CN113670902A - 一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及亚硝酸盐检测技术领域，具体为一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂及其检测方法。该方法以GB法为基础，基于紫外可见分光光度计进行检测；以有机酸代替GB法中浓盐酸作酸性介质，以磺胺、对氨基苯磺酸或对氨基苯乙酮为重氮试剂。与GB相比，丁二酸、苹果酸、酒石酸可以有效代替浓盐酸作酸性介质，提高了安全性；重氮‑偶合试剂混合使用可以代替GB法中的两步反应；12％的三乙胺盐酸盐可以作为DT组的催化剂；DS组、DT组、HA组测定亚硝酸盐的时间分别需要15、5、6min，比GB法的20min节约了5～15min，提高了亚硝酸盐的检测效率。表明DT组和HA组的效率比DS组更快，可以作为快速定量测定亚硝酸盐的液剂型检测剂。
Description
技术领域
本发明涉及亚硝酸盐检测技术领域，具体为一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂及其检测方法。
背景技术
亚硝酸盐主要指亚硝酸钠，外观及滋味都与食盐相似。微量的亚硝酸盐在预防急性胃溃疡、抑制氧化应激造成的心血管疾病、减少红细胞溶血、抑制红细胞粘附等生理功能有潜在的医疗作用。但亚硝酸盐含量超标则对人类有害，若人体积累亚硝酸盐过高，具有引发急性肾损伤继发性甲状旁腺功能亢进、高铁血红蛋白症、形成致癌亚硝胺，以及可能患Ⅰ型糖尿病的风险。现有临床研究表明，亚硝撒盐对孕妇和婴儿的影响非常严重，摄入过多的亚硝酸盐可能导致宫内生长受限、自然流产、出生缺陷、甚至“蓝婴综合症”等。当人体摄入0.2～0.5 g的亚硝酸时就会引起中毒，超过3g将会致死。
腌渍蔬菜是新鲜蔬菜经过洗净、挑选、除杂等预处理后，通过泡制、腌制或者酱制过程，在微生物的作用下形成的富含多种营养成分的蔬菜制品，具有增进食欲、促进肠道消化和增强肠胃蠕动、风味独特、便于贮藏等特点，主要分为非发酵型和发酵型两类。非发酵型含盐量较高，因而储存时间较长，包括盐渍品、酱腌菜、糖醋制品、酒糟制品4类，如咸菜、什锦酱菜、糖醋黄瓜、糟白菜等。发酵型含盐量较低，主要是通乳酸菌、酵母菌等微生物菌群的发酵作用制作而成，主要包括半干态发酵和湿态发酵2类，如榨菜和泡菜。
由于家庭和部分小作坊腌渍蔬菜主要采用传统的自然发酵法制作，亚硝酸盐含量存在积累超标的隐患，因此，对腌渍蔬菜亚硝酸盐含量进行检测非常有必要。
目前，对亚硝酸盐含量检测的方法包括紫外可见分光光度法(简称GB法)和快速检测试剂盒，这两种是企业或消费者常用的亚硝酸盐定量和半定量检测方法。但GB法存在设备昂贵、浓盐酸危害大、检测时间长等不足，快速检测试剂盒存在假阳性或假阴性的缺点。
腌制蔬菜中的色素、防腐剂、抗氧化物质以及部分有机酸等，容易对亚硝酸酸盐的快速检测形成干扰和屏蔽作用。因此，检测剂配方是亚硝酸盐快速检测中的一个难点问题，它决定了亚硝酸盐检测的灵敏度、准确度、检测限。
因此，还需要对腌渍蔬菜中亚硝酸盐的快速定量和快速半定量进行进一步研究。
发明内容
本发明正是针对以上技术问题，提供一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂及其检测方法。该检测方法中采用了一种基于紫外可见分光光度计快速定量测定亚硝酸盐的检测剂，采用其测定亚硝酸盐可比GB法(20min)缩短了5-15min，提高了亚硝酸盐检测的安全性和效率，具有良好的抗干扰能力和高度的专一选择性。
为了实现以上发明目的，本发明的具体技术方案如下：
一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂，该检测剂包括重氮试剂、偶合试剂和酸性介质；所述重氮试剂为对氨基苯磺酸，偶合试剂为盐酸萘乙二胺溶液，酸性介质为丁二酸；其中重氮试剂与偶合试剂的体积比为3-5:1，酸性介质的浓度为0.2-0.4mol/L。
一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂，该检测剂包括重氮试剂、偶合试剂和酸性介质；所述重氮试剂为对氨基苯乙酮，偶合试剂为盐酸萘乙二胺溶液，酸性介质为苹果酸；其中重氮试剂与偶合试剂的体积比为1-3:1，酸性介质的浓度为0.4-0.6mol/L。作为优选，该检测剂还包括催化剂，该催化剂为三乙胺盐酸盐，三乙胺盐酸盐在检测剂中的质量含量为8-12％。
一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂，该检测剂包括重氮试剂、偶合试剂和酸性介质；重氮试剂为磺胺，偶合试剂为盐酸萘乙二胺溶液，酸性介质为酒石酸；其中重氮试剂与偶合试剂的体积比为2-4:1，酸性介质的浓度为0.4-0.6mol/L。
一种快速定量测定亚硝酸盐的检测方法，该方法以GB法为基础，基于紫外可见分光光度计进行检测；以有机酸代替GB法中浓盐酸作酸性介质，以磺胺、对氨基苯磺酸或对氨基苯乙酮为重氮试剂。
作为本申请中一种较好的实施方式，所述的有机酸为丁二酸、苹果酸或酒石酸。
