CN113804675A - 一种亚硝酸盐的快速定性和半定量检测剂及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及亚硝酸盐检测技术领域，具体为一种亚硝酸盐的快速定性和半定量检测剂及其检测方法。该凝胶型检测剂包括凝胶载体和检测剂；所述的凝胶载体为海藻酸丙二醇酯，所述的检测剂为对氨基苯乙酮，盐酸萘乙二铵，苹果酸，三乙胺盐酸盐的混合物,以下简称为DTRT。海藻酸丙二醇酯(PGA)是一种良好的凝胶载体；DTRT可与PGA结合制备成凝胶比色管；凝胶剂具有类似钟乳石簇状立体结构，增大了界面反应表面积，5min内可完成检测，适用于亚硝酸盐的快速定性和半定量。凝胶比色管通过Photoshop CS2对颜色进行量化并制作比色卡，该检测方法具有良好的抗干扰能力和高度的专一选择性。
Description
技术领域
本发明涉及亚硝酸盐检测技术领域，具体为一种亚硝酸盐的快速定性和半定量检测剂及其检测方法。
背景技术
亚硝酸盐主要指亚硝酸钠，外观及滋味都与食盐相似。亚硝酸盐含量超标对人类有害，因此亚硝酸盐被广泛认为是一种危害物。亚硝酸盐来源较多，比如在蔬菜种植过程中，氮肥的使用是其硝酸盐积累的重要因素之一，氮肥用量越高，蔬菜中硝酸盐含量就越高。蔬菜中硝酸盐和亚硝酸盐的含量因其种属和部位不同而有所差异；硝酸盐含量的变化受蔬菜生长期、采收时间、储存条件和储存时间的影响，硝酸盐含量生长前期>后期>成熟期，硝酸盐和亚硝酸盐的含量通常为叶柄＞叶＞茎＞根＞花序＞块茎＞球茎＞果实＞种子。硝酸盐在蔬菜自身硝酸还原酶作用下被还原成亚硝酸盐、NO等含氮物，以维持自身氮循环。此外，当采摘后的蔬菜贮存3天左右时，植物体内硝酸还原酶活性会增加，从而导致亚硝酸盐加速生成，冻藏6个月后，硝酸盐含量会明显减少。
微生物的作用也会硝酸盐含量积累，比如人类饮食过程中，硝酸盐可通过唾液腺中的主动转运在唾液中迅速积累，5％的硝酸盐在唾液和肠胃中会被还原为亚硝酸盐，对于转化率较高的个体可达20％；再比如，蔬菜在腌渍过程中，大部分硝酸盐会被硝酸还原菌产生的硝酸还原酶还原为亚硝酸盐，使得亚硝酸盐会在短期内大量积累，形成亚硝峰。
另外，亚硝酸盐还用于肉制品中，起到发色、抑菌防腐、增强风味的作用，是一种被限量使用的食品添加剂。亚硝酸盐极易与肉中的胺类物质形成致癌亚硝胺，所以现在寻求其替代品。
随着我国腌渍蔬菜的产业发展规模及发展趋势，亚硝酸盐含量的快速检测是其进出口贸易和质量安全评价的必要环节，因此研究专用于腌渍蔬菜的亚硝酸盐快速检测方法，有利于提质控耗，在现场实时快速检测中具有很大的应用市场和实用前景。可以为家庭、企业和食品监督部门降低检测成本，提高效率，为亚硝酸盐的快速测定提供新途径等。
目前部分亚硝酸盐的快速检测试剂盒具有较高的检出限、假阳性、保质期短等缺点。特别是发酵蔬菜类食品，由于其酸性较强，且含有食品添加剂或色素等成分，容易造成屏蔽和干扰，因此，研发一种解决以上问题的检测方法势在必行。
发明内容
本发明正是针对以上技术问题，提供一种基于比色原理，以界面反应形式对亚硝酸盐快速定性和半定量的凝胶比色管。该方法中采用的凝胶比色管，具有类似钟乳石簇状立体结构，增大了界面反应表面积，5min内可完成检测，检测范围广，适用于亚硝酸盐的快速定性和半定量，且具有良好的抗干扰能力和高度的专一选择性，保存期限长。
为了实现以上发明目的，本发明的具体技术方案如下：
一种对亚硝酸盐快速定性和半定量测定的凝胶型检测剂，该凝胶型检测剂包括凝胶载体和检测剂；所述的凝胶载体为海藻酸丙二醇酯，所述的检测剂为对氨基苯乙酮，盐酸萘乙二铵，苹果酸，三乙胺盐酸盐的混合物。
作为优选，凝胶载体的质量g和检测剂的体积mL的比例关系为0.2-0.5:10-12，更优选为 0.25:11；对氨基苯乙酮与盐酸萘乙二铵的体积比为3:1-5:1，更优选为4:1，对氨基苯乙酮的浓度为7g/L，盐酸萘乙二铵的浓度为0.4g/L；三乙胺盐酸盐在检测剂中的含量为8-12％，更优选为12％；苹果酸的浓度为0.5-0.7mol/L，更优选为0.6mol/L。
利用所述凝胶型检测剂制备凝胶比色管的方法，包括以下步骤：
1)按比例称取各凝胶型检测剂的原料。
2)将海藻酸丙二醇酯放于烧杯中，加入水后加热边搅拌至海藻酸丙二醇酯溶解完全；作为优选，水的添加量为15mL；加热时间为12min。
3)将步骤2)中溶解后的溶液趁热加入检测剂，搅拌均匀后立即分装至1.5mL的EP管中，当温度降至常温，凝胶定型后密封保存，得到凝胶比色管。
利用前述方法得到的凝胶比色管对亚硝酸盐进行快速定性和半定量检测的方法，该检测方法基于比色原理，以凝胶比色管和界面反应形式对亚硝酸盐进行快速定性和半定量检测。
作为优选，该方法具体包括以下具体步骤：
向含1mL凝胶剂的凝胶比色管中加入0.1mL亚硝酸盐溶液，待凝胶剂界面由无色变为紫红色，一段时间后，用相机记录颜色，再利用Photoshop CS2吸取界面颜色，制作标准比色卡，将亚硝酸盐显色结果与比色卡上对应的数值比对即可快速定性和半定量转换为灰度模式，将颜色的深浅进行量化，根据灰度与亚硝酸盐含量的关系曲线即可对亚硝酸盐定量。
作为优选，该方法的灰度值为39.21±0.36％；显色所需时间为23±3s；检测时间为5 min，适用于亚硝酸盐的快速定性和半定量。
作为优选，凝胶剂中添加0.05％的聚维酮K-30(是凝胶检测剂的保护剂，是否需要在前面成分组成处介绍聚维酮K-30)，可在4℃避光下保存150d以上。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(一)、海藻酸丙二醇酯(PGA)是一种良好的凝胶载体；DTRT可与PGA结合制备成凝胶比色管；凝胶剂具有类似钟乳石簇状立体结构，增大了界面反应表面积，5min内可完成检测，适用于亚硝酸盐的快速定性和半定量。
