CN113788879A

CN113788879A - 黑斑蛙蛋白酶抑制肽及其基因在制药和化妆品中的应用

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Publication number: CN113788879A
Application number: CN202110736474.2A
Authority: CN
Inventors: 徐学清
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2021-06-30
Filing date: 2021-06-30
Publication date: 2021-12-14

Abstract

本发明公开了一种黑斑蛙蛋白酶抑制肽及其基因在制药和化妆品中的应用。所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽是由17个氨基酸组成的环肽，分子量1965.89道尔顿，等电点10.11，其氨基酸序列为：SerLeuSerGlyCysTrpThrLysSerPheProArgLysProCysLeuArg(SLSGCWTKSFPRKPCLR)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的第五半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽的基因序列由SEQ ID NO.2组成，其中编码有功能的成熟黑斑蛙蛋白酶抑制肽是第130‑180位核苷酸。本发明公开了八种黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽及其在制药中的应用。本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽及改造肽具有合成方便、活性强、致敏性低、稳定性好的特点，能够抑制多种丝氨酸蛋白酶，可以作为制备预防或治疗与胃炎或胰腺炎相关或血栓性心脑血管疾病的药物以及制备抗皱化妆品应用。

Description

黑斑蛙蛋白酶抑制肽及其基因在制药和化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医学和医学美容领域，具体涉及一种从黑斑蛙蛋白酶抑制肽及其基因在制药和化妆品中的应用。

背景技术

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor，serpin)是一类通过抑制丝氨酸蛋白酶，调节丝氨酸蛋白酶的水解平衡，从而防止蛋白质水解的药物。由于生物体内蛋白质功能的多样性，能够调控蛋白水解的丝氨酸蛋白酶抑制剂在维持生物体内环境稳定上起着举足轻重的作用。如在哺乳类动物消化、凝血、炎症发生和补体系统方面，丝氨酸蛋白酶都扮演着非常重要的角色。而一旦生物体内丝氨酸蛋白酶活性受到影响，都有可能造成平衡失调，从而导致各种各样的疾病。鉴于其在众多的生理过程中起到重要调控作用，丝氨酸蛋白酶的临床应用也一直备受研究者的关注。

心血管疾病(Cardiovascular Disease，CVD)已然是全球死亡率最高的疾病。在我国，心血管疾病的发病率和死亡率也一直居于首位，并且患者的总体发病年龄正趋于年轻化。由于大多数心血管疾病的诱因是血栓的形成，因此使用抗凝药物来预防和治疗心血管疾病是临床上主要的治疗手段。目前临床上常用的抗凝血药物主要非肠道用药抗凝血剂(肝素)、口服抗凝血剂(华法林)和水蛭素。然而他们都有各自的不足之处，肝素和华法林的使用剂量难以把控，一旦过量就会引起自发性出血，而且长期使用肝素还会导致骨质疏松。而水蛭素虽然疗效高，副作用小，但其价格昂贵，长期使用会增加大部分患者的经济负担。因此，寻找高效、低毒且价廉的新药是非常必要的。

另外，像埃博拉病毒、SARS冠状病毒等在内的多种病毒都依赖于宿主细胞蛋白酶对其包膜糖蛋白的激活而成功进入宿主细胞，因此各个酶成为了抗病毒干预极好的靶标。已有研究证明了SARS-CoV的病毒传播和发病机制是由丝氨酸而不是半胱氨酸蛋白酶驱动的，并且可以由临床上用于治疗胰腺炎的丝氨酸蛋白酶抑制药物(camostat)进行有效的预防。

人体皮肤老化是一个复杂的生物学过程，影响皮肤的各层，但主要在真皮。随着年龄的增长，表皮干细胞的数量会减少，皮肤的再生能力也会随之下降导致屏障损伤，皮肤的水分和弹性降低。皮肤弹性受弹性蛋白和胶原纤维的质量和数量的影响。此外，弹性蛋白酶也参与了紫外线辐射引起的皮肤老化过程和相关的皱纹形成。在生理条件下，弹性蛋白酶活性受体内丝氨酸蛋白酶抑制剂调控。然而，这种平衡可能会受到活性氧自由基(ROS)的影响，结果是健康组织的破坏和持续的炎症过程。由此可见，发现新的丝氨酸蛋白酶抑制剂并研究其具体作用是非常具有现实意义和社会价值的。

为了适应生存环境的复杂性，两栖动物皮肤在长期的进化中形成了一套有效的防御机制。据报道，国外研究人员已经在两栖动物皮肤上鉴定出多种活性多肽，这些多肽不光具有显著的抗菌活性，还具有强大的抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗血液凝固和免疫调节等活性。巨大的潜在药用价值使得两栖动物皮肤多肽分泌物成为了国内外研究热点之一。

两栖动物在我国的药用历史非常悠久，例如从中华蟾蜍(Bufogargarizans)提取得到的蟾酥就是一味常用的中药材料，另外雌性中国林蛙(Ranachensinensis)的输卵管干制品蛤士蟆油也是常用的中药材，有滋阴补肾、褪火润肺的功效。然而由于现代工艺的限制和理论研究上的浅薄，我国对两栖动物药用价值的开发与利用远远达不到理想水平，特别是对两栖动物活性物质的鉴定、分离以及定性定量研究尤为不足，这不仅导致了我国在两栖动物资源利用上的浪费，也使得我国以两栖动物为原料制成的中药未能得到世界其他国家的认可。

因此，从两栖动物中寻找特定的活性单体化合物是中药现代化研究的重点之一。黑斑蛙(Pelophylaxnigromaculatu)现已成为人工饲养的经济蛙之一，然而目前对其皮肤药理活性物质的研究很少。

发明内容

基于上述技术背景，本发明的目的是提供一种具有蛋白酶抑制活性和抗凝血活性的黑斑蛙蛋白酶抑制肽及其基因。

本发明利用转录组学方法和药理学研究获得黑斑蛙蛋白酶抑制肽的全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的黑斑蛙蛋白酶抑制肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因。

本发明的另一目的是提供该黑斑蛙蛋白酶抑制肽在制备药物和化妆品中的应用。

本发明的另一目的是提供该黑斑蛙蛋白酶抑制肽的改造肽及其在制备药物和化妆品中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