作为本申请中一种较好的实施方式，一种快速定量测定亚硝酸盐的检测方法，该方法基于GB 5009.33-2016进行检测，其用丁二酸替代浓盐酸，丁二酸的浓度为0.4mol/L，对氨基苯磺酸质量浓度9g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.1g/L，重氮化合物与偶合试剂的体积比为 4:1，(此为DS组)。该方法测定亚硝酸盐的时间为15min。
作为本申请中一种较好的实施方式，一种快速定量测定亚硝酸盐的检测方法，该方法基于GB 5009.33-2016进行检测，其用苹果酸替代浓盐酸，苹果酸的浓度为0.6mol/L，对氨基苯乙酮质量浓度7g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4g/L，重氮化合物与偶合试剂的体积比为3:1，(此为DT组)。该方法测定亚硝酸盐的时间为5-15min。更进一步优选，在该方法中，以三乙胺盐酸盐为催化剂，三乙胺盐酸盐的质量百分含量为0-12％。优选三乙胺盐酸盐的质量百分含量为12％时，该方法测定亚硝酸盐的时间为5min。
作为本申请中一种较好的实施方式，一种快速定量测定亚硝酸盐的检测方法，该方法基于GB 5009.33-2016进行检测，其用酒石酸替代浓盐酸，酒石酸的浓度为0.6mol/L，磺胺质量浓度9g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4g/L，重氮化合物与偶合试剂的体积比为4:1，(此为HA组)。该方法测定亚硝酸盐的时间为6min。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(一)、该方法测定亚硝酸盐分别比GB法(20min)缩短了5-15min，提高了亚硝酸盐检测的安全性和效率。
(二)、该方法基于UV-Vis测定亚硝酸盐，具有良好的抗干扰能力和高度的专一选择性， DS组、HA组、DT组的检测线性范围分别为0.05～15、0.1～15、0.05～17μg，检出限分别为 0.54、0.37、0.45mg/kg。
(三)、在4℃避光条件下，DS组可以稳定储存30d，HA组可稳定储存90d，DT组可稳定储存120d。
(四)、实际应用效果上，以GB法的检测结果为对照，测定15种腌渍蔬菜中亚硝酸盐的含量，使用SPSS对结果进行显著性差异分析。结果表明：DS组、HA组、DT组的测定结果分别有11种、14种、12种样品中亚硝酸盐含量与GB法无显著性差异，表明液剂型检测剂具有良好的应用效果。
附图说明
图1为试验中DS组、DT组、HA组的亚硝酸盐检测波长曲线图
图2-1试验中为DS组(a)、DT组(b)、HA组(c)的酸性介质及其浓度对亚硝酸盐吸光值的影响示意图
图2-2为试验中重氮试剂质量浓度对亚硝酸盐吸光值的影响示意图
图2-3为试验中盐酸萘乙二胺浓度对亚硝酸盐吸光值的影响曲线图
图2-4为试验中重氮-偶合试剂体积比对亚硝酸盐吸光值的影响曲线图
图2-5为试验中反应时间对亚硝酸盐吸光值的影响曲线图
图2-6为试验中不同催化剂对反应时间的影响曲线图
图2-7为试验中三乙胺盐酸盐百分含量对DT组反应时间的影响曲线图
图3-1为DS组(A)、HA组(B)、DT组(C)的检测范围和线性范围
图3-2为UV-Vis法(a)、DS组(b)、HA组(c)、DT组(d)的选择性的结果图
图3-3为UV-Vis法、DS组、HA组、DT组的重现性结果图
图3-4为HA组(a)和DT组(b)的储存稳定性结果图
图4为UV-Vis法(a)、DS组(b)、HA组(c)、DT组(d)的标准曲线图
具体实施方式
一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂，该检测剂包括重氮试剂、偶合试剂和酸性介质；所述重氮试剂为对氨基苯磺酸，偶合试剂为盐酸萘乙二胺溶液，酸性介质为丁二酸；其中重氮试剂与偶合试剂的体积比为3-5:1，酸性介质的浓度为0.2-0.4mol/L。
一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂，该检测剂包括重氮试剂、偶合试剂和酸性介质；所述重氮试剂为对氨基苯乙酮，偶合试剂为盐酸萘乙二胺溶液，酸性介质为苹果酸；其中重氮试剂与偶合试剂的体积比为1-3:1，酸性介质的浓度为0.4-0.6mol/L。作为优选，该检测剂还包括催化剂，该催化剂为三乙胺盐酸盐，三乙胺盐酸盐在检测剂中的质量含量为8-12％。
一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂，该检测剂包括重氮试剂、偶合试剂和酸性介质；重氮试剂为磺胺，偶合试剂为盐酸萘乙二胺溶液，酸性介质为酒石酸；其中重氮试剂与偶合试剂的体积比为2-4:1，酸性介质的浓度为0.4-0.6mol/L。
一种快速定量测定亚硝酸盐的检测方法，该方法以GB法为基础，基于紫外可见分光光度计进行检测；以有机酸代替GB法中浓盐酸作酸性介质，以磺胺、对氨基苯磺酸或对氨基苯乙酮为重氮试剂。
作为优选，所述的有机酸为丁二酸、苹果酸或酒石酸。
作为优选，一种快速定量测定亚硝酸盐的检测方法，该方法基于GB 5009.33-2016进行检测，其用丁二酸替代浓盐酸，丁二酸的浓度为0.4mol/L，对氨基苯磺酸质量浓度9g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.1g/L，重氮化合物与偶合试剂的体积比为4:1，(此为DS组)。该方法测定亚硝酸盐的时间为15min。