(二)、凝胶比色管通过Photoshop CS2对颜色进行量化并制作比色卡，该检测方法具有良好的抗干扰能力和高度的专一选择性。
(三)、该凝胶比色管的线性检测范围为0.3～9μg/mL，即3～90mg/kg，检出限为0.3μg/mL，即3mg/kg。凝胶剂中添加0.05％的聚维酮K-30(是凝胶检测剂的保护剂，是否需要在前面成分组成处介绍聚维酮K-30)，可在4℃避光下保存150d以上。
(四)、凝胶比色管适用于腌渍蔬菜中亚硝酸盐风险等级的初步评估。
附图说明
图1为亚硝酸盐的比色测定流程示意图
图2为琼脂和PGA形成的凝胶持水力、溶胀率和硬度的结果柱状示意图
图3-1为PGA的质量对凝胶硬度(a)、显色所需时间(b)、灰度(c)的影响结果图
图3-2为水体积对凝胶硬度(a)、显色所需时间(b)、灰度(c)的影响结果图
图3-3为DTRT的体积对凝胶硬度(a)、显色所需时间(b)、灰度(c)的影响结果图
图3-4为加热时间对凝胶硬度(a)、显色所需时间(b)、灰度(c)的影响结果图
图3-5为各因素对灰度(a)和时间(b)指标最优组合的影响结果图
图3-6为PGA凝胶，PGA+DTRT凝胶，PGA+DTRT+NO2-凝胶的红外光谱图
图3-7为PGA凝胶(a)，PGA+DTRT凝胶(b)，PGA+DTRT+NO2-凝胶(c)的SEM图
图3-8为(a)界面显色结果，(b)界面显色平衡时间，(c)亚硝酸盐的测定范围，(d)标准比色卡结果图
图4-1为凝胶比色管的选择性(a)、抗干扰能力(b)、重现性(c)结果图
注：(b)图中，0代表对照组，1～16，18分别代表浓度为亚硝酸盐1000倍的苯甲酸钠、安赛蜜、脱氢乙酸钠、山梨酸钾、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、柠檬酸钠、EDTA-2Na、半胱氨酸、D-异抗坏血酸钠。17和19分别为 400倍半胱氨酸和100倍D-异抗坏血酸钠。(c)图中1～10代表10个批次的凝胶比色管。
图4-2为保护剂种类对吸光值(a)和凝胶硬度(b)的影响结果图
图4-3为保护剂含量对吸光值(a)和凝胶硬度(b)的影响曲线图
图4-4为4种保护剂复配对吸光值(a)和凝胶硬度(b)的影响结果图
注：0-4分别代表对照组，K-30PVP和双乙酸钠组，K-30PVP和钼酸钠组，K-30 PVP、双乙酸钠和钼酸钠组。
图4-5为4℃避光(a)和常温避光(b)条件下PGA凝胶剂的正常率变化，4℃避光(c)和常温避光(d)条件下PGA凝胶剂测定亚硝酸盐显色灰度的变化曲线图
具体实施方式
一种对亚硝酸盐快速定性和半定量测定的凝胶型检测剂，该凝胶型检测剂包括凝胶载体和检测剂；所述的凝胶载体为海藻酸丙二醇酯，所述的检测剂为对氨基苯乙酮，盐酸萘乙二铵，苹果酸，三乙胺盐酸盐的混合物。凝胶载体的质量g和检测剂的体积mL的比例关系为 0.2-0.5:10-12，优选0.25:11；对氨基苯乙酮与盐酸萘乙二铵的体积比为3:1-5:1，优选 4:1，对氨基苯乙酮的浓度为7g/L，盐酸萘乙二铵的浓度为0.4g/L；三乙胺盐酸盐在检测剂中的含量为8-12％，优选12％；苹果酸的浓度为0.5-0.7mol/L，优选0.6mol/L。
利用所述凝胶型检测剂制备凝胶比色管的方法，包括以下步骤：
1)按比例称取各凝胶型检测剂的原料。
2)将海藻酸丙二醇酯放于烧杯中，加入水后加热边搅拌至海藻酸丙二醇酯溶解完全；作为优选，水的添加量为15mL；加热时间为12min。
3)将步骤2)中溶解后的溶液趁热加入检测剂，搅拌均匀后立即分装至1.5mL的EP管中，当温度降至常温，凝胶定型后密封保存，得到凝胶比色管。
利用前述方法得到的凝胶比色管对亚硝酸盐进行快速定性和半定量检测的方法，该检测方法基于比色原理，以凝胶比色管和界面反应形式对亚硝酸盐进行快速定性和半定量检测。
作为优选，该方法具体包括以下具体步骤：
向含1mL凝胶剂的凝胶比色管中加入0.1mL亚硝酸盐溶液，亚硝酸盐溶液与检测剂发生重氮偶合反应，待凝胶剂的凝胶比色管界面由无色变为紫红色，一段时间后，用相机记录颜色，再利用Photoshop CS2吸取界面颜色制作标准比色卡，将检测亚硝酸盐显色结果与比色卡比对，得到亚硝酸盐含量。同时，将颜色转换为灰度模式，将颜色的深浅进行量化，制作亚硝酸盐浓度与灰度的关系曲线，研究凝胶型检测剂的检测范围和检出限。
作为优选，该方法的灰度值为39.21±0.36％；显色所需时间为23±3s；检测时间为5 min，适用于亚硝酸盐的快速定性和半定量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本申请中的％，如无特殊说明，均表示质量百分含量，即wt％。
实施例1：
一种对亚硝酸盐快速定性和半定量测定的凝胶型检测剂，该凝胶型检测剂包括凝胶载体和检测剂；所述的凝胶载体为海藻酸丙二醇酯，所述的检测剂为对氨基苯乙酮，盐酸萘乙二铵，苹果酸，三乙胺盐酸盐的混合物。凝胶载体的质量g和检测剂的体积mL的比例关系为 0.25:11；对氨基苯乙酮与盐酸萘乙二铵的体积比为4:1，对氨基苯乙酮的浓度为7g/L，盐酸萘乙二铵的浓度为0.4g/L；三乙胺盐酸盐在检测剂中的含量为12％；苹果酸的浓度为0.6 mol/L。
实施例2：
利用凝胶型检测剂制备凝胶比色管的方法，包括以下步骤：
1)按实施例1称取凝胶型检测剂的各种原料；
2)将海藻酸丙二醇酯放于烧杯中，加入水后加热边搅拌至海藻酸丙二醇酯溶解完全；水的添加量为15mL；加热时间为12min。
