CN114836413A - 提取dna的试剂盒及dna提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提取DNA的试剂盒，包括裂解液、萃取棒、清洗液、洗脱液；裂解液用于裂解生物样品；萃取棒用于萃取生物样品中的DNA，该萃取棒包括棒体、固定在棒体外壁上的复合膜，该复合膜包括硝酸纤维膜和粘附在硝酸纤维膜上的吸附材料M‑UIO‑66‑NH2；洗脱液用于将复合膜上吸附的DNA洗脱下来。适用于设备条件简陋的现场检测。本发明还公开DNA提取方法，能够快速提取DNA，适用于现场检测。
Description
技术领域
本发明涉及核酸提取技术领域，尤其是涉及一种提取DNA的试剂盒及DNA提取方法。
背景技术
在食品中，尤其在肉类食品这一类里，经常有媒体报道肉类掺假事件，例如往高价肉制品经常掺入劣质或低成本肉。其它的肉类掺假手段包括使用其它动物物种、组织、蛋白质替代肉类原料；伪造肉类产地和动物饲养制度(特别是在涉及传统/区域肉类产品时)；修改加工方法和添加非肉类成分。
迄今为止，有很多用于鉴别肉类掺假的分析方法，它们主要基于靶蛋白分析，例如，光谱法、质谱法、色谱法、电泳法和免疫分析法等代表性方法都是使用特定的蛋白质作为目标检测指标，其中一些已经成功商业化，成为常规分析或监测的测试试剂盒或设备。然而，这些分析方法还是存在不足之处，例如在样品预处理过程中或加工食品中会使蛋白质变性，还有高成本，严格的操作环境，有限的资源都会极大地阻碍了这些方法的实际应用。与其它技术相比，基于核酸的(分子)分析技术具有更多的优势，例如更高的检测灵敏度、更高的修饰灵活性、特异性和更快的检测结果。
脱氧核糖核酸(DNA)在生物体内的含量较低。因而，高效、简便的DNA提取方法是影响后续分子生物技术如测序、变异分析、克隆等质量的重要一环。就技术而言，基于DNA的检测过程主要包括三个部分：DNA提取、DNA扩增和结果判断，建立基于DNA的现场快速检测技术则是将这三个部分有机融合。DNA提取是分子检测的前提和先决条件，良好的提取方法是检测成功的关键。目前DNA提取和纯化的方法主要分为液液萃取和固相萃取两类。液液萃取(Liquid-liquid extraction,LLE)是一种基于有机溶剂的提取方法，基于对水溶液pH值的操纵，将DNA提取到有机溶剂中，是经典的DNA提取纯化方法，其获得的DNA纯度高、浓度高。但该类方法使用多种有机试剂，且提取时间长，不适用于现场检测。固相萃取(Solid phaseextraction,SPE)主要基于材料作为DNA的吸附剂，并在特定条件下实现DNA的“结合释放”。因此，需要具有DNA结合能力强的材料。在此之前，有很多材料用于DNA吸附，例如磁性纳米颗粒(MNP)、二氧化硅、无机非金属材料的聚合物等。目前，市场上有许多以硅胶柱和磁珠为基础的核酸提取试剂盒，这些试剂盒的应用减少了实验操作对工作人员的健康风险，也降低了对实验设备的特殊要求。但是，对其它提取DNA的试剂盒和DNA提取方法研究相对较少。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术的现状，提供一种适用于现场检测的快速提取DNA的试剂盒。
本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术的现状，提供一种应用有上述应用有提取DNA的试剂盒的DNA提取方法，适用于现场检测。
本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种提取DNA的试剂盒，其特征在于：包括
裂解液，用于裂解生物样品；
萃取棒，用于萃取裂解液中的DNA，该萃取棒包括棒体、固定在棒体外壁上的复合膜，该复合膜包括硝酸纤维膜和粘附在硝酸纤维膜上的吸附材料M-UIO-66-NH2；
清洗液，用于去除萃取棒上除DNA外的其余杂质；
洗脱液，用于将复合膜上吸附的DNA洗脱下来。
