应用。
4.权利要求1所述有机微孔滤网滤纸条捕获样品DNA的方法，其特征在于：利用有机微孔滤网滤纸条，于研磨和裂解获得的植物组织液中吸附样品DNA，通过洗涤液去除杂质，再将吸附的样品DNA洗脱到去离子水中，完成样品DNA捕获；所述植物组织液由植物组织置于特定缓冲液中研磨和裂解而得；所述特定缓冲液包含20mM Tris-HClpH8.0、25mM NaCl、2.5mM EDTA、0.05％SDS、2％DTT、3％PVP。
5.权利要求1所述有机微孔滤网滤纸条在快速检测柑橘黄龙病中的应用。
6.一种快速检测柑橘黄龙病的LAMP方法，其特征在于：利用权利要求1所述的有机微孔滤网滤纸条捕获样品DNA用于柑橘黄龙病的LAMP检测中。
7.根据权利要求6所述的快速检测柑橘黄龙病的LAMP方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)有机微孔滤网滤纸条法捕获核酸
撕取0.2g左右待测组织样品置于预装有裂解液的研磨袋中，用光滑硬物将待测组织样品研磨破碎，然后用巴氏吸管吸取研磨得到的汁液于2mL离心管中，将有机微孔滤网滤纸条放入汁液中蘸3次，再置于预装有1mL洗涤液的2mL离心管中清洗3次，随后于含25μL LAMP反应液的0.5mL离心管中蘸洗3次进行洗脱；
(2)LAMP反应
LAMP反应程序为：65℃，30min；85℃，7min。
8.根据权利要求7所述的快速检测柑橘黄龙病的LAMP方法，其特征在于：所述裂解液为特定缓冲液，包含20mM Tris-HCl pH8.0、25mM NaCl、2.5mM EDTA、0.05％SDS、2％DTT、3％PVP；所述洗涤液为75％乙醇。
9.根据权利要求7所述的快速检测柑橘黄龙病的LAMP方法，其特征在于：所述LAMP反应液：10×ThermoPol Buffer 2.5μL、dNTP 10mM 3.0μL，MgSO4 100mM 1.5μL、Tween-200.5％0.5μL、FIP/BIP 10mM 4.0μL、F3/B3 10mM 4.0μL、Bst DNA聚合酶0.75μL、ddH2O 8.75μL，共25.0μL。
10.根据权利要求7所述的快速检测柑橘黄龙病的LAMP方法，其特征在于：所述引物F3、FIP、BIP、B3分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.4的碱基序列。
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Cited By (1)
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| CN112430687A (zh) * | 2020-12-10 | 2021-03-02 | 广西大学 | 基于滤纸条捕获病毒核酸的rt-pcr快速检测马铃薯病毒的方法 |
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