3)将步骤2)中溶解后的溶液趁热加入检测剂，搅拌均匀后立即分装至1.5mL的EP管中，当温度降至常温，凝胶定型后密封保存，得到凝胶比色管。
实施例3：
利用实施例2得到的凝胶比色管对亚硝酸盐进行快速定性和半定量检测的方法，该检测方法基于比色原理，以凝胶比色管和界面反应形式对亚硝酸盐进行快速定性和半定量检测。
该方法具体如下：
向含1mL凝胶剂的凝胶比色管中加入0.1mL亚硝酸盐溶液，亚硝酸盐溶液与检测剂发生重氮偶合反应，待凝胶剂的凝胶比色管界面由无色变为紫红色，一段时间后，用相机记录颜色，再利用Photoshop CS2吸取界面颜色制作标准比色卡，将检测亚硝酸盐显色结果与比色卡比对，得到亚硝酸盐含量。同时，将颜色转换为灰度模式，将颜色的深浅进行量化，制作亚硝酸盐浓度与灰度的关系曲线，研究凝胶型检测剂的检测范围和检出限。
该方法的灰度值为39.21±0.36％；显色所需时间为23±3s；检测时间为5min，适用于亚硝酸盐的快速定性和半定量。
凝胶型检测剂配方的研究试验：
主要试剂与设备
1.1主要试剂
1.1主要试剂试验所需主要试剂见表1-1。
表1-1主要试验药品
| 试剂名称 | 纯度 | 生产厂家 |
| 亚硝酸钠 | 分析纯 | 上海源叶生物科技有限公司 |
| 苹果酸 | 分析纯 | 成都市科龙化工试剂厂 |
| 对氨基苯乙酮 | 分析纯 | 上海源叶生物科技有限公司 |
| 盐酸萘乙二胺 | 分析纯 | 上海源叶生物科技有限公司 |
| 三乙胺盐酸盐 | 分析纯 | 上海源叶生物科技有限公司 |
| 琼脂 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 结冷胶 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 黄原胶 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 瓜尔胶 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 魔芋胶 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 卡拉胶 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 海藻酸钠 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 海藻酸丙二醇酯 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 聚维酮K-30 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 双乙酸钠 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 钼酸钠 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 聚乙二醇6000 | 分析纯 | 成都市科龙化工试剂厂 |
| 聚乙烯醇 | 分析纯 | 成都市科龙化工试剂厂 |
| 脱氢乙酸钠 | 分析纯 | 成都市科龙化工试剂厂 |
| 苯甲酸钠 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 安赛蜜 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| 山梨酸钾 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
| D-异抗坏血酸钠 | 食品级 | 河南万邦实业有限公司 |
1.2仪器设备试验所需主要仪器与设备见表1-2。
表1-2主要试验仪器
2试验方法
2.1亚硝酸盐的测定及原理
首先向含1mL凝胶剂的EP管中加入0.1mL亚硝酸盐溶液，与液剂型检测剂发生重氮偶合反应，待凝胶比色管界面由无色变为紫红色，一段时间后，用相机记录颜色，再利用Photoshop CS2吸取界面颜色制作标准比色卡，将检测亚硝酸盐显色结果与比色卡比对，得到亚硝酸盐含量，如图1所示。同时，将颜色转换为灰度模式，将颜色的深浅进行量化，制作亚硝酸盐浓度与灰度的关系曲线，研究凝胶型检测剂的检测范围和检出限。
2.2凝胶载体的筛选
腌渍蔬菜成分复杂，大多数水溶性成分与亚硝酸盐共存，对亚硝酸盐的检测易造成干扰或屏蔽，因此需要选择一种耐酸碱性、稳定性较好的凝胶作为界面反应载体，降低硝酸盐共存物的干扰作用，提高亚硝酸盐检测准确度。
2.2.1凝胶载体的初筛
凝胶作为显色反应载体，直接关系到检测灵敏度和显色效果，因此筛选具有载药量大、化学惰性、胶凝效果良好的凝胶材料至关重要。分别制备2％的8种凝胶(琼脂、结冷胶、黄原胶、瓜尔胶、海藻酸丙二醇酯(PGA)、海藻酸钠、魔芋胶、卡拉胶)，采用梯度稀释法研究8种凝胶临界浓度，依次比较凝胶的胶凝状态、耐酸性(1～6mol/L的盐酸)、耐温性(30～80℃)、结合检测试剂的胶凝变化情况及是否变色，初步选择适合作为载体的凝胶材料。
2.2.2凝胶载体的复筛
(1)溶胀率(SR)：依据樊李红和杨建海的方法，称取3份1％的凝胶，50℃烘箱中烘干恒重，室温下浸泡于蒸馏水中直至溶胀平衡，用滤纸除去水凝胶表面残留水分，称其质量，由(3-1)式计算。
式中：M1为凝胶溶胀后的质量，M0为干燥试样质量。
(2)持水力(WHC)：持水性高，表明凝胶有较好的塑性，试剂载量较高。参考Hao Qin的方法，取一定量的凝胶于15mL的离心管中，4500r/min离心15min后用滤纸吸去水分，称量前后质量差。由(3-2)式计算。