棒体和硝酸纤维膜固定的方式也可以有多种，优选地，所述棒体和复合膜之间粘接固定。也可以通过卡接、限位等方式实现两者的固定。
硝酸纤维膜和吸附材料M-UIO-66-NH2之间固定的方式有多种，优选地，所述硝酸纤维膜和吸附材料M-UIO-66-NH2之间通过聚乙烯吡咯烷酮来粘接固定。与聚乙烯醇和聚丙烯腈相比，聚乙烯吡咯烷酮的成膜性和粘结性更好。硝酸纤维素膜具有亲水性、耐弱酸等特点，且表面光滑，使得吸附材料M-UIO-66-NH2能够更好被固定在硝酸纤维膜上。
本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：DNA提取方法，通过如上述的提取DNA的试剂盒来提取DNA，其特征在于：包括
步骤S1、裂解和吸附：将生物样品放置在容器中，加入所述裂解液，将萃取棒放入裂解液中10秒；
步骤S2、清洗：将步骤S1的萃取棒放入清洗液中清洗20秒；
步骤S3、洗脱：将步骤S2经清洗液清洗后的萃取棒放入所述洗脱液30秒。
裂解液的具体成分是，所述裂解液包括pH 8.0的100mM Tris-HCl、5mM EDTA、200mM NaCl、1％SDS。
清洗液的具体成分是，所述清洗液为去离子水。
洗脱液的具体成分是，所述洗脱液为10mM Tris溶液，pH 7.0。
萃取棒的制备方式具体是，所述萃取棒采用如下方法得到：
(1)制备M-UIO-66-NH2粉末：将四氯化锆、对苯二甲酸、二氨基对苯二甲酸、乙酸和二甲基甲酰胺充分混合，其中二氨基对苯二甲酸在对苯二甲酸和二氨基对苯二甲酸中所占的质量比为40％；
然后将混合后的材料装入水热合成反应釜中，于马弗炉中120℃加热24小时；冷却至室温后，离心分离得到粉末，用二甲基甲酰胺和乙醇洗涤多次，在150℃真空干燥12小时；
将得到的白色粉末置于马弗炉中350℃下加热2小时，冷却至室温后，得到样品粉末；
(2)制作萃取棒：将上述步骤(1)最终得到的样品粉末分散在甲醇溶液中，放入超声仪超声2小时，再往溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮，搅拌均匀后，将硝酸纤维膜作为基底浸入溶液中，风干后得到的为M-UIO-66-NH2膜，即所述的复合膜，最后将复合膜用双面胶粘在棒体的外周壁上，制得所述萃取棒。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)该DNA提取试剂盒，可在室温下使用萃取棒提取DNA，无需控温设备，并且能够避免离心管中DNA发生蒸汽交叉污染，适用于设备条件简陋的现场检测。
(2)该DNA提取试剂盒，使用M-UIO-66-NH2制成的萃取棒，仅需要1分钟就可以快速结合样品DNA，并且不容易结合干扰成分，从而使提取的DNA纯度高；而普通的试剂盒提取纯化DNA大概需要123分钟，本发明的试剂盒可以大大缩短DNA提取的时间，从而缩短掺假等检测的时间，适用于现场检测。
(3)本发明的萃取棒洗脱完全后可反复使用，且同一根萃取棒使用1次与使用100次的结果相差较小，大大降低实验成本。
(4)本发明的萃取棒能很好地与多重PCR技术相结合，运用于肉制品掺假检验中。
附图说明
图1为本发明实施例中萃取棒的结构图；
图2为本发明实施例中DNA洗脱时间的优化；
图3为本发明实施例中萃取棒的普适性、重现性、化学稳定性和重复性效果图，M是DNA Marker，K是采用本发明实施例的DNA试剂盒提取的DNA；
图4为本发明实施例的方法与多重PCR扩增技术结合结果图；
图5为本发明实施例的萃取棒提取DNA与试剂盒法提取DNA对比图；
图6为本发明实施例的萃取棒在烧烤肉样的掺假应用。
图7为不同裂解液提取的DNA浓度的结果图；
图8为采用不同pH的洗脱液的电泳结果图；
图9为采用不同浓度的洗脱液的电泳结果图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
本实施例的提取DNA的试剂盒包括裂解液、清洗液、萃取棒和洗脱液。