本发明一个方面提供了一种黑斑蛙蛋白酶抑制肽，所述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽是由 17个氨基酸组成，分子量1965.894道尔顿，等电点10.11，其氨基酸序列为：Ser Leu SerGly Cys Trp Thr Lys Ser Phe Pro Arg Lys Pro Cys Leu Arg(SLSGCWTKSFPRKPCLR)(SEQ ID NO.1)。上述多肽的其第五半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。

本发明再一个方面提供了黑斑蛙蛋白酶抑制肽基因的核苷酸序列，cDNA由255个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列如SEQ ID NO.2所示。

序列中第130-180位核苷酸编码具有功能的成熟黑斑蛙蛋白酶抑制肽。

所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽可以采用本领域技术人员已知的方法(例如固相合成方法) 制备得到，以及可以采用本领域已知的分离纯化方法(例如高效液相色谱法)分离纯化。

本发明利用转录组学方法和药理学研究获得黑斑蛙蛋白酶抑制肽的全序列氨基酸结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的黑斑蛙蛋白酶抑制肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同基因，本发明所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽是一个来源于黑斑蛙皮肤的全新多肽。

本发明再一个方面提供了前述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽在制备胰蛋白酶抑制剂的用途，所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

采用发色底物比色法，检测黑斑蛙蛋白酶抑制肽体外抑制蛋白酶促使底物发色的催化作用。相较于对照组，多肽能够显著抑制底物发色程度，即多肽能够在极短的时间内抑制丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶)的酶促活性。

本发明再一个方面提供了前述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽在制备用于治疗胃炎、胰腺炎等炎症的蛋白酶抑制剂的用途，所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

采用酪蛋白水解法，检测黑斑蛙蛋白酶抑制肽体外抑制蛋白酶促使底物发色的催化作用。酪蛋白是优质动物蛋白质补剂成分，在体内作为胰蛋白酶水解底物被机体吸收。随着多肽浓度的升高，显著抑制了胰蛋白酶对酪蛋白的水解作用，即多肽浓度依赖性地抑制了胰蛋白酶的活性。

本发明再一个方面提供了前述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽在制备凝血酶抑制药物、抗凝药物，以及预防或治疗血栓性心脑血管疾病的用途，所述多肽氨基酸序列如SEQ IDNO.1 所示。

采用凝血酶诱导血小板聚集实验，检测黑斑蛙蛋白酶抑制肽体外抑制丝氨酸蛋白酶 (凝血酶)诱导的血小板聚集活性。与对照组相比，凝血酶可以诱导血小板发生聚集反应，不同浓度的多肽预处理后可以显著抑制聚集作用，即多肽能够抑制丝氨酸蛋白酶(凝血酶)的活性。采用小鼠断尾流血实验发现黑斑蛙蛋白酶抑制肽显著提高了流血时间，具有抗凝血作用。

本发明再一个方面提供了前述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽在制备溶栓性药物，以预防或治疗术后血栓形成的用途，所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

采用活化部分凝血实验(APTT)实验和血浆凝固实验，检测黑斑蛙蛋白酶抑制肽体外影响血栓形成的作用。随着多肽浓度的升高，显著延长了APTT时间和血浆凝固时间。

本发明再一个方面提供了前述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽在制备用与抗皱美容化妆品制剂中的应用，尤其是对弹性蛋白酶的高效抑制作用。

采用发色底物法和表面等离子共振技术，检测黑斑蛙蛋白酶抑制肽与弹性蛋白酶的结合并且抑制作用。结果显示黑斑蛙蛋白酶抑制肽能够高效结合弹性蛋白酶并且发挥抑制作用。

如上所述应用，所述治疗药物的给药剂型可以是霜剂、膏剂、水剂、粉剂、油剂等多种剂型；上述各种剂型的化妆品制剂均可以按照化妆品领域的常规方法制备。

本发明再一个方面提供了前述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽在联合其他分子制备低过敏性、高稳定性的蛋白酶抑制剂组合物的用途，所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

采用肥大细胞脱颗粒实验，检测黑斑蛙蛋白酶抑制肽对大鼠腹腔原代肥大细胞的致敏反应。结果显示黑斑蛙蛋白酶抑制肽几乎不刺激肥大细胞脱颗粒，具有极低的致敏作用。又采用圆二色谱(CD)法检测黑斑蛙蛋白酶抑制肽对不同盐浓度和温度的耐受性，结果显示黑斑蛙蛋白酶抑制肽的二级结构在多种条件下基本未发生改变，具有良好的盐耐受和温度耐受性，适合作为单分子或组合物分子应用。

如上所述应用，所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽包括黑斑蛙蛋白酶抑制肽的多肽物、截断物、类似物、组合物和药学上可接受的载体。

本发明再一个方面提供了八种前述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽为原型药的改造肽，命名为黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽1-8，所述多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.7～14所示。

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-1：GlyCysTrpThr Lys Ser Phe Pro Arg Lys ProCys Leu Arg(GCWTKSFPRKPCLR)(SEQ ID NO.7)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-2：GlyCysTrpThr Lys Ser Phe Pro Arg Lys ProCys Leu (GCWTKSFPRKPCL)(SEQ ID NO.8)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-3：GlyCysTrpThr Lys Ser Phe Pro Arg Lys ProCys (GCWTKSFPRKPC)(SEQ ID NO.9)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-4：Ser Leu Ser GlyCysTrpThr Lys Ser Phe ProArg Lys Pro Cys(SLSGCWTKSFPRKPC)(SEQ ID NO.10)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-5：Ser Leu Ser GlyCysTrpThr Lys Ser Phe ProArg Lys Pro Cys Leu ArgAsnArg(SLSGCWTKSFPRKPCLRNR)(SEQ ID NO.11)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-6：Ser Leu Ser GlyCysTrpThr Lys Ser Phe ProArg Lys Pro Cys Leu(SLSGCWTKSFPRKPCL)(SEQ ID NO.12)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-7：Ser Leu Ser GlyCysTrpThr Lys Ser PheProPro Lys Pro Cys Leu Arg(SLSGCWTKSFPPKPCLR)(SEQ ID NO.13)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-8：Ser Leu Ser GlyCysTrpThr Lys Ser Phe ProArg Lys Pro Cys Leu Arg-NH2(SLSGCWTKSFPRKPCLR-NH2)(SEQ ID NO.14)