式中：M为空离心管质量，M2为离心前凝胶和离心管质量，M3为离心后吸去水分的凝胶和离心管质量。
(3)凝胶硬度：硬度值较高表明凝胶塑性较好，胶凝强度较大。依据刘施琳的方法，制备1.5cm3的凝胶立方体，选择SMS P/36R探头，TPA模式，设定测前、侧后速率为1.0 mm/s，测中速率0.5mm/s，测定距离为8mm，停留时间3s，触发力2.2g。
2.3凝胶型检测剂的制作
称取一定量的PGA于50mL的烧杯中，加入一定量的水，置于电炉上边加热边搅拌，煮沸后开始计时，保持沸腾直到PGA溶解完全，将保持沸腾的记为加热时间，然后趁热加入DTRT，该检测剂中，苹果酸酸性介质，用于提供弱酸性环境，用于配置对氨基苯乙酮。对氨基苯乙酮7g/L，盐酸萘乙二铵0.4g/L，两者体积比例为4：1，是亚硝酸盐检测显色试剂，三乙胺盐酸盐为催化剂，在这个混合体系里面的百分含量为12％。)，搅拌均匀后立即分装至1.5mL的EP管中，当温度降至常温，凝胶定型后密封保存，得到凝胶比色管。
2.3.1载体的质量
以凝胶剂硬度及测定低、中、高浓度(1、5、20μg/mL)的亚硝酸盐时，显色所需时间和灰度为指标，设定溶解PGA的水体积为20mL，加热时间为15min，DTRT的体积为5 mL，研究PGA的质量为0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25g时，对凝胶剂硬度和检测效果的影响。
2.3.2水的体积
设定PGA的质量为1.0g，加热时间为15min，DTRT的体积为5mL，研究水的体积为10、15、20、25、30、35mL时，对凝胶剂硬度和检测效果的影响。
2.3.3检测剂的体积
设定PGA的质量为1.0g，水的体积为15mL，加热时间为15min，研究DTRT的体积为2、4、6、8、10、12mL时，对凝胶剂硬度和检测效果的影响。
2.3.4加热时间
设定PGA的质量为1.0g，水的体积为15mL，DTRT的体积为10mL时，研究加热时间为10、15、20、25、30、35min时，对凝胶剂硬度和检测效果的影响。
2.5凝胶剂配方的优化
根据2.4的研究结果，以显色反应时间和灰度为指标，采用4因素3水平正交试验优化凝胶剂的制作配方，正交试验因素水平表见表1。
表1凝胶剂配方的正交试验因素水平表
2.6凝胶剂的表征
为探究DTRT与PGA凝胶的结合机理及其对亚硝酸盐检测灵敏度的影响，分别采用红外吸收光谱仪(FTIR)和扫描电子显微镜(SEM)对PGA凝胶、PGA凝胶剂(PGA凝胶+DTRT)、测定亚硝酸盐后的凝胶剂(PGA凝胶+DTRT+NO2 -)化学键和官能团的变化及其内部网络结构进行了测量。同时，将干样品进行喷金处理，在15kv的加速电压和500～5000倍扫描电镜下观察水凝胶的内部三维网络结构。
2.7数据处理与分析
采用SPSS 19.0软件进行正交试验设计和显著性差异分析；采用Origin 2018进行图表的绘制；采用Photoshop CS2将凝胶剂测定亚硝酸盐的显色图片颜色转换为灰度模式对其进行量化，并制作标准比色卡，每组试验设3次平行。
3结果与分析
3.1凝胶载体的初筛
由表2可知，胶凝情况较好的有琼脂、结冷胶、PGA、魔芋胶，均具有良好的耐酸耐温性，其中临界浓度结冷胶最低为0.25％，琼脂和PGA相同为0.5％，魔芋胶最高为1.25％。在这4种凝胶加入DTRT亚硝酸盐快速检测剂后，结冷胶和魔芋胶不成型，可能是检测剂的降低了两者的粘聚度。琼脂和PGA结合DTRT成型良好，表明两者的化学惰性较强。因此，初筛琼脂和PGA作进一步研究。
表2凝胶初筛结果
| 名称 | 胶凝情况 | 临界浓度％ | 耐酸性 | 耐温性 | 结合DTRT |
| 琼脂 | 透明成型 | 0.5 | 正常 | 80℃，2h | 正常 |
| 结冷胶 | 奶白色成型 | 0.25 | 正常 | 80℃，3h | 不成型 |
| PGA | 透明成型 | 0.5 | 正常 | 80℃，2h | 正常 |
| 魔芋胶 | 透明成型 | 1.25 | 正常 | 50℃，2h | 不成型 |
| 海藻酸钠 | 透明不成型 | － | － | － | － |
| 卡拉胶 | 不均匀透明成型 | － | － | － | － |
| 黄原胶 | 乳黄色不透明 | － | － | － | － |
| 瓜尔胶 | 乳黄色不透明 | － | － | － | － |
注：“-”代表已淘汰，不具有该指标。
3.2凝胶载体的复筛
根据3.1的筛选结果，比较琼脂和PGA凝胶的溶胀率、持水力、硬度值，选择最适的凝胶载体。结果由图2可知，琼脂和PGA形成的凝胶持水力没有显著性差异，溶胀率和硬度具有显著性差异，PGA凝胶的溶胀率和硬度均高于琼脂，溶胀率越高，表明凝胶载量越大。因此，选择海藻酸丙二醇酯作为凝胶载体。
3.3 PGA质量对凝胶剂硬度及检测效果的影响
PGA质量对凝胶的硬度、显色所需时间、灰度的影响如图3-1(a)、2(b)、2(c)所示。由(a)图可知，凝胶硬度随着PGA质量的增加不断增加。由(b)图可知，凝胶剂界面反应显色所需时间与亚硝酸盐浓度高低相关，测定中、高浓度的亚硝酸盐时，显色所需时间明显较少，且变化较小，在30s内就开始显色，而测定低浓度的亚硝酸盐时，显色所需时间随 PGA质量的增加呈先降低再增加的现象，当PGA的质量在0.25g时最短，但也需要60s以上才开始显色，可能是由于最初PGA凝胶没有形成良好的反应界面，而随着质量越大，凝胶结构越紧密，不利于亚硝酸盐的快速测定。由(c)图可知，测定低、中浓度亚硝酸盐的灰度值随PGA质量的增加呈先增加后降低再趋于稳定的现象，且灰度值均在PGA的质量为0.25 g时最高，而测定高浓度亚硝酸盐的灰度值在PGA的质量为0.1～1g之间时较高，且没有显著性差异。因此，在凝胶成型的情况下，选择PGA的质量为0.25g。
