CN113777197A - 一种同时测定桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的方法 - Google Patents

一种同时测定桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测桔霉素和1‑羟基‑2‑萘甲酸的方法，所述方法能够在高效液相色谱中区分桔霉素及其结构类似物1‑羟基‑2‑萘甲酸，并同时对桔霉素和1‑羟基‑2‑萘甲酸进行定性定量分析，克服现有技术中分别采用不同方法检测桔霉素和1‑羟基‑2‑萘甲酸的繁琐操作。本发明提供的方法不仅适用于桔霉素分子印迹实验中的分析检测，也适用于红曲霉及其制品中桔霉素含量的分析，方法准确可行，可信度高。

Description

一种同时测定桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的方法
技术领域
本发明属于测定技术领域，具体涉及一种同时检测桔霉素和1-羟基2-萘甲酸的方法。
背景技术
桔霉素（CIT）是青霉和曲霉类微生物产生的真菌毒素，部分食品有明确的桔霉素限量，例如中国轻工业行业标准QB/T 2847-2007对功能性红曲米（粉）的桔霉素限量为50μg/kg（50ppb），由青霉或曲霉发酵的产品需要经过桔霉素含量评估后才能流入市场。1-羟基2-萘甲酸（1H2NA）是嗜盐微生物将菲降解的中间代谢产物，其与桔霉素结构类似，常被作为桔霉素分子印迹聚合物构建中的假模板分子。在混菌发酵样品或者在桔霉素分子印迹聚合物构建的过程中需要同时检测这两种物质，尽管当前分别对桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的检测方法较为成熟且多样，但同时检测这两种物质的方法尚无报道。高效液相色谱能够对不同物质进行分离和检测，是分析结构类似物的首选方法，但桔霉素和1-羟基-2萘甲酸过于相似，在分子印迹检测方面存在竞争关系，在HPLC色谱检测过程中可能会相互干扰。针对当前缺少同时检测桔霉素和1-羟基-2萘甲酸的方法以及桔霉素HPLC检测方法拖尾的缺陷，本发明提供了一种同时分析桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的方法，该方法准确有效。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种同时检测桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种同时测定桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的方法，采用外标法测定桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸两种物质的含量，具体步骤如下：
（1）分别配置桔霉素标品溶液、1-羟基-2-萘甲酸标品溶液，以及桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的混合标品溶液，单标用于定性，混标用于绘制标曲，用液相色谱梯度体积进样法绘制浓度-峰面积的标准曲线；
（2）将样品溶液过0.22μm滤膜后采用液相色谱法进行测定，并根据（1）中的标准曲线计算浓度。
上述标品的配置方法：在电子分析天平中分别准确称取1mg桔霉素和8mg的1-羟基-2-萘甲酸，并用75%（v/v）乙醇将其分别稀释至1000ng/mL和8000ng/mL的单标溶液；各取1mL单标溶液混合成混标溶液，混标溶液中同时含有500ng/mL桔霉素和4000ng/mL1-羟基-2-萘甲酸。混标进样量分别为20μL、16μL、12μL、8μL、4μL，分别对应浓度为桔霉素500ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸 4000ng/mL、桔霉素400ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸3200ng/mL、桔霉素300ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸2400ng/mL、桔霉素200ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸1600ng/mL、桔霉素100ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸800ng/mL。
上述液相色谱的条件为：色谱柱：4.6×250mm、5μ的Agilent Zorbax SB-C18；激发波长331nm；发射波长500nm；柱温30℃；样品进样量20μL；标品为混标梯度体积进样；流动相：A相为同时含有0.02%（v/v）三乙胺、0.32%（v/v）四氢呋喃和0.1%（v/v）磷酸的水溶液，B相为体积分数为100%的乙腈，流动相的洗脱梯度条件如下：
表1 HPLC流动相的洗脱条件
Figure 149284DEST_PATH_IMAGE001
本发明的有益效果在于：
本发明所述的方法能够同时分离检测桔霉素及其结构类似物1-羟基-2-萘甲酸，使这两种物质的HPLC色谱峰互不干扰，该方法适用于桔霉素分子印迹实验中的分析检测，也适用于红曲霉及其制品中桔霉素含量的分析，方法准确可行，可信度高。
附图说明
图1为桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的化学结构式。
图2为本发明中桔霉素、1-羟基-2-萘甲酸及两者混标的液相色谱图。
图3为本发明中桔霉素的标准曲线。
图4为本发明中1-羟基-2-萘甲酸的标准曲线。