所述黑斑蛙改造肽-1是由14个氨基酸组成，分子量1677.04道尔顿，等电点10.11；所述黑斑蛙改造肽-2是由13个氨基酸组成，分子量1520.85道尔顿，等电点9.50；所述黑斑蛙改造肽-3是由12个氨基酸组成，分子量1407.69道尔顿，等电点9.50；所述黑斑蛙改造肽-4是由15个氨基酸组成，分子量1695.01道尔顿，等电点9.50；所述黑斑蛙改造肽-5是由19个氨基酸组成，分子量2234.78道尔顿，等电点10.11；所述黑斑蛙改造肽-6是由16个氨基酸组成，分子量1808.13道尔顿，等电点9.50；所述黑斑蛙改造肽-7是由17个氨基酸组成，分子量1908.12道尔顿，等电点9.50；所述黑斑蛙改造肽-8是由17个氨基酸组成，N端氨基化修饰，分子量1963.34道尔顿，等电点10.11。

本发明再一个方面提供部分黑斑蛙改造肽(黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-1，黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-5，黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-8)在制备胰蛋白酶抑制药物，预防或治疗与胃炎或胰腺炎的药物的应用。

采用发色底物比色法，检测黑斑蛙蛋白酶抑制肽体外抑制蛋白酶促使底物发色的催化作用。本发明所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽及所有改造肽(除黑斑蛙改造肽-3以外)均可以抑制胰蛋白酶活性。其中黑斑蛙改造肽-5和黑斑蛙改造肽-8能够显著提高了抑制剂活性甚至超过阳性药PMSF，黑斑蛙改造肽-3完全丧失活性。活性排序为黑斑蛙改造肽-5 ＞黑斑蛙改造肽-8＞黑斑蛙原型肽＞黑斑蛙改造肽-1＞黑斑蛙改造肽-7＝黑斑蛙改造肽 -4＝黑斑蛙改造肽-2＞黑斑蛙改造肽-6＞黑斑蛙改造肽-3。

本发明再一个方面提供部分黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽(黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-1，黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-5，黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-8)在制备凝血酶抑制药物，预防或治疗血栓性心脑血管疾病药物的应用。

采用血浆凝固实验，检测黑斑蛙蛋白酶抑制肽体外影响血栓形成的作用。本发明所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽及部分改造肽可以显著长血浆凝固时间，黑斑蛙改造肽-5和黑斑蛙改造肽-8能够显著提高了血浆凝固抑制的活性，黑斑蛙改造肽-1维持了原型肽活性。其中，黑斑蛙改造肽-8效果最强，活性排序为黑斑蛙改造肽-8＞黑斑蛙改造肽-5＞黑斑蛙蛋白酶抑制肽(原型肽)＞黑斑蛙改造肽-1。其他改造肽血浆凝固活性低于原型肽或丧失。

如上所述应用，所述治疗药物的给药方式为注射、粘膜给药、或腔道给药。

本发明的有益效果在于：

由黑斑蛙蛋白酶抑制肽编码基因推导其氨基酸结构，合成的黑斑蛙蛋白酶抑制肽具有显著的抑制胰酶、凝血酶活性，抗凝血和预防血栓的作用，稳定性好，不受高盐高温影响。该黑斑蛙蛋白酶抑制肽具有结构简单、人工合成方便、活性强，致敏性低和稳定性好的有益特点。

此外，黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽中黑斑蛙改造肽-8和黑斑蛙改造肽-5的丝氨酸蛋白酶抑制活性均表现出优于原型肽，改造肽更具有临床应用潜质。

附图说明

图1为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽HPLC纯化鉴定结果；

图2为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽质谱鉴定结果；

图3为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽胰蛋白酶抑制剂活性发色底物法结果；

图4为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽胰蛋白酶抑制剂活性酪蛋白琼脂糖板法结果；

图5为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽延长凝血酶诱导的血小板聚集活性结果；

图6为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽延长APTT活性结果；

图7为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽延长血浆凝固时间结果；

图8为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽延长鼠尾流血时间结果；

图9为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽结合弹性蛋白酶结果；

图10为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽抑制弹性蛋白酶作用结果；

图11为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽对肥大细胞脱颗粒活性结果；

图12为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽在不同盐溶液圆二色谱结果；

图13为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽在不同温度圆二色谱结果；

图14为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-1～8HPLC纯化鉴定与质谱结果；

图15为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽抑制肽胰蛋白酶活性发色底物法结果；

图16为本发明黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽延长血浆凝固时间结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明公开了一种黑斑蛙蛋白酶抑制和抗凝血肽及其基因在制药中的应用。所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽是由17个氨基酸组成的环肽，分子量1965.89道尔顿，等电点10.11，其氨基酸序列为：SerLeuSerGlyCysTrpThr Lys SerPhe Pro Arg Lys Pro CysLeuArg(SLSGCWTKSFPRKPCLR)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的第五半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽的基因序列由SEQ ID NO.2组成，其中编码有功能的成熟黑斑蛙蛋白酶抑制肽是第130-180位核苷酸。

本发明由黑斑蛙蛋白酶抑制肽的基因推导其成熟功能多肽氨基酸序列，合成的黑斑蛙蛋白酶抑制肽具有很强的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性，具有较高的抗凝血活性和溶血栓效果，能够用来弥补肝素类药物的缺陷，并且可以在高盐高温环境下保持活性。该黑斑蛙蛋白酶抑制肽具有结构简单、人工合成方便、活性强、致敏性低和稳定性好的特点，可以作为制备预防或治疗与胃炎或胰腺炎相关或血栓性心脑血管疾病的治疗药物应用。所述治疗药物的给药方式为注射、粘膜给药、或腔道给药。