作为优选，一种快速定量测定亚硝酸盐的检测方法，该方法基于GB 5009.33-2016进行检测，其用苹果酸替代浓盐酸，苹果酸的浓度为0.6mol/L，对氨基苯乙酮质量浓度7g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4g/L，重氮化合物与偶合试剂的体积比为3:1，(此为DT组)。该方法测定亚硝酸盐的时间为5-15min。更进一步优选，在该方法中，以三乙胺盐酸盐为催化剂，三乙胺盐酸盐的质量百分含量为0-12％。优选三乙胺盐酸盐的质量百分含量为12％时，该方法测定亚硝酸盐的时间为5min。
作为优选，一种快速定量测定亚硝酸盐的检测方法，该方法基于GB 5009.33-2016进行检测，其用酒石酸替代浓盐酸，酒石酸的浓度为0.6mol/L，磺胺质量浓度9g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4g/L，重氮化合物与偶合试剂的体积比为4:1，(此为HA组)。该方法测定亚硝酸盐的时间为6min。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种快速定量测定亚硝酸盐的检测方法，该方法基于GB 5009.33-2016进行检测，其用丁二酸替代浓盐酸，丁二酸的浓度为0.4mol/L，对氨基苯磺酸质量浓度9g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.1g/L，重氮化合物与偶合试剂的体积比为4:1，(此为DS组)。
实施例2：
一种快速定量测定亚硝酸盐的检测方法，该方法基于GB 5009.33-2016进行检测，其用苹果酸替代浓盐酸，苹果酸的浓度为0.6mol/L，对氨基苯乙酮质量浓度7g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4g/L，重氮化合物与偶合试剂的体积比为3:1，(此为DT组)。
实施例3：
一种快速定量测定亚硝酸盐的检测方法，该方法基于GB 5009.33-2016进行检测，其用酒石酸替代浓盐酸，酒石酸的浓度为0.6mol/L，磺胺质量浓度9g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4g/L，重氮化合物与偶合试剂的体积比为4:1，(此为HA组)。
实施例4:
与实施例2检测方法一致，区别仅在于，在该方法中，以三乙胺盐酸盐为催化剂，三乙胺盐酸盐的质量百分含量为12％。
下面通过试验论证实施例1-实施例4中所述检测方法的检测效果。
试验:
2主要试剂与设备
2.1.1主要试剂试验所需主要试剂见表2-1。
表2-1主要试验药品
2.1.2仪器设备试验所需主要仪器与设备见表2-2。
表2-2主要试验仪器
2.2试验方法
2.2.1亚硝酸盐的测定原理
样品经预处理后，在弱酸性条件下，亚硝酸盐与重氮试剂反应生成重氮化合物，再与盐酸萘乙二胺偶合形成紫红色物质，使用分光光度计在一定的波长处测定吸光值，通过外标法测得亚硝酸盐含量。本试验中省略部分均同GB 5009.33-2016中已知部分。
2.2.2亚硝酸盐测定波长的研究
取4g/L的重氮试剂1mL、2g/L的偶合试剂0.5mL于试管中，补水至4.5mL摇匀，加入1μg/mL的亚硝酸钠标准溶液0.5mL，摇匀后反应15min，在500～560nm处扫描。研究3种重氮试剂：对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮分别与盐酸萘乙二胺溶液混合形成的重氮-偶合试剂(简称DS组、HA组、DT组)测定亚硝酸盐的最大波长。
2.2.3亚硝酸盐检测条件的研究
2.2.3.1酸性介质及其浓度
设定重氮试剂的质量浓度为4g/L，盐酸萘乙二胺的质量浓度为2g/L，体积比为2:1，反应15min，研究苹果酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、丁二酸的浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7mol/L时对测定1μg/mL亚硝酸盐的吸光值影响，选择适合作为DS组、HA组、DT组的酸性介质及其浓度。
2.2.3.2重氮试剂质量浓度
设定盐酸萘乙二胺的质量浓度为2g/L，与重氮试剂的体积比为2:1，反应15min，DS组、DT组、HA组分别以0.3mol/L的丁二酸、0.5mol/L的苹果酸、0.5mol/L的酒石酸为酸性介质，研究重氮试剂的质量浓度分别为2、4、6、8、10、12g/L时对测定1μg/mL亚硝酸盐的吸光值影响。
2.2.3.3盐酸萘乙二胺质量浓度
设定对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮的质量浓度分别为10、8、6g/L，与盐酸萘乙二胺的体积比为2:1，反应15min，DS组、DT组、HA组分别以0.3mol/L的丁二酸、0.5mol/L的苹果酸、0.5mol/L的酒石酸为酸性介质，研究盐酸萘乙二胺的质量浓度分别为0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0g/L时对测定1μg/mL亚硝酸盐的吸光值影响。