其中，裂解液用于裂解生物样品。裂解液包括100mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mMEDTA，200mM NaCl，1％SDS。
萃取棒用于萃取裂解液中的DNA，该萃取棒包括棒体、固定在棒体外壁上的复合膜，该复合膜包括硝酸纤维膜和粘附在硝酸纤维膜上的吸附材料，该复合膜也记作M-UIO-66-NH2膜。清洗液用于去除样品中可能抑制DNA扩增反应污染物，例如蛋白质、盐及其它杂质。洗脱液用于将萃取棒上吸附的DNA洗脱下来。
提取DNA的萃取棒的制备方法具体如下。
(1)制备M-UIO-66-NH2粉末：将四氯化锆ZrCl4、对苯二甲酸H2BDC、二氨基对苯二甲酸H2BDC-NH2、乙酸和二甲基甲酰胺充分混合，其中二氨基对苯二甲酸在对苯二甲酸和二氨基对苯二甲酸中所占的质量比为40％；
然后将混合后的材料装入水热合成反应釜中，于马弗炉中120℃加热24小时；冷却至室温后，离心分离得到粉末，用二甲基甲酰胺和乙醇洗涤多次，在150℃真空干燥12小时；
将得到的白色粉末(记作UIO-66-NH2-40％)置于马弗炉中350℃下加热2小时，冷却至室温后，得到样品粉末(记作M-UiO-66-NH2-40％)，也就是UIO-66-NH2-40％经过高温煅烧后由微孔结构形成了介孔结构，成为M-UiO-66-NH2-40％；
(2)制作萃取棒：将上述步骤(1)最终得到的样品粉末(即M-UiO-66-NH2-40％)分散在甲醇溶液中，放入超声仪超声2小时，再往溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮，搅拌均匀后，将硝酸纤维膜作为基底浸入溶液中，风干后得到的为M-UIO-66-NH2膜，即所述的复合膜，最后将复合膜用双面胶粘在棒体的外周壁上，制得所述萃取棒。
萃取棒的结构如图1所示，包括区域为1的一个10cm的木棍、区域为2的一个展开后长1.5厘米，宽1.0厘米的膜(即DNA结合区)。
DNA提取方法：基于萃取棒的DNA提取可分为三个步骤：裂解和吸附、清洗和洗脱。
步骤S1、裂解和吸附。首先，称量30mg猪肉样于微量离心管中，并加入裂解液，将萃取棒浸入300μL裂解液中10秒以捕获DNA。捕获面积为15×10mm，吸收约200-300μL样品，并捕获该体积中存在的DNA。吸附是DNA分离和纯化的重要操作单元。传统吸附剂的直径在亚微米到微米之间，内部孔隙率较大，以确保有足够的表面积用于吸附。而本发明涉及的金属有机框架(Metal organic framework,MOF)因其各种潜在的应用而日益受到关注。特别是Zr基MOF(UiO-66)由二级结构单元(SBU)[Zr6O4(OH)4]和对苯二甲酸所组成。由于带正电的氨基和带负电的DNA分子之间的强大静电力，因此本身带有氨基的UiO-66-NH2表现出更强的DNA捕获能力。
步骤S2、清洗。也就是再将萃取棒放入去离子水中清洗20秒，以去除样品中可能抑制DNA扩增反应污染物，例如蛋白质、盐及其它杂质。同时去离子水，不容易将DNA洗脱下来。
步骤S3、洗脱。也就是最后将萃取棒放入300μL洗脱液(10mM Tris，pH 7.0)中，通过优化洗脱时间来缩短实验时间，实验结果如图2所示，将洗脱时间缩短至10秒时，依旧可以提取出肉样DNA，但是在30秒时，电泳条带最亮，浓度较10秒高，因此认为将萃取棒浸入10mM Tris(pH 7.0)中30秒是大多数应用的理想选择。完成后，可丢弃萃取棒，DNA即被洗脱到洗脱液中，即可直接进行DNA扩增。
实施例2
为了分别探究上述实施例1中的萃取棒的普适性、重现性、化学稳定性和重复性，进行如下实验。
将萃取棒分别提取马肉、羊肉、鸭肉、牛肉、猪肉、鸡肉的DNA后，进行电泳。实验结果如图3a所示。从图3a普适性实验中可见，萃取棒可适用提取马肉、羊肉、鸭肉、牛肉、猪肉、鸡肉的DNA，适用于大部分肉样的提取。
将萃取棒分别提取鸭肉和猪肉的DNA后进行电泳，并做六次平行实验进行重现性实验。实验结果如图3b所示，可见重复性较好。