本发明的黑斑蛙蛋白酶抑制肽及其基因的制备过程包括如下步骤：

实施例1

黑斑蛙蛋白酶抑制肽基因克隆：

I、黑斑蛙皮肤总RNA提取：活体黑斑蛙用水清洗干净，处死后放入液氮中速冻4h，取皮肤组织，称重，取300mg皮肤组织，加入10m1总RNA提取缓冲液(Trizol溶液，美国GIBCOBRL公司产品)，于20m1玻璃匀浆器中匀浆30min。加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10min，4℃，12000rpm离心10min，弃除沉淀。向上清中加入等体积的异丙醇，室温放置10min，4℃，12000rpm离心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底的沉淀物即为黑斑蛙皮肤总RNA。

II、黑斑蛙皮肤mRNA的纯化：黑斑蛙皮肤mRNA分离纯化采用美国PROMEGA 公司的PolyA

mRNA Isolation Systems试剂盒。具体如下：取黑斑蛙皮肤总RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10min，加人3μlOligo(dT)探针和13μl 20×SSC溶液，混匀，放置室温冷却，称为A液。将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30sec，弃上清，加0.5×SSC0.3m1，至磁力架吸附30sec，最后加0.1ml 0.5×SSC悬浮，称之为B液。将A液加入B液中，室温放置10分钟，至磁力架吸附30sec，弃上清，用0.1×SSC 洗涤4次，最后弃上清，加0.15mlDEPC水悬浮，至磁力架上吸附30sec，将上清移至新的试管，再加入0.15m1DEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30sec，移上清至上述试管，则上清中为纯化的黑斑蛙皮肤mRNA。加入1/10体积3M乙酸钠，pH 5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30min，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀溶解于10μl DEPC 水中得到黑斑蛙皮肤mRNA。

III、黑斑蛙皮肤cDNA文库构建：

采用CLONTECH公司CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。

A.cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

在0.5ml无菌的离心管加入1μl黑斑蛙皮肤mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、 1μlCDS III/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。混匀离心管中的试剂并以12000rpm离心15sec，72℃保温2min。将离心管在冰上孵育2min。在离心管中加入以下试剂2.0μl 5×第一链缓冲、1.0μl 20mM二硫苏糖醇、1.0μl 10mMdNTP混合物、 1.0μlPowerScript反转录酶。混合离心管中试剂并以12000rpm离心15sec，在42℃保温1h。将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链：

95℃预热PCR仪。将2μlcDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl 10×Advantage 2PCR缓冲、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR 引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。在PCR仪中按以下程序扩增：95℃20 sec，95℃5sec，68℃6min，22个循环。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。

C.PCR产物用PROMEGA公司的

SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5min，使DNA充分与硅胶膜结合。以12000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液。加入700μl的洗脱液(含乙醇)于离心纯化柱中，以12000rpm 离心30sec，倒掉收集管中的废液。重复步骤上述步骤。12000rpm离心5min。将离心纯化柱置于新的离心管中。加入30μl超纯水，在室温下静置5min。以12000rpm离心30sec，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。

D.酶切、连接以及连接产物的转化：

在微量离心管中加入1μl Takara pMD18-T载体、4μl黑斑蛙cDNA双链溶液，全量为5μl。加入5μl的连接酶缓冲混合物。16℃反应2h。全量(10μl)加入至100μl DH5α 感受态细胞中，冰中放置30min。42℃加热90sec后，再在冰中放置1min。加入37℃ 孵育过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60min。取200μl涂布于含有X-Gal、 IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16h，形成单菌落。每个LB平皿用5m1LB液体培养基洗涤菌落，加30％甘油冻存。构建的cDNA大约含1×10⁶个单独克隆。

Ⅳ、黑斑蛙蛋白酶抑制肽基因克隆筛选：

扩增引物长度为25个核苷酸，其序列为5’ATGAAGGTCTGGCAGTGCGCGCTC 3’ (SEQID NO.3)，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMARTTM cDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列为 5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’(SEQ ID NO.4)。PCR反应在如下条件下进行：94℃30sec，50℃45sec和72℃2.5min，35个循环。

首先，滴定构建的细菌cDNA文库，然后用含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基稀释至适当的细菌浓度(大约5000个细菌/毫升和30个细菌/毫升分别用于首轮筛选、第二轮筛选)，在96孔培养板上按8×8矩阵铺板(共64孔，每孔100μ1)，37℃过夜培养。按行、列分别合并细菌培养液，有16个样品进行PCR鉴定，交叉阳性孔细菌样品进入第二轮筛选。

Ⅴ、黑斑蛙蛋白酶抑制肽基因序列测定和结果：

提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为美国Applied Biosystems373A全自动核苷酸序列测定仪，测序引物为BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M和BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47。BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M序列：5’GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’(SEQ ID NO.5)，BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’(SEQ ID NO.6)。基因测序结果自5’端至3’端序列为(SEQ ID NO.2)：

黑斑蛙蛋白酶抑制肽基因核苷酸的序列表为：序列长度为255个碱基；序列类型：核酸；链数：单链；拓扑学：环状；序列种类：cDNA；来源：黑斑蛙皮肤。

根据黑斑蛙蛋白酶抑制肽的基因推断编码由功能的成熟活多功能蛋白酶抑制肽为第130-180位核苷酸，氨基酸序列为：SLSGCWTKSFPRKPCLR(见序列SEQ ID NO.1)。

实施例2

黑斑蛙蛋白酶抑制肽的制备：

Ⅰ、黑斑蛙蛋白酶抑制肽的制备方法：根据黑斑蛙蛋白酶抑制肽的基因推断编码有功能的成熟多功能蛋白酶抑制肽氨基酸序列后用自动多肽合成仪合成多肽。通过HPLC 反相C18柱层析脱盐、纯化。二硫键的形成采用空气氧化法，具体为在烧瓶中将多肽溶解按照0.1mg/ml于0.1％醋酸溶液中后用氢氧化铵滴定成pH 7.8，然后室温搅拌过夜。通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化。纯化时A液体为0.05％TFA+2％CH₃CN，B 液为0.05％TFA+90％CH₃CN，B液浓度梯度为20min内15～35％，检测波长为220nm。纯化的黑斑蛙蛋白酶抑制肽用高效液相色谱(HPLC)方法鉴定其纯度，由图1可见，多肽出现在11.655min。