2.3.4重氮-偶合试剂体积比
设定对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮的质量浓度分别为10、8、6g/L，反应15min， DS组、DT组、HA组分别以0.3mol/L的丁二酸、0.5mol/L的苹果酸、0.5mol/L的酒石酸为酸性介质，盐酸萘乙二胺的质量浓度分别为0.1、0.3、0.5g/L，研究重氮-偶合试剂体积比分别为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、1:2时对测定1μg/mL亚硝酸盐的吸光值影响。
2.2.3.5反应时间
设定对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮的质量浓度分别为10、8、6g/L，DS组、DT组、HA组分别以0.3mol/L的丁二酸、0.5mol/L的苹果酸、0.5mol/L的酒石酸为酸性介质，盐酸萘乙二胺的质量浓度分别为0.1、0.3、0.5g/L，重氮-偶合试剂体积比分别为4:1、 2:1、3:1，研究反应时间分别为3、6、9、12、15、18、21min时对测定1μg/mL亚硝酸盐的吸光值影响。
2.2.3.6催化剂的增敏作用
设定对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮的质量浓度分别为10、8、6g/L，DS组、DT组、HA组分别以0.3mol/L的丁二酸、0.5mol/L的苹果酸、0.5mol/L的酒石酸为酸性介质，盐酸萘乙二胺的质量浓度分别为0.1、0.3、0.5g/L，重氮-偶合试剂体积比分别为4:1、 2:1、3:1，测定1μg/mL亚硝酸盐的吸光值达到稳定所需要的时间，研究反应体系中分别含 2％的麦芽糊精、2％的β-环糊精，12％的溴化钾、4％的氯化钾、12％的碘化钾，8％的三乙胺盐酸盐对反应是否有增敏作用。
2.2.3.7三乙胺盐酸盐的百分含量
设定对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮的质量浓度分别为10、8、6g/L，DS组、DT组、HA组分别以0.3mol/L的丁二酸、0.5mol/L的苹果酸、0.5mol/L的酒石酸为酸性介质，盐酸萘乙二胺的质量浓度分别为0.1、0.3、0.5g/L，重氮-偶合试剂体积比分别为4:1、 2:1、3:1，分别研究DS组、DT组、HA组中的三乙胺盐酸盐含量为6、8、10、12、14、16％时，对反应的增敏作用。
2.2.4液剂型检测剂配方的优化
根据亚硝酸盐检测条件的研究结果，以吸光值为指标，采用4因素3水平的正交试验分别优化DS组、HA组、DT组检测剂的配方。正交试验因素水平设计见表2-3～2-5所示。
表2-3 DS组正交试验因素水平表
表2-4 HA组正交试验因素水平表
表2-5 DT组正交试验因素水平表
2.2.5数据处理与分析
采用SPSS 19.0软件进行正交试验设计和显著性差异分析；采用Origin 2018进行图表的绘制，每组试验设3次平行。
3结果与分析
2.3.1亚硝酸盐的检测波长
由图1可知，在520～560nm范围内，DS组和HA组的最大吸收波长均为540nm，DT组的最大吸收波长为550nm，因此选择DS组、DT组、HA组的亚硝酸盐测定波长分别为540、 550、540nm。
2.3.2酸性介质及其质量浓度对亚硝酸盐吸光值的影响
由于0.7mol/L的丁二酸配制3种重氮试剂时过饱和，因此在图2-1中无该浓度下的丁二酸对亚硝酸盐吸光值的影响。由图2-1可知，酸性介质的种类和浓度对亚硝酸盐的吸光值均有影响，可能是酸性介质的pKa和溶剂pH不同导致。当DS组、DT组、HA组分别以0.3mol/L的丁二酸、0.5mol/L的苹果酸、0.5mol/L的酒石酸为酸性介质时，亚硝酸盐的吸光值分别达到最大。因此，选择0.3mol/L的丁二酸、0.5mol/L的苹果酸和0.5mol/L酒石酸分别为 DS组、DT组、HA组的酸性介质。
2.3.3重氮试剂质量浓度对亚硝酸盐吸光值的影响
由图2-2可知，随着对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮质量浓度的升高，亚硝酸盐的吸光值先增加再趋于平稳，可能是重氮试剂在低质量浓度下，重氮化反应不完全，当亚硝酸盐消耗完全时，形成的重氮化合物含量不再增加，吸光值趋于平稳。对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮的质量浓度分别在10g/L后、8g/L后、6g/L后，亚硝酸盐的吸光值无显著性差异，因此选择对氨基苯磺酸、磺胺、对氨基苯乙酮的质量浓度分别为10g/L、8g/L、6 g/L。
2.3.4盐酸萘乙二胺质量浓度对亚硝酸盐吸光值的影响
由图2-3可知，随着盐酸萘乙二胺质量浓度的增加，DT组和HA组的亚硝酸盐的吸光值先升高后降低，DS组不断降低，可能由于重氮试剂的不同导致；当盐酸萘乙二胺的质量浓度过高时，溶液酸性增加，亚硝基在强酸条件下不稳定，导致颜色变浅，吸光值降低。DT组的吸光值在盐酸萘乙二胺的质量浓度为0.3～0.7g/L之间较高且无显著性差异；HA组在盐酸萘乙二胺质量浓度为0.5g/L时吸光值最大，因此，选择DS组、DT组、HA组的盐酸萘乙二胺质量浓度分别为0.1、0.3、0.5g/L。