3.4水体积对凝胶剂硬度及检测效果的影响
水的体积对凝胶的硬度、显色所需时间、灰度的影响如图3-2(a)、(b)、(c)所示。由(a)图可知，凝胶硬度随着水体积的增加先升高后降低，在15mL时最大，可能是适当增加水的体积有利于将PGA完全溶解，但水的体积超过15mL，凝胶被稀释，对凝胶成型影响较大。由(b)图可知，测定低、中浓度亚硝酸盐时，显色所需时间先降低再增加，在水体积为 15mL时最低，测定高浓度亚硝酸盐时，显色所需时间在10～15mL之间没有显著性差异，当水的体积超过15mL时，显色所需时间不断增加，可能最初是水体积不断增加，稀释了 DTRT的浓度。由(c)图可知，测定中、高浓度亚硝酸盐的灰度值随水的体积增加呈先增加后降低的现象，且灰度值均在水的体积为15mL时最高，而测定低浓度亚硝酸盐的灰度值在 10～20mL之间较高且没有显著性差异。因此，选择水的体积为15mL。
3.5 DTRT体积对凝胶剂硬度及检测效果的影响
DTRT的体积对凝胶的硬度、显色所需时间、灰度的影响如图3-3(a)、(b)、(c)所示。由(a)图可知，凝胶硬度随DTRT体积的增加先升高后降低再趋于稳定，可能是DTRT的酸度较高，用量过多时降低了凝胶的粘黏性。由(b)图可知，随着DTRT体积的增加，测定亚硝酸盐的显色所需时间不断降低，在10mL时后趋于稳定，表明10mL的DTRT基本可以将亚硝酸盐反应完全。由(c)图可知，测定低、中浓度的亚硝酸盐灰度值先增加后降低，均在DTRT 体积为10mL时最高，在DTRT体积6～12mL之间测定的高浓度亚硝酸盐灰度值较高且没有显著性差异。因此，选择DTRT的体积为10mL。
3.6加热时间对凝胶剂硬度及检测效果的影响
加热时间对凝胶的硬度、显色所需时间、灰度的影响如图3-4(a)、(b)、(c)所示。随着加热时间的增加，由(a)图可知，凝胶硬度先升高后降低，在15min时最大，可能是适当增加加热时间，有利于PGA溶解，但加热时间超过15min，水分损失较高，加入的DTRT酸性较高，对凝胶成型影响较大。由(b)图可知，显色所需时间先降低后增加，在15min达到最低。当加热时间大于15min时，测定中高浓度亚硝酸盐所需时间变化较小，测定低浓度亚硝酸盐显色所需时间在25min后受影响较大。由(c)图可知，灰度先增加后降低，且均在加热时间为15min时最高，，可能是加热时间越长，水分损失越大，导致溶剂百分含量降低，不利于亚硝酸盐的快速测定。因此，选择加热时间为15min。
3.7凝胶剂的最优配方
根据2.1～2.3的结果表明，在保证凝胶剂成型良好的情况下，低浓度亚硝酸盐检测效果受凝胶剂型影响较大，因此，为降低显色所需时间，增加灰度值，以测定1μg/mL的亚硝酸盐为基准。结果由表3和图3-5所示。由表3中极差R的大小可知，影响凝胶剂界面显色灰度值和显色所需时间的因素主次顺序分别为A>D>C>B和A＝C>B＝D，表明PGA 的质量对凝胶剂的准确度和灵敏度影响最大，加热时间的影响力大于水的体积。由于亚硝酸盐是否反应完全主要取决于DTRT的用量，因此综合平衡各因素的主次顺序为A>D>C> B。由均值k可知，颜色灰度和显色所需时间的最优组合分别为A2B2C1D3和A2B1C3D1，但由图6中(a)、6(b)图的A、B、C、D四个因素对两个指标的影响情况可见，各因素对灰度值的影响远大于对时间的影响，因此，综合平衡凝胶剂型的最优组合为A2B2C1D3，即： PGA的质量为0.25g、水体积为15mL、加热时间为12min、DTRT体积为11mL。以此最优组合进行验证试验，结果灰度值为39.21±0.36％，显色所需时间为23±3s，表明试验结果可靠，该最优组合可用于后期试验。
表3凝胶剂型正交试验结果
3.8凝胶剂的表征
8.1 FTIR试验结果
由图3-6可知，PGA凝胶中的特征吸收峰：-OH、C＝O、C-O-C、C-O分别出现在3350.9、1644.3、1151、1026.3cm-1处。加入DTRT和亚硝酸盐后，发生了明显的位移和峰强的变化，-OH和C-O的峰强减弱，C＝O的峰强增大，C-O-C的峰形由肩峰转为尖峰，可能是由于PGA的结构发生了键角变化。值得注意的是，在1300～4000cm-1官能团区具有特征峰的消失及新的特征峰形成现象，PGA凝胶中1247.8cm-1处的C-O-C的伸缩振动峰消失，而加入 DTRT后在1597.2cm-1处出现NH的变形振动峰，可能是由于C＝O相邻的C-O断裂，PGA与 DTRT以酰胺键连接。此外，测定亚硝酸盐后的凝胶剂在2497.9cm-1处形成了N≡N特征吸收峰，而酰胺键中NH的特征吸收峰消失，表明DTRT与亚硝酸盐发生了重氮化反应，符合比色测定原理。
SEM试验结果
PGA凝胶、PGA凝胶剂、测定亚硝酸盐后凝胶剂的SEM图如图3-7所示。由图3-7(a)可知，PGA凝胶的微观结构呈不规则的交联状，交联处均呈现褶皱纹路，类似PGA的椅式结构，可能是通过非共价相互作用，如π-π堆积、氢键、偶极-偶极相互作用等，通过高度定向的组合，转化为三维聚集体。由图3-7(b)可知加入DTRT后，微观结构类似钟乳石的簇状结构，这种立体空间结构既增加了PGA凝胶的塑性，也增大了亚硝酸盐与PGA凝胶剂反应的表面积，从而有利于提高PGA凝胶剂的灵敏度和稳定性。由图3-7(c)可知，测定亚硝酸盐后，PGA凝胶剂的钟乳石簇状结构消失，但仍然保留骨架结构，可能与酰胺键消失有关。
3.9凝胶剂形成及测定亚硝酸盐的机理