Ⅱ、分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment massspectrometry, FAB-MS)，以甘油:间硝基苄醇:二甲亚砜(1:1:l，V:V:V，体积比)为底物，Cs⁺作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。由图2可见，根据质谱图计算得到分子量为1965.89Da。

黑斑蛙蛋白酶抑制肽是中国两栖类动物黑斑蛙蛋白酶抑制肽基因编码的一种多肽，分子量1965.89道尔顿，等电点10.11，其氨基酸序列为：SerLeuSerGlyCysTrpThr LysSerPhe Pro Arg Lys Pro CysLeuArg(SLSGCWTKSFPRKPCLR)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第五半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。

实施例3

黑斑蛙蛋白酶抑制肽的活性实验：

Ⅰ、丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶)抑制剂活性测定

1.发色底物法

不同量的黑斑蛙蛋白酶抑制肽溶解于0.05M Tris-HCl缓冲液与一定量的胰蛋白酶 (最终浓度为40μg/mL)于0.05M Tris-HCl缓冲液于室温下保温2min，最后加入发色底物S-2238(终浓度为200μM)启动反应，应用Infinite M1000Pro(瑞士)公司生产的多功能微孔板检测仪于处监测吸收值变化2min，加入同样体积的Tris-HCl缓冲液与空白对照，蛋白酶抑制剂PMSF作为阳性对照。抑制常数Ki＝[I]/(V0/V1+1)计算。[I] 为黑斑蛙蛋白酶抑制肽的摩尔浓度，V0为空白对照是胰蛋白酶与发色底物的反应速度， V1为加入黑斑蛙蛋白酶抑制肽后胰蛋白酶与发色底物的反应速度。此试验重复六次，取平均值。

结果如图3所示，黑斑蛙蛋白酶抑制肽能很有效地抑制胰蛋白酶的活性，对胰蛋白酶的抑制常数Ki是1.214×10^-5M。

2.酪蛋白琼脂糖板法

将10μl胰蛋白酶与10μl不同浓度(0.05μM，0.5μM，5μM和50μM)的黑斑蛙蛋白酶抑制肽预孵育15min，滴加在含1％酪蛋白的1％的琼脂糖板中。室温孵育30min 后，用0.44M的三氯乙酸浸泡平板停止酶活性，接着用95％乙醇代替三氯乙酸进行琼脂糖凝胶脱水。用0.1％的考马斯亮蓝R-250染色，50％甲醇和10％冰醋酸洗脱浮色后观察蛋白水解区的清除情况。实验结果如图4所示，黑斑蛙蛋白酶抑制肽处理后的染色情况明显比对照组更深且呈浓度依赖性，说明多肽能够显著抑制胰蛋白酶对酪蛋白琼脂的水解，即黑斑蛙蛋白酶抑制肽显著抑制了胰蛋白酶的生化活性。

丝氨酸蛋白酶抑制剂对生物体内的生理生化功能都有重要的影响。如，它们在血液凝固、补体形成、纤溶、蛋白质折叠、细胞迁移、细胞分化、细胞基质重建、激素形成及转运、细胞内蛋白质水解、血压调节、肿瘤抑制以及病毒或寄生虫致病性的形成等方面都有重要作用。

如图3所示，黑斑蛙蛋白酶抑制肽在1.27μM浓度下就能有效抑制胰蛋白酶的活性，这预示着它极大可能抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶，阻止胰腺中其他活性蛋白酶的激活以及胰蛋白酶原的自身激活，这在临床上非常具有应用价值。众所周知，胃炎、胰腺炎的发病过程涉及许多丝氨酸蛋白水解作用，因此抑制这些酶的水解能有效防止疾病的发生并减低随后的炎症因子对机体造成的损害。具有丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的黑斑蛙蛋白酶抑制肽极有可能应用于炎症相关的胃炎、胰腺炎中。

Ⅱ、丝氨酸蛋白酶(凝血酶)抑制剂活性测定

取人新鲜静脉血液于含枸橼酸钠的抗凝采血管，轻轻混匀后1000rpm/min，离心5min，小心移出上层富血小板血浆，计数血小板并调至250×10⁹/L。将剩余血液以3000 r/min，离心20min，上层较为透明的液体即为贫血小板血浆，调节血小板至(10～ 20)×10⁹/L。

将富血小板血浆放入测定孔调节透光度为10％，并加搅拌磁棒，在37℃条件下预热3min。在富血小板血浆中加入诱导剂5U凝血酶，同时开始搅拌(1000rpm/min)，记录聚集波型。不同浓度(12.5μM，25μM，50μM)的黑斑蛙蛋白酶抑制肽与5U凝血酶共孵育5min后，在富血小板血浆中加入混合物，同时开始搅拌并记录。

结果如图5所示，黑斑蛙蛋白酶抑制肽能很有效地延迟凝血酶对富血小板血浆的聚集的活性，说明黑斑蛙蛋白酶抑制肽能抑制凝血酶的活性。

存在于人类和动物血液中的丝氨酸蛋白酶抑制剂，与凝血、纤溶以及血压调节等都有莫大的关系。例如人体内Serpin 10抑制蛋白可以抑制凝血因子Z和XI的激活，缺失该抑制蛋白将导致静脉血栓的形成。从黑斑蛙蛋白酶抑制肽能够有效延迟凝血酶对富血小板血浆的聚集作用可以看出其显著的抗凝作用，这预示着该肽用于心血管疾病治疗的可能性，其极有可能作为丝氨酸蛋白酶抑制剂用于治疗纤维蛋白溶解引起的出血和弥漫性血管内凝血。

Ⅲ、抗凝血测定

1.活化部分凝血实验(APTT)实验

取人新鲜静脉血液于含枸橼酸钠的抗凝采血管，轻轻混匀后3000rpm/min，离心5min收集上层液(缺乏血小板的血浆)，转移至离心管中，以防止血小板被激活。将白陶土-脑磷脂平衡至室温，颠倒混匀，取待测血浆与不同浓度(3.125μM，6.25μM，12.5 μM)的黑斑蛙蛋白酶抑制肽等体积混合，然后加入白陶土-脑磷脂溶液混匀。置于37℃ 水浴，期间轻轻混匀数次。接着加入经温育至37℃的CaCl₂(25mM)，立即计时，置于水浴中不断震荡，约30sec时取出，观察出现纤维蛋白丝的时间，重复2次取平均值。