2.3.5重氮-偶合试剂体积比对亚硝酸盐吸光值的影响
由图2-4可知，3组试剂的亚硝酸盐吸光值均随重氮-偶合试剂体积比的增加先增加后降低，可能是过高的重氮-偶合试剂体积比或当偶合试剂体积高于重氮试剂时，降低了反应摩尔消光系数。DS组和HA组的吸光值在重氮-偶合试剂体积比分别为4:1和3:1时最大；重氮- 偶合试剂体积比为2:1、3:1、4:1时，DT组的吸光值较高且无显著性差异，因此，选择DS 组、DT组、HA组的体积比分别为4:1、2:1、3:1。
2.3.6反应时间对亚硝酸盐吸光值的影响
由图2-5可知，DS组、DT组、HA组的吸光值均随反应时间的增加先升高后趋于稳定，DS组和DT组的吸光值均在反应15min后无显著性差异，HA组的吸光值在反应6min后无显著性变化，因此，选择DS组、DT组、HA组的反应时间分别为15、15、6min，较GB法规定的20min分别节省了5、5、14min，表明本试验方法有利于提高效率。
2.3.7催化剂对反应的增敏作用
由图2-6可知，2％的麦芽糊精、2％的β-环糊精、12％的溴化钾、4％的氯化钾、8％的三乙胺盐酸盐均对DS组和HA组测定亚硝酸盐没有增敏作用。DS组和HA组含12％的碘化钾时，反应时间增加，DT组没有显著变化，可能是亚硝根被碘离子还原，降低了亚硝酸盐的含量。只有8％的三乙胺盐酸盐具有增敏作用，降低了DT组的反应时间，可能由于三乙胺盐酸盐促进了电子传递速率。因此，选择三乙胺盐酸盐作为DT组的催化剂。
2.3.8三乙胺盐酸盐对DT组催化作用
根据2.3.7的试验结果，研究三乙胺盐酸盐的百分含量变化对DT组反应时间的影响，结果如图2-7所示。随着三乙胺盐酸盐的百分含量不断增加，DT组的反应时间先降低再趋于平衡。当三乙胺盐酸盐的百分含量达到12％后，反应时间没有显著性变化，可能是在催化剂作用下，5min内可以反应完全。与未添加三乙胺盐酸盐相比，反应时间降低了10min，表明 DT组中三乙胺盐酸盐的最适百分含量为12％。
2.3.9液剂型检测剂的最优配方
DS组、HA组、DT组的正交试验结果见表2-6～2-8。DS组、HA组、DT组的理论最优组合分别为A1B2C3D2、H3B1J3D3，T3B3P3D3；即DS组为：对氨基苯磺酸质量浓度9g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.1g/L、丁二酸浓度0.4mol/L、体积比4:1；HA组为：磺胺质量浓度9g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4g/L、酒石酸浓度0.6mol/L、体积比4:1；DT组为：对氨基苯乙酮质量浓度7g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4g/L、苹果酸浓度0.6mol/L、体积比3:1。在3组试剂的理论最优组合条件下进行验证试验，得出DS组、HA组、DT组的验证试验结果分别为0.072±0.005、0.070±0.002、0.073±0.006，均与各自的对照组无明显差异，表明 DS组、HA组、DT组的理论最优组合可靠。
表2-6 DS组正交试验结果
表2-7 HA组正交试验结果
表2-8 DT组正交试验结果
以上试验对DS组、DT组、HA组测定亚硝酸盐的条件进行了研究，采用正交试验优化了3 组液剂型亚硝酸盐快速检测剂的配方。结果表明，DS组的最优配方为：对氨基苯磺酸质量浓度9g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.1g/L、丁二酸浓度0.4mol/L、体积比4:1；HA的最优配方组为：磺胺质量浓度9g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4g/L、酒石酸浓度0.6mol/L、体积比4:1；DT的最优配方组为：对氨基苯乙酮质量浓度7g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4g/L、苹果酸浓度0.6mol/L、体积比3:1。与GB相比，丁二酸、苹果酸、酒石酸可以有效代替浓盐酸作酸性介质，提高了安全性；重氮-偶合试剂混合使用可以代替GB法中的两步反应；12％的三乙胺盐酸盐可以作为DT组的催化剂；DS组、DT组、HA组测定亚硝酸盐的时间分别需要15、5、6min，比GB法的20min节约了5～15min，提高了亚硝酸盐的检测效率。表明DT组和HA组的效率比DS组更快，可以作为快速定量测定亚硝酸盐的液剂型检测剂。
液剂型的检测性能和稳定性研究试验：
亚硝酸盐的快速测定不仅要求在短时间完成检测，还要求能够克服检测对象其他成分的干扰或屏蔽作用，具有良好的检测性能和稳定性。因此，本章以UV-Vis法作对照，研究液剂型的亚硝酸盐快速检测剂的灵敏性、选择性、抗干扰能力等方面的检测性能和在不同温度下的储存稳定性。
4.1主要试剂与设备
4.1.1主要试剂同2.1.1。
4.1.2仪器设备同2.1.2。
4.2试验方法
4.2.1液剂型检测剂的检测性能研究
4.2.1.1灵敏度
按照2.3.9的试验结果中，各组试剂的最优组合，测定系列梯度浓度的亚硝酸盐标准溶液的吸光值，研究DS组、HA组、DT组的检出限和线性范围，由(4-1)式计算检出限。