依据凝胶剂的SEM和FTIR试验结果，推理PGA凝胶剂的形成机理及其测定亚硝酸盐的反应机理，结果由如下反应式所示。由(a)可知，PGA与对氨基苯乙酮以酰胺键连接，促进凝胶剂形成钟乳石簇状结构。由(b)可知，凝胶剂测定亚硝酸盐时，在三乙胺盐酸盐催化作用及酸性条件下形成重氮化合物，重氮化合物再结合盐酸萘乙二胺形成紫红色的偶氮物。
PGA凝胶剂的形成机理，(b)测定亚硝酸盐的反应机理
小结
本章基于PGA凝胶界面从无色变成紫红色的比色原理，首次将PGA凝胶应用于亚硝酸盐的快速定性和半定量测定。采用正交试验优化了凝胶型亚硝酸检测剂的配方，结果表明， PGA的质量为0.25g、水体积为15mL、加热时间为12min、DTRT体积为11mL时，测定1 μg/mL的亚硝酸盐，灰度和时间结果分别为40.8±0.374％和12.6±0.40s。FTIR和SEM试验结果表明，PGA与DTRT以酰胺键结合形成具有类似钟乳石簇状立体结构的凝胶剂，增大了界面反应面积，为亚硝酸盐的快速测定提供了有利条件，从而提升了测定过程中的灵敏度。
凝胶型检测剂稳定性研究
亚硝酸盐的快速测定不仅要求在短时间完成检测，还要求能够克服检测对象其他成分的干扰或屏蔽作用，具有良好的检测性能和稳定性。因此，本章以UV-Vis法作对照，研究凝胶型的亚硝酸盐快速检测剂的灵敏性、选择性、抗干扰能力等方面的检测性能和在不同温度下的储存稳定性，从而为这种剂型的亚硝酸盐快速检测剂的实际应用提供理论基础。
凝胶型检测剂的检测性能研究
4.1灵敏度
以灰度值为指标，使用PGA凝胶剂测定0～40μg/mL的亚硝酸盐标准溶液，反应一段时间后，用相机记录颜色，再利用Photoshop CS2吸取界面颜色，转换为灰度模式，绘制灰度与亚硝酸盐含量的变化关系图，研究凝胶剂的检出限和线性范围，并制作标准比色卡。
4.2选择性
为了研究凝胶型亚硝酸盐快速检测剂是否存在假阳性的情况，吸取浓度为NO2 -(5μg/mL)的10倍或100倍的Cl-、NO3-、CO3 2-、PO4 2-、SO3 2-、SO4 2-、HSO3 -、CH2COO-、 Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+的离子溶液0.1mL于凝胶检测剂界面，观察是否显色。
4.3抗干扰能力
为了将凝胶型亚硝酸盐快速检测剂应用于发酵蔬菜样品中，以测定5μg/mL亚硝酸盐显色后的灰度为指标，选择17种物质(苯甲酸钠、安赛蜜、脱氢乙酸钠、山梨酸钾、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、D-异抗坏血酸钠、柠檬酸钠、EDTA-2Na)，以浓度为NO2 -浓度(5μg/mL)的1000倍为最高限，进行干扰试验。
4.4重现性
为了研究凝胶型检测剂测定亚硝酸盐的重现性，采用10组不同批次的液剂型亚硝酸盐快速检测剂的6个平行样，以测定5μg/mL的亚硝酸盐的灰度，通过计算相对标准偏差(RSD％)，评价其重现性。
4.2.4凝胶型检测剂保护剂的研究
PGA凝胶水分含量高，且为一种食品添加剂，容易受到污染，因此，为了达到延长PGA 凝胶剂的储藏期、增加稳定性的目的，研究保护剂对凝胶剂储存稳定性的影响。
4.2.4.1保护剂的种类
以未添加保护剂为对照组，研究凝胶剂中分别含0.1％的具有增强凝胶粘度的聚乙烯吡咯烷酮(K-30PVP)、聚乙二醇6000(PEG 6000)、聚乙烯醇(PVA)和具有防腐作用的脱氢乙酸钠、双乙酸钠、钼酸钠作为单一保护剂时，对测定亚硝酸盐的吸光值以及凝胶硬度的影响，并选择对测定亚硝酸盐没有影响的试剂作保护剂。
4.2.4.2保护剂的百分含量
根据4.2.4.1选出的保护剂，研究保护剂的百分含量为0.03％、0.05％、0.07％、0.1％、 0.15％、0.2％时，对测定亚硝酸盐的吸光值以及凝胶硬度的影响。
4.2.4.3保护剂的复配
将单一保护剂按4.2.4.2的百分含量进行复配，研究保护剂复配对吸光值和凝胶硬度的影响。
4.2.5凝胶型检测剂储存稳定性的研究
为研究时间和温度对凝胶型亚硝酸盐快速检测剂储存稳定性的影响，以凝胶剂的形态正常率(无明显流动或变色)，以及测定5μg/mL亚硝酸盐显色后的颜色灰度为指标，考察对照组和含保护剂的凝胶剂随时间延长，在常温避光和4℃避光条件下的存储稳定性。
凝胶型检测剂的检测性能
4.3.6.1灵敏度
使用PGA凝胶剂测定了0～40μg/mL的亚硝酸盐标准溶液，显色结果如图3-8(a)所示，凝胶剂界面紫红色呈梯度现象。由图3-8(b)可知，界面反应显色4min后，灰度没有显著性变化，表明PGA凝胶剂在5min内可以完成亚硝酸盐的测定。由图3-8(c)中的亚硝酸盐含量与灰度的曲线关系可知，在0.3～9μg/mL之间，凝胶剂具有良好的线性检测范围，R2为0.9924，计算出检出限为3mg/kg。标准比色卡如图3-8(d)所示，样品中亚硝酸盐含量等于比色卡颜色对应值乘以10。
4.3.6.2选择性、抗干扰能力和重现性
凝胶比色管的选择性、抗干扰能力和重现性分别如图4-1(a)、(b)、(c)图所示。在±5％的相对误差内，由图4-1(a)可知，Cl-、NO3 -、CO3 2-、PO4 2-、SO3 2-、SO4 2-、HSO3 -、CH2COO-、Zn2 +、Mg2+、Ca2+、Fe2+的浓度为NO2-的100倍情况下，均未出现假阳性。由图4-1(b)可知，干扰物存在的情况下测定亚硝酸盐，PGA凝胶比色管可以抗400倍半胱氨酸和100倍D- 异抗坏血酸钠的干扰，其他干扰物质浓度为亚硝酸盐浓度的1000倍时均无显著性干扰，表明凝胶比色管具有较高的特异选择性和的抗干扰能力，几乎不会有假阴性结果。由图4-1 (c)可知，采用10个不同批次及同一批次中的6个平行样测定5μg/mL的亚硝酸盐，检测结果的RSD％为3.06％，表现出良好的重现性，表明液剂型亚硝酸盐检测剂在实际检测中具较好的使用价值。