2.血浆凝固实验

取人新鲜静脉血液于含EDTA的抗凝采血管，轻轻混匀后3000rpm/min，离心5min收集上层血浆。将50μl经温育至37℃血浆与50μl黑斑蛙蛋白酶抑制肽(50μM)混合并温育10min，然后加入50μl经温育至37℃的CaCl₂(25mM)震荡混匀，使用酶标仪测定405nm的吸光度，设定温度为37℃，间隔1min测定一次。

3.鼠尾流血实验

小鼠20只，雌雄过半，随机分为4组，每组5只，尾静脉给药，样品组给予不同浓度(2.5，5，10mg/kg)的生理盐水配制的黑斑蛙蛋白酶抑制肽，对照组以及相应体积的生理盐水。用药2h后将小鼠用固定器固定，使其减少自主行动后将鼠尾平放于桌面上，用70％的乙醇消毒鼠尾，在鼠尾末端5mm处用灭菌的手术刀片割断，立即将鼠尾放置于37℃保温的生理盐水中，观察并记录鼠尾出血时间。当每2min流出血液少于1μl判定为出血终止，记录终止前2min时间点为出血时间。

由图6可以看出，与空白组相比，本发明所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽可以剂量依赖地延长APTT时间；由图7可以看出，本发明所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽可以显著长血浆凝固时间；由图8可以看出，本发明所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽可以显著的延长正常小鼠的尾流血时间。因此，本发明所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽具有一定的抗凝血作用，可用作抗凝血试剂。凝血酶的过量激活会引起血小板活化聚集，加大血栓形成的概率。而一旦形成血栓，人体就很难将其分解，进而导致血栓性疾病的发生。

本发明所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽对凝血酶有明显的抑制活性，且在25μM时就能显著抑制血小板的聚集，其抗凝血活性和抗血小板聚集活性说明其极有可能应用于血栓性疾病的预防和治疗上。另外，由于许多人在进行手术过后都会有形成血栓的风险，黑斑蛙蛋白酶抑制肽的抗凝血活性和栓溶性作用也可应用于术后血栓的预防上。

Ⅲ、弹性蛋白酶抑制实验

1.表面等离子共振实验

1)2mM多肽样品固定于测试芯片并封闭。用PBS作为工作液以持续流动系统平衡系统。

2)实验中依次更换不同浓度梯度的弹性蛋白酶(1.25μM、2.5μM、5μM)，总体积700μ，流速为2μL·s-1，结合反应温度为22.8℃，结合时间为300s，解离时间为300s。每组样品间用重生液进行重生。

3)所得数据在PlexeraSPRi系统上通过SPRV3版本仪器对样品进行实时监测分析与实时监控。用BIA评估软件point-and-click，计算分离率和结合率常数。用三个靶蛋白浓度所得的结合率和分离率的平均值计算平衡常数。

2.发色底物法

不同量的黑斑蛙蛋白酶抑制肽溶解于0.05M Tris-HCl缓冲液与100nM弹性蛋白酶于 0.05M Tris-HCl缓冲液于室温下保温2min，最后加入发色底物启动反应5min，加入同样体积的Tris-HCl缓冲液作为空白对照，蛋白酶抑制剂PMSF作为阳性对照。

结果如图9和图10所示，黑斑蛙蛋白酶抑制肽能高效结合弹性蛋白酶，结合常数K_D＝1.89e-9M，并且多肽能够减少弹性蛋白酶催化的底物发色，即能够抑制弹性蛋白酶的活性。

Ⅳ、肥大细胞脱颗粒实验

肥大细胞脱颗粒通过测定β-D-氨基葡萄糖苷酶的释放来确定。配制台式液(137mMNaCl、2.7mMKCl、1.36mMCaCl₂、0.49mM MgCl₂、0.36mM NaH₂PO₄、11.9mM NaH₂CO₃和5.04mM D-葡萄糖)对成年Wistar大鼠进行腹腔冲洗，处死Wistar大鼠，将10ml 预冷的台式液腹腔注射，轻柔按摩10min后打开腹腔，3000rpm/min，离心5min获得肥大细胞。

调整肥大细胞密度为5×10⁵个/mL，取10μl黑斑蛙蛋白酶抑制肽加入90μl肥大细胞悬液中，37℃孵育15min，离心后取50μl上清液加入50ml底物(3mg对硝基苯基-N- 乙酰-Α-D-氨基葡糖苷溶于10ml 200mM乙酸钠，pH 4.5溶液中)进行β-D-氨基葡萄糖苷酶测定，孵育在37℃下反应6h。通过添加100ml 0.1M Na₂CO₃(pH 10.0)终止反应。在405nm处评估着色产物的吸光度，并将值表示为0.1％(v/v)Triton X-100(100％阳性对照，肥大细胞脱颗粒)存在下大鼠肥大细胞悬浮液中总β-D-氨基葡萄糖酶活性的百分比。

肥大细胞是特异性和先天免疫、过敏和炎症的中心分泌细胞。在过敏反应中，过敏原刺激抗体的释放，抗体附着在肥大细胞上。在随后的过敏原暴露之后，肥大细胞脱颗粒释放组胺(一种导致过敏症状的化学物质)等物质进入组织。如图11所示，50μM 的黑斑蛙蛋白酶抑制肽对大鼠肥大细胞的脱颗粒活性没有显著影响，也就是黑斑蛙蛋白酶抑制肽的致敏性较弱，应用更为安全。

Ⅴ、稳定性实验

蛋白质是具有特定结构的生物大分子，因为其固有的结构不对称性决定了蛋白质圆二色性。蛋白质的圆二色谱光谱一般分为远紫外区和近紫外区，波长范围分别为178～250 nm和250～320nm。远紫外区圆二色谱光谱反映肽键的圆二色性。根据这一特性，本实验考察不同浓度的盐溶液以及不同温度处理多肽后的圆二色谱结果的变化。