检出限＝3σ/k (4-1)
式中：σ为11次空白样检测值的标准偏差，k为线性方程的斜率。
4.2.1.2选择性
为了研究液剂型亚硝酸盐快速检测剂的测定结果是否存在假阳性情况，以测定浓度为NO2 - (5μg/mL)的10倍或100倍的Cl-、NO3-、CO3 2-、PO4 2-、SO3 2-、SO4 2-、HSO3 -、CH2COO-、Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+的吸光值为指标，从而评价其专一选择性。
4.2.1.3抗干扰能力
为了将液剂型亚硝酸盐快速检测剂应用于腌渍蔬菜样品中，需要排除样品中可能存在的干扰物质对测定结果的影响，避免假阴性的结果。以吸光值为指标，在相对误差为±5％以内，选择17种物质(苯甲酸钠、安赛蜜、脱氢乙酸钠、山梨酸钾、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、草酸、D-异抗坏血酸钠、柠檬酸钠、EDTA-2Na)，以浓度为NO2 -浓度(5μg/mL)的1000倍为最高限，进行干扰试验。
4.2.1.4重现性
为了研究DS组、HA组、DT组测定亚硝酸盐的重现性，采用10组不同批次的液剂型亚硝酸盐快速检测剂的6个平行样，测定1μg/mL的亚硝酸盐的吸光值，通过计算相对标准偏差(RSD％)，评价其重现性。
4.2.2液剂型检测剂储存稳定性的研究
为研究时间和温度对液剂型亚硝酸盐快速检测剂储存稳定性的影响，每10d测定常温、 4℃、30℃、40℃避光条件下1μg/mL亚硝酸盐的吸光值变化，探究其储存稳定性。
4.3结果与分析
4.3.1液剂型检测剂的灵敏度
DS组、HA组、DT组的检出限和线性范围分别如图3-1(a)、(b)、(c)所示。由图3-1可知， DS组、HA组、DT组的吸光值均随亚硝酸盐含量的增加而增大，当亚硝酸盐含量高于20μg时，吸光值增加平缓，表明亚硝酸盐含量过高时，应适当稀释后再进行测定。此外，由图3-1(a)、 (b)、(c)可知DS组、HA组、DT组线性范围分别为0.05～15μg、0.1～15μg、0.05～17μg。根据(4-1)式计算出DS组、HA组、DT组的检出限分别为0.54、0.37、0.45mg/kg。与UV-Vis 法规定的1mg/kg检出限相比，表明液剂型检测剂具有较高的灵敏度。
4.3.2液剂型检测剂的选择性
使用DS组、HA组、DT组检测剂测定了发酵蔬菜中可能含有的12种离子，浓度均为500 μg/mL，是对照组中亚硝酸根浓度(5μg/mL)的100倍。DS组、HA组、DT组的检测结果与UV-Vis法相似，测定Cl-、NO3 -、CO3 2-、PO4 2-、SO3 2-、SO4 2-、HSO3 -、CH2COO-、Zn2+、Mg2+、 Ca2+、Fe2+的结果均未超过亚硝酸盐相应吸光值的5％，基本不会有假阳性结果，表明液剂型亚硝酸盐快速检测剂具有较强的专一选择性。
4.3.3液剂型检测剂的抗干扰能力
在干扰物质存在的情况下，液剂型检测剂测定5μg/mL的亚硝酸盐，其抗干扰能力如表4-1 所示。在5％的相对误差内，D-异抗坏血酸钠和半胱氨酸对亚硝酸盐的测定有较大的干扰，可能是D-异抗坏血酸钠具有较强的抗氧化性，将NO2 -还原为NO，半胱氨酸含有的巯基与NO2 -反应生成巯代亚硝酸酯。与UV-Vis法相比，DS组、HA组、DT组分别可抗100、50、50μg/mL 的D-异抗坏血酸钠干扰，抗半胱氨酸浓度干扰的能力分别为50、250、250μg/mL，且几乎不受苯甲酸钠、山梨酸钾、安赛蜜、柠檬酸钠、谷氨酸、丙氨酸、草酸、苹果酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、脱氢乙酸钠、EDTA-2Na的干扰，表明DS组、HA组、DT组对腌渍蔬菜中的防腐剂、甜味剂、有机酸均有较高的抗干扰能力。
表4-1 UV-Vis法、DS组、HA组、DT组的抗干扰能力
4.3.4液剂型检测剂的重现性
使用DS组、HA组、DT组液剂型亚硝酸盐检测剂的不同批次及同一批次中的6个平行样测定1μg/mL的亚硝酸盐，检测结果如图3-3所示，DS组、HA组、DT组与UV-Vis法相似，均具有良好的重现性，RSD％均在5以内，UV-Vis法、DS组、HA组、DT组的RSD％分别为2.18％、
1.06％、1.37％、2.67％，表明液剂型亚硝酸盐检测剂在实际检测中具较好的运用价值。
4.3.5液剂型检测剂的储存稳定性
由于DS组检测时间需要15min，且抗干扰能力低于DT组和HA组，因此仅研究HA组和DT组在常温、4℃、30℃、40℃下的避光储存稳定性。由图3-4可知，随着储存时间的延长， HA组和DT组在不同温度下避光储存的稳定性均表现为：4℃>常温>30℃>40℃。由(a)图可知，HA组测定亚硝酸盐的吸光值随着储存时间延长不断降低，在4℃避光下储存90d后，测定亚硝酸盐的吸光值才明显下降，表明HA组在4℃避光储存稳定性最好，可达90d。由(b)图可知，DT组在常温和4℃避光条件下的储存稳定性明显高于30℃和40℃避光条件下，在常温和 4℃避光条件下储存120d左右，吸光值变化较小，表明DT组在常温和4℃避光条件下可稳定储存120d，储存稳定高于HA组。与其他研究报道的分光光度法相比(表4-2)，HA组和 DT组的检测时间更短，本方法的液剂型检测剂的检测性能良好，可以为腌渍蔬菜中的亚硝酸盐快速定量提供理论参考。