为研究萃取棒的化学稳定性，首先通过实施例1中的DNA提取方法步骤S1和S2将萃取棒提取五种肉类(牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉和猪肉)的DNA后，由于裂解液和洗脱液含有高含量的水、酸和有机化合物，因此需要分别将萃取棒放在极性溶液(水、甲醇、甲醇与水的混合物(体积比为1：1))中浸泡几天(为突出效果本实例中选择7天)后，分别将浸泡第1天的萃取棒、浸泡第8天的萃取棒上的DNA采用实施例1中的方法洗脱下来，进行扩增结果以电泳图的形式展现。结果如图3c所示，第1天和第8天的电泳条带均很明亮，表明萃取棒具有较高的化学稳定性，即萃取棒的复合膜在裂解液和洗脱液中具有较高的化学稳定性。
将同一个萃取棒提取100次，具体是同一个萃取棒提取1次DNA后洗脱完全，再继续提取DNA后洗脱，重复100次。实验结果如图3d所示，结果表明萃取棒洗脱完全后可反复使用，同一根萃取棒使用1次与使用100次的结果相差较小。
实施例3
采用上述实施例1的DNA提取试剂盒提取DNA，并进行多重PCR扩增技术。多重PCR扩增技术是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。本发明可结合多重PCR扩增技术，将六种肉的引物(引物采用参考文献Cai,Z.；Zhou,S.；Liu,Q.；Ma,H.；Yuan,X.；Gao,J.；Cao,J.；Pan,D.,A Simple and Reliable Single TubeSeptuple PCR Assay for Simultaneous Identification of Seven MeatSpecies.Foods 2021,10(5).)加入到同一反应体系里。具体操作步骤是将六种肉(牛、羊、马、鸡、鸭和猪肉)按照一定比例混合均匀(分别按照不同质量比进行混合，具体是分别按照2:1:1:1:2:1,95:1:1:1:1:1,1:95:1:1:1:1,1:1:95:1:1:1,1:1:1:95:1:1,1:1:1:1:95:1)，然后称取30mg的肉样进行按照实施例1中DNA提取方法提取DNA，利用多重PCR技术进行扩增，最后结果以电泳图呈现。
实验结果如图4所示，表明DNA提取试剂盒提取的DNA成功与多重PCR扩增技术相结合，且成功应用于掺假检测实验。
实施例4
为了比较本发明提取DNA的试剂盒和普通试剂盒提取DNA的时间，采用本申请的试剂盒和普通的试剂盒(天根生化，TIANamp基因组DNA试剂盒)提取DNA。
实验结果如图5所示，可见，两者DNA浓度相差不多，普通的试剂盒提取纯化DNA大概需要123分钟，本发明的试剂盒可以大大缩短DNA提取的时间，只需要1分钟，从而缩短掺假等检测的时间，适用于现场检测。
实施例5
从当地多家烧烤店购买烧烤肉样20份(其中5份牛肉串，4份羊肉串，7份猪肉串，2份肥牛，一份肥羊和一份牛肉丸)，将肉样放入绞肉机绞碎，各称量30mg用本申请的试剂盒和方法进行DNA提取。
实验结果如图6所示，其中5份牛肉中2份样品有掺假；4份羊肉中1份样品有掺假；牛肉丸和肥羊样品都有掺假；7份猪肉样品中均无掺假。可见本实施例的萃取棒可以用于检测肉类掺假。
对比例1：
为了比较5种裂解缓冲液(裂解液1-4、现有的试剂盒法)，提取DNA浓度的效果，进行如下实验。
裂解液1：50mM Tris-HCl(pH 8.0),0.50％Triton X-100,800mM盐酸胍,1％Tween20；
裂解液2：50mM Tris-HCl(pH 8.0),5mM EDTA,100mM NaCl,1500mM盐酸胍,1％Tween 20；
裂解液3：100mM Tris-HCl(pH 8.0),5mM EDTA,200mM NaCl,1％SDS；
裂解液4：10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA,20μL的3μg/μL蛋白酶K；
裂解液1-4，均采用实施例1中的DNA提取方法，DNA被洗脱到洗脱液后，直接用Nano-300微型分光光度计测量DNA浓度。