具体流程如下：

1)配制不同条件下试验样品：

多肽盐稳定性试验：黑斑蛙蛋白酶抑制肽(50μM)溶解在60mM十二烷基硫酸钠溶液中，然后在测量之前，分别与不同浓度的氯化钠(0、100、200和400mM)混合，室温孵育1h。

多肽温度稳定性实验：黑斑蛙蛋白酶抑制肽(50μM)溶解在60mM十二烷基硫酸钠溶液中，然后在测量之前，混合物分别在25℃、37℃和90℃条件下孵育1h。

2)准备洁净的圆二色谱检测皿，将样品分别加入皿中并置入仪器内检测，仪器检测设置参数为样品池路径长度0.1cm，25℃，距色谱柱1nm，扫描波长180～260nm。调节带宽1nm，响应时间1sec和扫描速度100nm/min。

如图12所示，在不同的氯化钠溶液中，随着盐浓度的增加，在195nm处的大正峰减少，α-螺旋构象的比例稍有下降，如图13所示，温度变化对其圆二色谱结果几乎没有影响。

大多数多肽类物质在高温环境中容易发生氢键的断裂，从而导致变性，因此在生产、贮存和使用方面会受到诸多限制。而本研究中的黑斑蛙蛋白酶抑制剂却能够在高温环境和高盐溶液中保持结构稳定，这不光说明该肽易于保存，还预示着该肽在进入生物体后有极大可能发挥其原本的抑制活性。另外，耐高温的特性也让其在临床使用方面能够进行更多的除菌操作，保证药物的安全性。

实施例4

黑斑蛙改造肽的制备：

八种黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽均根据其氨基酸序列采用自动多肽合成仪合成多肽；通过HPLC反相C18柱层析脱盐、纯化，检测波长为220nm。纯化的黑斑蛙蛋白酶抑制肽用高效液相色谱(HPLC)方法鉴定其纯度；采用快原子轰击质谱法进行分子量测定。

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-1：GlyCysTrpThr Lys Ser Phe Pro Arg Lys ProCys Leu Arg(GCWTKSFPRKPCLR)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-2：GlyCysTrpThr Lys Ser Phe Pro Arg Lys ProCys Leu (GCWTKSFPRKPCL)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-3：GlyCysTrpThr Lys Ser Phe Pro Arg Lys ProCys (GCWTKSFPRKPC)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-4：Ser Leu Ser GlyCysTrpThr Lys Ser Phe ProArg Lys Pro Cys(SLSGCWTKSFPRKPC)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-5：Ser Leu Ser GlyCysTrpThr Lys Ser Phe ProArg Lys Pro Cys Leu ArgAsnArg(SLSGCWTKSFPRKPCLRNR)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-6：Ser Leu Ser GlyCysTrpThr Lys Ser Phe ProArg Lys Pro Cys Leu(SLSGCWTKSFPRKPCL)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-7：Ser Leu Ser GlyCysTrpThr Lys Ser Phe ProPro Lys Pro Cys Leu Arg(SLSGCWTKSFPPKPCLR)

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-8：Ser Leu Ser GlyCysTrpThr Lys Ser Phe ProArg Lys Pro Cys Leu Arg-NH2(SLSGCWTKSFPRKPCLR-NH2)

所述黑斑蛙改造肽-1的HPLC纯化结果如图14A所示，多肽出现在9.67min。如图14B所示，是由14个氨基酸组成，分子量1677.04道尔顿，等电点10.11，其氨基酸序列如下，上述多肽的其第二位半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。

所述黑斑蛙改造肽-2的HPLC纯化结果如图14C所示，多肽出现在9.884min。如图14D所示，是由13个氨基酸组成，分子量1520.85道尔顿，等电点9.50，其氨基酸序列如下，上述多肽的其第二位半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。

所述黑斑蛙改造肽-3的HPLC纯化结果如图14E所示，多肽出现在5.195min。如图14F所示，是由12个氨基酸组成，分子量1407.69道尔顿，等电点9.50，其氨基酸序列如下，上述多肽的其第二位半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。

所述黑斑蛙改造肽-4的HPLC纯化结果如图14G所示，多肽出现在9.282min。如图14H所示，是由15个氨基酸组成，分子量1695.01道尔顿，等电点9.50，其氨基酸序列如下，上述多肽的其第五位半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。

所述黑斑蛙改造肽-5的HPLC纯化结果如图14I所示，多肽出现在11.773min。如图14J所示，是由19个氨基酸组成，分子量2234.78道尔顿，等电点10.11，其氨基酸序列如下，上述多肽的其第五位半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。

所述黑斑蛙改造肽-6的HPLC纯化结果如图14K所示，多肽出现在6.778min。如图14L所示，是由16个氨基酸组成，分子量1808.13道尔顿，等电点9.50，其氨基酸序列如下，上述多肽的其第五位半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。

所述黑斑蛙改造肽-7的HPLC纯化结果如图14M所示，多肽出现在11.690min。如图14N所示，是由17个氨基酸组成，分子量1908.12道尔顿，等电点9.50，其氨基酸序列如下，上述多肽的其第五位半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。

所述黑斑蛙改造肽-8的HPLC纯化结果如图14O所示，多肽出现在10.653min。如图14P所示，是由17个氨基酸组成，N端氨基化修饰，分子量1963.34道尔顿，等电点 10.11，其氨基酸序列如下，上述多肽的其第五位半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。

实施例5

黑斑蛙改造肽活性测定：

1.丝氨酸蛋白酶抑制剂活性测定(发色底物法)

不同量的黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽溶解于0.05M Tris-HCl缓冲液与一定量的胰蛋白酶(最终浓度为40μg/mL)于0.05M Tris-HCl缓冲液于室温下保温2min，最后加入发色底物S-2238(终浓度为200μM)启动反应，应用Infinite M1000Pro(瑞士)公司生产的多功能微孔板检测仪于处监测吸收值变化2min，加入同样体积的Tris-HCl缓冲液与空白对照，蛋白酶抑制剂PMSF作为阳性对照。此试验重复六次，取平均值。