表4-2 DS组、HA组、DT组液剂型检测剂与相似方法的性能比较
注：“-”代表无此项参数。下同。
本试验以UV-Vis法为对照，研究了液剂型亚硝酸盐快速检测剂的检测性能和储存稳定性，结果表明：液剂型的亚硝酸盐检测剂与UV-Vis法相同，对防腐剂、甜味剂、有机酸均有较高的抗干扰能力、高度的专一选择性和良好的重现性。
DS组、HA组、DT组检测剂均具有良好灵敏度，检测线性范围分别为0.05～15μg、0.1～15 μg、0.05～17μg，检出限分别为0.54、0.37、0.45mg/kg，低于UV-Vis法1mg/kg的标准；其中HA组在4℃避光条件下稳定储存90d，DT组在常温和4℃避光条件下可以稳定储存120d。与其他研究报道的分光光度法相比，HA组和DT组的检测时间更短。
液剂型检测剂对腌渍蔬菜的应用：
液剂型快速检测剂具有高度的专一选择性，对腌渍蔬菜中常见的食品添加剂、氨基酸、有机酸等成分具有良好的抗干扰能力。为了研究液剂型亚硝酸盐快速检测剂在实际发酵蔬菜样品中的应用效果，以UV-Vis分光光度法的检测结果为对照，测定15种腌渍蔬菜中亚硝酸盐的含量，并根据显著性差异分析以评价本方法的实用性和准确度。
5.1试验材料与设备
5.1.1试验材料
腌渍蔬菜样品分别购自宜宾市的绿源超市、喜玛特超市、万家福超市，恒旭银座农贸市场、七星农贸市场、龙顺邻里中心农贸市场。样品种类及编号如表5-1所示。
表5-1样品种类及编号
5.2试验方法
5.2.1样品中亚硝酸盐的提取
5.2.1.1硼砂提取法
将腌渍蔬菜样品剪碎，准确称取5.0g于研钵中，加12.5mL的饱和硼砂溶液研磨成匀浆，按UV-Vis法提取亚硝酸盐。滤液用于UV-Vis法和液剂型检测剂测定亚硝酸盐。
5.2.1.2蒸馏水浸提法
将腌渍蔬菜样品剪碎，准确称取1.0g于10mL的EP管中，补水于刻度，摇匀后静置 5～10min，用滤纸吸出上层油脂，上清液用于凝胶剂检测亚硝酸盐。
5.2.2样品中亚硝酸盐的测定
5.2.2.1 UV-Vis法
取5.2.1.1制备的样品滤液40.0mL于50mL带塞比色管中，按UV-Vis法测定亚硝酸盐并绘制标准曲线。
5.2.2.2 DS组检测剂
取2.5mL检测剂于8支洁净的试管中，分别补水至5、4.98、4.96、4.94、4.92、4.9、4.8、 4.6mL，摇匀，分别加入5μg/mL的亚硝酸盐标准使用液0.0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、 0.2、0.4mL(相当于0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2μg)，摇匀静置反应15min，以零管调零，于波长540nm处测吸光度，绘制标准曲线。吸取5.2.1.1制备的样品滤液1mL测定亚硝酸盐含量。
5.2.2.3 HA组检测剂
按5.2.2.2的方法，取检测剂2.5mL，反应时间为6min，于540nm处测定亚硝酸盐含量。
5.2.2.4 DT组检测剂
按5.2.2.2的方法，取检测剂2.0mL，反应时间为5min，于550nm处测定亚硝酸盐含量。
5.2.2.5凝胶型检测剂
吸取5.2.1.2制备的样品提取液0.1mL于凝胶剂界面，5min后于标准比色卡比对，亚硝酸盐含量为对应数值乘以10。
5.2.3回收率和精密度测定
检测方法的准确度通常以回收率表示，回收率越高则表明该检测方法准确性越高。首先，测定样品中亚硝酸盐的含量，然后根据测得的含量，于待测液中加入已知量的亚硝酸盐，再次测定亚硝酸盐含量，以(5-1)式计算回收率。精密度代表试验方法的再现性，以重复测定 5次的结果相对标准偏差(RSD％)表示，由(5-1)计算。
式中：m2代表添加已知量的亚硝酸盐后测得值，m1代表测得样品中亚硝酸盐的量，m0代表添加已知量的亚硝酸盐。
5.3结果与分析
5.3.1标准曲线
UV-Vis法、DS组、HA组、DT组检测剂测定亚硝酸盐的标准曲线分别如图4(a)～(d)所示。由图可知，UV-Vis法、DS组、HA组、DT组测定的亚硝酸盐含量与吸光值呈良好的线性关系 R2分别为0.9994、0.9989、0.9983、0.9985。表明液剂型检测剂同UV-Vis法一样，适用于测定亚硝酸盐。
5.3.2 UV-Vis分光光度法的测定结果
由表5-2可知，15种腌渍蔬菜样品中，亚硝酸盐含量具有显著差异，其中亚硝酸盐含量属于低风险范围(1～5mg/kg)的有9种，属于一般风险(5～20mg/kg)的有5种，属于高风险的只有1种，其含量超过我国20mg/kg的限量标准，表明这15种腌渍蔬菜中仅有酸菜中的亚硝酸盐含量超标。根据UV-Vis法测得亚硝酸盐含量的结果，设定加标量为1、5、10μg，计算出回收率在80～105％之间，高于80％，RSD％在0.11～3.26％之间，小于5％，表明UV-Vis法测定发酵蔬菜中的亚硝酸盐具有良好精密度，测定结果准确可靠。
表5-2 UV-Vis法测定结果
5.3.3 DS组检测剂的测定结果
由表5-3可知，DS组检测剂测定腌渍蔬菜中的亚硝酸盐结果与UV-Vis法相似。设定加标量为1、5、10μg，计算出回收率在80～101％之间，高于80％，RSD％在0.13～2.75％之间，小于5％，表明DS组检测剂的测定结果精密度良好，测定结果准确可靠，在测定腌渍蔬菜中的亚硝酸盐含量时具有实际应用价值。