4.3.7凝胶型检测剂的保护剂种类
由图4-2(a)和(b)可知，K-30PVP、双乙酸钠、钼酸钠3者与对照组相比，在测定亚硝酸盐的吸光值以及凝胶硬度两方面都没有显著性差异，而PEG 6000、PVA、脱氢乙酸钠均使得吸光值和凝胶硬度显著降低，表明前3者适合作为PGA凝胶剂的保护剂研究。
4.3.8凝胶型检测剂的保护剂含量
由图4-3(a)可知，当K-30PVP、双乙酸钠、钼酸钠的百分含量分别超过0.05％、0.03％、0.0.3％后，吸光值开始不断下降，可能是K-30PVP较高时，降低了UV-Vis测定亚硝酸盐时的透光率，而双乙酸钠和钼酸钠含量的增加，改变了反应pH，从而使得吸光值降低。由图4-3(b)可知，凝胶剂的硬度随K-30PVP的百分含量增加而不断提高，而随着双乙酸钠和钼酸钠的百分含量增加不断降低，主要是因为K-30PVP具有增溶和促凝聚作用，双乙酸钠和钼酸钠会降低体系pH，不利于亚硝酸盐的测定和凝胶成型。因此，选择三者的最佳百分含量分别为0.05％、0.03％、0.03％，并将该含量下的三者进行了复配研究。
4.3.9凝胶型检测剂的保护剂复配
K-30PVP、双乙酸钠、钼酸钠的4种复配研究结果由图4-4(a)和(b)所示。0.05％的K- 30PVP和0.03％的双乙酸钠组合，0.05％的K-30PVP和0.03％的钼酸钠组合，均与不添加保护剂的对照组的试验结果无显著性差异，而0.03％的双乙酸钠和0.03％的钼酸钠组合，0.05％的K-30PVP、0.03％的双乙酸钠、0.03％的钼酸钠组合使得吸光值和凝胶剂硬度明显降低。因此选择前2种组合的复合保护剂作PGA凝胶剂的储存稳定性研究。
4.3.10凝胶型检测剂的储存稳定性
将选出的3种单一保护剂和2组复合保护剂与对照组作储存稳定性比较，结果分别如图 4-10所示。由图4-5(a)和(b)可知，PGA凝胶剂中含有0.05％的K-30PVP时，在4℃避光和常温避光下保存150天后，正常率仍有90％，而其他组均随时间的延长不断降低。由图4-5(c)可知，含单一保护剂的PGA凝胶剂在4℃避光条件下存放150天后，灰度变化仅在2％以内，与对照组相似。而含复合保护剂的灰度却随着时间延长不断降低。由图4-5(d)可知，在常温避光条件下，灰度随时间不断降低。表明含有0.05％的K-30PVP的PGA凝胶剂储存稳定性最好，在4℃避光条件下可保存150d以上。与其他研究报道的凝胶类检测剂的各项参数相比(表4-3)，本法以PGA凝胶提供反应界面具有一定的新颖之处，灵敏度至少是大部分研究结果灵敏度的2倍。储存稳定性远远超过大部分同类型的研究结果，因此，凝胶型检测剂可以为亚硝酸盐的快速比色检测提供新途径。
表4-3 PGA凝胶剂与相似方法的性能比较
4.4小结
本章以UV-Vis法为对照，研究凝胶型亚硝酸盐快速检测剂的检测性能和储存稳定性，结果表明：凝胶型的亚硝酸盐检测剂与UV-Vis法相同，对防腐剂、甜味剂、有机酸均有较高的抗干扰能力、高度的专一选择性和良好的重现性。
凝胶型检测剂测的灵敏度是大部分研究结果的2倍，检测时间5min即可完成，线性检测范围为0.3～9μg/mL(即3-90mg/kg)，检出限为3mg/kg；使用0.05％的K-30PVP作保护剂，可在4℃避光下保存150天以上，远远超过大部分同类型的研究结果。因此，凝胶型检测剂可以为亚硝酸盐的可视化检测提供新途径。
凝胶型检测剂应用于腌渍蔬菜
凝胶型亚硝酸盐快速检测剂具有高度的专一选择性，对腌渍蔬菜中常见的食品添加剂、氨基酸、有机酸等成分具有良好的抗干扰能力。为了研究凝胶型亚硝酸盐快速检测剂在实际发酵蔬菜样品中的应用效果，以UV-Vis分光光度法的检测结果为对照，测定15种腌渍蔬菜中亚硝酸盐的含量，并根据显著性差异分析以评价本方法的的实用性和准确度。
5.1试验材料与设备
5.1.1试验材料
腌渍蔬菜样品分别购自宜宾市的绿源超市、喜玛特超市、万家福超市，恒旭银座农贸市场、七星农贸市场、龙顺邻里中心农贸市场。样品种类及编号如表5-1所示。
表5-1样品种类及编号
5.2试验方法
5.2.1样品中亚硝酸盐的提取
5.2.1.1硼砂提取法
将腌渍蔬菜样品剪碎，准确称取5.0g于研钵中，加12.5mL的饱和硼砂溶液研磨成匀浆，按UV-Vis法提取亚硝酸盐。滤液用于UV-Vis法和液剂型检测剂测定亚硝酸盐。
5.2.1.2蒸馏水浸提法
将腌渍蔬菜样品剪碎，准确称取1.0g于10mL的EP管中，补水于刻度，摇匀后静置 5～10min，用滤纸吸出上层油脂，上清液用于凝胶剂检测亚硝酸盐。
5.2.2样品中亚硝酸盐的测定
UV-Vis法
取5.2.1.1制备的样品滤液40.0mL于50mL带塞比色管中，按UV-Vis法测定亚硝酸盐并绘制标准曲线。
凝胶型检测剂
吸取5.2.1.2制备的样品提取液0.1mL于凝胶剂界面，5min后于标准比色卡比对，亚硝酸盐含量为对应数值乘以10。
5.2.3回收率和精密度测定
检测方法的准确度通常以回收率表示，回收率越高则表明该检测方法准确性越高，首先，测定样品中亚硝酸盐的含量，然后根据测得的含量，于待测液中加入已知量的亚硝酸盐，再次测定亚硝酸盐含量，以(5-1)式计算回收率。精密度代表试验方法的再现性，以重复测定5次的结果相对标准偏差(RSD％)表示，由(5-1)计算。
式中：m2代表添加已知量的亚硝酸盐后测得值，m1代表测得样品中亚硝酸盐的量，m0代表添加已知量的亚硝酸盐。
5.3.2 UV-Vis分光光度法的测定结果