结果如图15所示，本发明所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽及所有改造肽(除黑斑蛙改造肽-3以外)均可以抑制胰蛋白酶活性。其中黑斑蛙改造肽-5和黑斑蛙改造肽-8能够显著提高了抑制剂活性甚至超过阳性药PMSF，黑斑蛙改造肽-3完全丧失活性。活性排序为黑斑蛙改造肽-5＞黑斑蛙改造肽-8＞黑斑蛙蛋白酶抑制肽(原型肽)＞黑斑蛙改造肽-1 ＞黑斑蛙改造肽-7＝黑斑蛙改造肽-4＝黑斑蛙改造肽-2＞黑斑蛙改造肽-6＞黑斑蛙改造肽 -3。

2.抗凝血实验(血浆凝固实验)

黑斑蛙改造肽抗凝血活性通过血浆凝固实验进行测定。取人新鲜静脉血液于含EDTA的抗凝采血管，轻轻混匀后3000rpm/min，离心5min收集上层血浆。将50μl 经温育至37℃血浆与50μl黑斑蛙蛋白酶抑制肽或突变肽(50μM)混合并温育10min，然后加入50μl经温育至37℃的CaCl₂(25mM)震荡混匀，使用酶标仪测定405nm的吸光度，设定温度为37℃，间隔1min测定一次。

由图16可以看出，本发明所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽及部分改造肽可以显著长血浆凝固时间，黑斑蛙改造肽-5和黑斑蛙改造肽-8能够显著提高了血浆凝固抑制的活性，黑斑蛙改造肽-1维持了原型肽活性。其中，黑斑蛙改造肽-8效果最强，活性排序为黑斑蛙改造肽-8＞黑斑蛙改造肽-5＞黑斑蛙蛋白酶抑制肽(原型肽)＞黑斑蛙改造肽-1。其他改造肽血浆凝固活性低于原型肽或丧失。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，故凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 黑斑蛙蛋白酶抑制肽及其基因在制药和化妆品中的应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser Leu Ser Gly Cys Trp Thr Lys Ser Phe Pro Arg Lys Pro Cys Leu

1 5 10 15

Arg

<210> 2

<211> 255

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgttcacct tgaagaaatc cctcttactc cttttctttc ttgggaccat caccttatct 60

ctctgtgagc aagagagaga tgccaatgat gaagatggag gggaagttac aaaggaagtt 120

gtaaaaagat cactcagtgg gtgctggacc aagagttttc cacgaaagcc ttgtcttaga 180

aacagtaaaa catgaattga aagtcatctg gtgtggaata tcatttggct aaatgtcatg 240

ataaaaaaat aaaaa 255

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaggtct ggcagtgcgc gctc 24

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attctagagg ccgaggcggc cgacatg 27

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagcggataa caatttcaca cagg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Cys Trp Thr Lys Ser Phe Pro Arg Lys Pro Cys Leu Arg

1 5 10

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Cys Trp Thr Lys Ser Phe Pro Arg Lys Pro Cys Leu

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Cys Trp Thr Lys Ser Phe Pro Arg Lys Pro Cys

1 5 10

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ser Leu Ser Gly Cys Trp Thr Lys Ser Phe Pro Arg Lys Pro Cys

1 5 10 15

<210> 11

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ser Leu Ser Gly Cys Trp Thr Lys Ser Phe Pro Arg Lys Pro Cys Leu

1 5 10 15

Arg Asn Arg

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ser Leu Ser Gly Cys Trp Thr Lys Ser Phe Pro Arg Lys Pro Cys Leu

1 5 10 15

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ser Leu Ser Gly Cys Trp Thr Lys Ser Phe Pro Pro Lys Pro Cys Leu

1 5 10 15

Arg

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ser Leu Ser Gly Cys Trp Thr Lys Ser Phe Pro Arg Lys Pro Cys Leu

1 5 10 15

Arg

Claims

1.一种黑斑蛙蛋白酶抑制肽，所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其特征在于：所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽是由17个氨基酸组成，分子量1965.89道尔顿，等电点10.11；所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽的第五半胱氨酸和第十五位半胱氨酸形成分子内二硫键。

2.一种编码权利要求1所述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽的核苷酸。其特征在于：

cDNA由255个核苷酸组成，其自5’端至3’端序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽为活性成分的胰蛋白酶抑制药物的应用，其特征在于：所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽在联合其他分子制备低过敏性、高稳定性的蛋白酶抑制剂组合物。

4.权利要求1所述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽在制备预防或治疗与胃炎或胰腺炎的药物中的应用，其特征在于：所述胃炎或胰腺炎为胰蛋白酶消化相关的胃炎或胰腺炎。

5.权利要求1所述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽为活性成分的凝血酶抑制药物的应用，其特征在于：所述凝血酶抑制药物具有抗凝血、抑制血小板聚集和溶血栓功效。

6.权利要求1所述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽在制备预防或治疗血栓性心脑血管疾病的药物中的应用，其特征在于：所述血栓性心脑血管疾病为凝血功能异常和血栓形成。

7.权利要求1所述的黑斑蛙蛋白酶抑制肽在制备化妆、美容用品的应用，特别是利用其高效的弹性蛋白酶抑制作用，提高弹性蛋白酶含量从而达到抗皱美容的功效，其剂型可以是霜剂、膏剂、水剂、粉剂、油剂多种剂型。

8.权利要求3-7中任一项所述的应用，其特征在于：所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽包括黑斑蛙蛋白酶抑制肽的多肽物、截断物、类似物、组合物和药学上可接受的载体。

9.八种黑斑蛙蛋白酶抑制肽突变肽，其特征在于：具体为黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-1～8；

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-1：氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-2：氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-3：氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-4：氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-5：氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-6：氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-7：氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；

黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-8：氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，N端氨基化修饰。

10.权利要求9所述的八种黑斑蛙蛋白酶抑制肽突变肽，其特征在于：所述黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-1，黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-5，黑斑蛙蛋白酶抑制肽改造肽-8在制备胰蛋白酶抑制药物，预防或治疗与胃炎或胰腺炎的药物，凝血酶抑制药物，预防或治疗血栓性心脑血管疾病药物的应用。