现有的试剂盒法(天根生化，TIANamp基因组DNA试剂盒)的裂解液，采用试剂盒说明书里面的方法提取DNA，用Nano-300微型分光光度计测量DNA浓度。
实验结果如图7所示，裂解缓冲液3(即本发明实施例1采用的裂解液)获得了最高的DNA浓度，即裂解缓冲液3表现出最高的裂解效率，因为1)SDS使蛋白质变性并破坏膜结构；2)Tris-HCl提供了一个合适的裂解环境；3)EDTA抑制核酸酶对DNA的降解；4)NaCl保持DNA结构稳定并加速DNA结合。
对比例2：
为了比较不同pH洗脱液的洗脱效果，分别采用pH为5、6、7、8的Tris溶液，浓度均为10mM，其余实验步骤均同实施例1中的DNA提取方法，然后取各组的洗脱液进行PCR扩增，将扩增产物用于凝胶电泳，以比较不同pH的洗脱液对萃取棒上吸附DNA的洗脱效果。
实验结果如图8所示，当洗脱液的pH为7时，电泳条带最亮，即对萃取棒的洗脱效果最好。
对比例3：
为了比较不同浓度洗脱液的洗脱效果，分别采用浓度为5mM，10mM，15mM，20mM，25mM和30mM的Tris溶液，pH均为7，其余实验步骤均同实施例1中的DNA提取方法，然后取各组的洗脱液进行PCR扩增，将扩增产物用于凝胶电泳，以比较不同浓度的洗脱液对萃取棒上吸附DNA的洗脱效果。
实验结果如图9所示，10mM和15mM时电泳条带最亮，说明此时对萃取棒的洗脱效果较好。同时为了节省材料，采用10mM的洗脱液进行洗脱。
Claims (8)
1.一种提取DNA的试剂盒，其特征在于：包括
裂解液，用于裂解生物样品；
萃取棒，用于萃取裂解液中的DNA，该萃取棒包括棒体、固定在棒体外壁上的复合膜，该复合膜包括硝酸纤维膜和粘附在硝酸纤维膜上的吸附材料M-UIO-66-NH2；
清洗液，用于去除萃取棒上除DNA外的其余杂质；
洗脱液，用于将复合膜上吸附的DNA洗脱下来。
2.根据权利要求1所述的提取DNA的试剂盒，其特征在于：所述棒体和复合膜之间粘接固定。
3.根据权利要求1所述的提取DNA的试剂盒，其特征在于：所述硝酸纤维膜和吸附材料M-UIO-66-NH2之间通过聚乙烯吡咯烷酮来粘接固定。
4.DNA提取方法，通过如权利要求1～3中任一项所述的提取DNA的试剂盒来提取DNA，其特征在于：包括
步骤S1、裂解和吸附：将生物样品放置在容器中，加入所述裂解液，将萃取棒放入裂解液中10秒；
步骤S2、清洗：将步骤S1的萃取棒放入清洗液中清洗20秒；
步骤S3、洗脱：将步骤S2经清洗液清洗后的萃取棒放入所述洗脱液30秒。
5.根据权利要求4所述的DNA提取方法，其特征在于：所述裂解液包括pH8.0的100mMTris-HCl、5mM EDTA、200mM NaCl，1％SDS。
6.根据权利要求4所述的DNA提取方法，其特征在于：所述清洗液为去离子水。
7.根据权利要求4所述的DNA提取方法，其特征在于：所述洗脱液为10mM Tris溶液，pH7.0。
8.根据权利要求4所述的DNA提取方法，其特征在于：所述萃取棒采用如下方法得到：
(1)制备M-UIO-66-NH2粉末：将四氯化锆、对苯二甲酸、二氨基对苯二甲酸、乙酸和二甲基甲酰胺充分混合，其中二氨基对苯二甲酸在对苯二甲酸和二氨基对苯二甲酸中所占的质量比为40％；
然后将混合后的材料装入水热合成反应釜中，于马弗炉中120℃加热24小时；冷却至室温后，离心分离得到粉末，用二甲基甲酰胺和乙醇洗涤多次，在150℃真空干燥12小时；
将得到的白色粉末置于马弗炉中350℃下加热2小时，冷却至室温后，得到样品粉末；
(2)制作萃取棒：将上述步骤(1)最终得到的样品粉末分散在甲醇溶液中，放入超声仪超声2小时，再往溶液中加入聚乙烯吡咯烷酮，搅拌均匀后，将硝酸纤维膜作为基底浸入溶液中，风干后得到的为M-UIO-66-NH2膜，即所述的复合膜，最后将复合膜用双面胶粘在棒体的外周壁上，制得所述萃取棒。
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