表5-3 DS组检测结果
5.3.4 HA组检测剂的测定结果
由表5-4可知，HA组检测剂测定腌渍蔬菜中的亚硝酸盐结果与UV-Vis法相似。设定加标量为1、5、10μg，计算出回收率在82～100.4％之间，高于80％，RSD％在0.12～3.25％之间，小于5％，表明HA组检测剂的测定结果精密度良好，测定结果准确可靠，在测定腌渍蔬菜中的亚硝酸盐含量时具有实际应用价值。
表5-4 HA组检测结果
5.3.5 DT组检测剂的测定结果
由表5-5可知，DT组检测剂测定腌渍蔬菜中的亚硝酸盐结果与UV-Vis法相似。设定加标量为1、5、10μg，计算出回收率在83～104％之间，高于80％，RSD％在0.12～2.62％之间，小于5％，表明DT组检测剂的测定结果精密度良好，测定结果准确可靠，在测定腌渍蔬菜中的亚硝酸盐含量时具有实际应用价值。
表5-5 DT组检测结果
5.3.7显著性差异分析
以UV-Vis法为对照，对液剂型亚硝酸盐检测剂测得的样品亚硝酸盐含量进行显著性差异分析。结果如表5-7所示。在DS组测定的结果中，Y1、Y2、Y8、Y12样品中亚硝酸盐含量与 UV-Vis法的测定结果有显著性差异。HA组测定的结果只有Y4样品中亚硝酸盐含量与UV-Vis 法的测定结果有显著性差异。在DT组测定的结果中，Y4、Y7、Y8样品中亚硝酸盐含量与UV-Vis 法的测定结果有显著性差异。因此，液剂型检测剂可用腌渍蔬菜中的亚硝酸盐快速精确定量，适用性HA组>DT组>DS组。
表5-7液剂型检测剂测定样品结果与UV-Vis法的显著性差异分析
注：每个样品对应的“1,2,3”等阿拉伯数字代表alpha＝0.05的子集。不同的小写字母表示具有显著性差异。
以上实施案例仅用于说明本专利的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施案例对本专利进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施案例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本专利各实施案例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂，其特征在于：该检测剂包括重氮试剂、偶合试剂和酸性介质；所述重氮试剂为对氨基苯磺酸，偶合试剂为盐酸萘乙二胺溶液，酸性介质为丁二酸；其中重氮试剂与偶合试剂的体积比为3-5:1，酸性介质的浓度为0.2-0.4mol/L。
2.一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂，其特征在于：该检测剂包括重氮试剂、偶合试剂和酸性介质；所述重氮试剂为对氨基苯乙酮，偶合试剂为盐酸萘乙二胺溶液，酸性介质为苹果酸；其中重氮试剂与偶合试剂的体积比为1-3:1，酸性介质的浓度为0.4-0.6mol/L。
3.一种快速定量测定亚硝酸盐的检测剂，其特征在于：该检测剂包括重氮试剂、偶合试剂和酸性介质；重氮试剂为磺胺，偶合试剂为盐酸萘乙二胺溶液，酸性介质为酒石酸；其中重氮试剂与偶合试剂的体积比为2-4:1，酸性介质的浓度为0.4-0.6mol/L。
4.如权利要求2所述的快速定量测定亚硝酸盐的检测剂，其特征在于：该检测剂还包括催化剂，该催化剂为三乙胺盐酸盐，三乙胺盐酸盐在检测剂中的质量含量为8-12％。
5.一种利用权利要求1所述检测剂进行快速定量测定亚硝酸盐的方法，其特征在于：该方法基于GB 5009.33-2016进行检测，其用丁二酸替代浓盐酸，丁二酸的浓度为0.4mol/L，对氨基苯磺酸质量浓度为9g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度为0.1g/L，重氮化合物与偶合试剂的体积比为4:1。
6.一种利用权利要求2或4所述检测剂进行快速定量测定亚硝酸盐的方法，其特征在于：该方法基于GB 5009.33-2016进行检测，其用苹果酸替代浓盐酸，苹果酸的浓度为0.6mol/L，对氨基苯乙酮质量浓度为7g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4g/L，重氮化合物与偶合试剂的体积比为3:1。
7.一种利用权利要求2所述检测剂进行快速定量测定亚硝酸盐的方法，其特征在于：该方法基于GB 5009.33-2016进行检测，其用酒石酸替代浓盐酸，酒石酸的浓度为0.6mol/L，磺胺质量浓度9g/L、盐酸萘乙二胺质量浓度0.4g/L，重氮化合物与偶合试剂的体积比为4:1。
8.如权利要求5所述测定亚硝酸盐的方法，其特征在于：该方法测定亚硝酸盐的时间为15min。
9.如权利要求6所述测定亚硝酸盐的方法，其特征在于：测定亚硝酸盐的方法，其特征在于：该方法测定亚硝酸盐的时间为5-15min；三乙胺盐酸盐的质量百分含量为12％时，该方法测定亚硝酸盐的时间为5min。
10.如权利要求7所述测定亚硝酸盐的方法，其特征在于：测定亚硝酸盐的方法，该方法测定亚硝酸盐的时间为6min。
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