由表5-2可知，15种腌渍蔬菜样品中，亚硝酸盐含量具有显著差异，其中亚硝酸盐含量属于低风险范围(1～5mg/kg)的有9种，属于一般风险(5～20mg/kg)的有5种，属于高风险的只有1种，其含量超过我国20mg/kg的限量标准，表明这15种腌渍蔬菜中仅有酸菜中的亚硝酸盐含量超标。根据UV-Vis法测得亚硝酸盐含量的结果，设定加标量为1、5、 10μg，计算出回收率在80～105％之间，高于80％，RSD％在0.11～3.26％之间，小于5％，表明 UV-Vis法测定发酵蔬菜中的亚硝酸盐具有良好精密度，测定结果准确可靠。
表5-2 UV-Vis法测定结果
5.3.6凝胶型检测剂的测定结果
由表5-6可知，凝胶型检测剂的检测结果中，属于低风险的样品有8种，属于一般风险的样品有3种，属于高风险的1种，仍为酸菜。其中Y5、Y10、Y15这3种样品中的亚硝酸盐未检出，主要是因为凝胶型检测剂的检出限为3mg/kg，但这对属于低风险的腌渍蔬菜的安全品质评价不会产生影响。根据检测结果设定加标量为0.5、1、1.5μg，计算出Y6、 Y8、Y14这3种样品在加标量为1.5μg时，回收率低于80％，主要是因为这3种样品中的亚硝酸盐含量相对于其他样品偏高。在待测液中加入1.5μg标准亚硝酸盐后，亚硝酸盐含量超过20mg/kg，其数值在凝胶型检测剂标准比色卡的大范围区间，因而检出结果不精确，但不影响对亚硝酸盐的快速定性和半定量。除此之外，计算出回收率在80～150％之间， RSD％在0～2.89％之间，小于5％，表明凝胶型检测剂的测定结果精密度良好，测定结果可靠，可用于现场规模性地对腌渍蔬菜中的亚硝酸盐含量快速进行初筛分类，节约时间和成本，具有一定的实际应用价值。
表5-6凝胶型检测剂的测定结果
5.3.7显著性差异分析
以UV-Vis法为对照，对凝胶剂型亚硝酸盐检测剂测得的样品亚硝酸盐含量进行显著性差异分析。结果如表5-7所示，凝胶剂测定的结果呈现显著性差异，可能是由于UV-Vis法是使用仪器精确定量，而可视化比色法不能精确定量。因此，表明凝胶型检测剂更适用于腌渍蔬菜中亚硝酸盐的快速定性和半定量，有助于现场实时的对样品进行初筛。
表5-7凝胶型检测剂测定样品结果与UV-Vis法的显著性差异分析
注：每个样品对应的“1,2,3”等阿拉伯数字代表alpha＝0.05的子集。不同的小写字母表示具有显著性差异。
以上实施案例仅用于说明本专利的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施案例对本专利进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施案例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本专利各实施案例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种对亚硝酸盐快速定性和半定量测定的凝胶型检测剂，其特征在于：该凝胶型检测剂包括凝胶载体和检测剂；所述的凝胶载体为海藻酸丙二醇酯，所述的检测剂为对氨基苯乙酮，盐酸萘乙二铵，苹果酸，三乙胺盐酸盐的混合物。
2.如权利要求1所述对亚硝酸盐快速定性和半定量测定的凝胶型检测剂，其特征在于：凝胶载体的质量g和检测剂的体积mL的比例关系为0.2-0.5:10-12；检测剂中对氨基苯乙酮与盐酸萘乙二铵的体积比为3:1-5:1，三乙胺盐酸盐在检测剂中的含量为8-12％，苹果酸的浓度为0.5-0.7mol/L。
3.利用如权利要求1或权利要求2所述的凝胶型检测剂制备凝胶比色管的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)按比例称取各凝胶型检测剂的原料；
2)将海藻酸丙二醇酯放于烧杯中，加入水后加热边搅拌至海藻酸丙二醇酯溶解完全；
3)将步骤2)中溶解后的溶液趁热加入检测剂，搅拌均匀后立即分装至1.5mL的EP管中，当温度降至常温，凝胶定型后密封保存，得到凝胶比色管。
4.利用如权利要求3所述方法得到的凝胶比色管对亚硝酸盐进行快速定性和半定量检测的方法，其特征在于：该检测方法基于比色原理，以凝胶比色管和界面反应形式对亚硝酸盐进行快速定性和半定量检测。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于包括以下具体步骤：
向含1mL凝胶剂的凝胶比色管中加入0.1mL亚硝酸盐溶液，待凝胶剂界面由无色变为紫红色，一段时间后，用相机记录颜色，再利用Photoshop CS2吸取界面颜色，制作标准比色卡，将亚硝酸盐显色结果与比色卡上对应的数值比对即可快速定性和半定量转换为灰度模式，将颜色的深浅进行量化，根据灰度与亚硝酸盐含量的关系曲线即可对亚硝酸盐定量。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于：海藻酸丙二醇酯的质量g与检测剂的体积mL的比例关系为0.25:11；水的添加量为15mL。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于：加热时间为12min。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于：该方法的灰度值为39.21±0.36％。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于：显色所需时间为23±3s。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于：检测时间为5min，适用于亚硝酸盐的快速定性和半定量。
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