图5为本发明中分子印迹实验溶液中桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的液相色谱图。
图6为本发明中红曲霉发酵液的桔霉素液相色谱图。
图7为本发明中红曲乙醇提取液的桔霉素液相色谱图。
图8为本发明中红曲黄酒的桔霉素液相色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不仅仅限于此实施例。
实施例1
本发明的所述一种同时测定桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的方法，具体包括如下步骤：
（1）标品的配置：在电子分析天平中分别准确称取1mg桔霉素和8mg的1-羟基-2-萘甲酸并用75%（v/v）乙醇分别稀释至1000ng/mL和8000ng/mL的单标溶液；各取1mL单标溶液混合成混标溶液，混标溶液中同时含有500ng/mL桔霉素和4000ng/mL的1-羟基-2-萘甲酸。
（2）样品的处理：对于分子印迹样品，取分子印迹聚合物吸附前或吸附后的样品于12000r/min离心5min，取上清液用0.22μm滤膜过滤后待测；对于红曲等固态样品，用研磨将其研磨破碎，准确称取0.2g固态粉末，加入75%（v/v）乙醇60℃提取2h，4500r/min离心15min，取上清液用0.22μm滤膜过滤后待测；对于红曲霉发酵液、黄酒等液态样品，直接4500r/min离心15min，取上清液用0.22μm滤膜过滤后待测。
（3）液相色谱的检测条件为：色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6×250mm，5μ）；激发波长331nm；发射波长500nm；柱温30℃；样品进样量20μL；标品使用混标梯度进样；流动相：A相为同时含有0.02%（v/v）三乙胺、0.32%（v/v）四氢呋喃和0.1%（v/v）磷酸的水溶液，B相为体积分数为100%的乙腈。流动相的洗脱梯度条件如下：
表1 HPLC流动相的洗脱条件
Figure 853322DEST_PATH_IMAGE001
混标进样的方法为：混标进样量分别为20μL、16μL、12μL、8μL、4μL，分别对应浓度为桔霉素500ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸4000ng/mL、桔霉素400ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸3200ng/mL、桔霉素300ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸2400ng/mL、桔霉素200ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸1600ng/mL、桔霉素100ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸800ng/mL。
从图1中的化学结构式可知，桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸有一个相似的聚酮类共轭结构，都具有荧光效应，聚酮环上的主要官能团羟基和羧基位置一致，其对应的特性类似。从图2中可看出，本发明方法下对桔霉素、1-羟基-2-萘甲酸的峰形良好，没有明显的拖尾现象，且对桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸分离性能良好。通过标曲的绘制（图3和图4），该方法下标准曲线线性良好，R2均达到0.999以上，也说明了梯度体积进样的准确性，能够替代传统的标曲绘制方法。对该方法的应用性进行分析，该方法能够同时检测分子印迹实验过程中的溶液中的桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的含量（图5），也可以定量分析红曲霉发酵液（图6）、红曲乙醇提取液（图7）和红曲黄酒（图8）中桔霉素的含量，具有广泛的应用价值。
为了进一步比较本发明的方法在检测效果方面与常规技术之间的区别，分别使用桔霉素标品和1-羟基-2-萘甲酸标品进行检测限和定量限分析（本实验以基线信噪比3倍为检出限，以基线信噪比10倍为定量限）；分别使用本发明方法和16年国标《GB 5009.222-2016》（仅使用法一中测定红曲及其制品的HPLC方法，样品不经过免疫亲和柱处理，因为免疫亲和柱可以对样品进行浓缩，因浓缩倍数的不同，会导致最终的检出限和定量限计算结果不同）对同一瓶红曲霉发酵液进行桔霉素检测，以及分别使用本发明方法和文献方法（Guo B Y , Wang S , Ren B , et al. Citrinin selective molecularly imprintedpolymers for SPE[J]. Journal of Separation Science, 2015, 33(8):1156-1160. 检测方法如下：C18柱（150mm× 4.6mm，5μm），检测温度30℃，流动相为甲醇/水（80:20，v/v），甲醇和水的pH值分别用磷酸调节至4.1和4.6，流速为0.9mL/min，紫外检测器，检测波长为220nm，进样量为20μL）对同一份分子印迹实验溶液进行1-羟基-2-萘甲酸含量检测；并在样品检测的基础上，做加标回收率实验，即待测桔霉素的样品添加体积分数为10%的3000ng/mL桔霉素标品，待测1-羟基-2-萘甲酸的样品添加体积分数为10%的5000ng/mL1-羟基-2-萘甲酸标品。实验结果如表2所示，本发明的方法的检出限和定量限都优于常规检测方法，尤其对于1-羟基-2-萘甲酸的检测效果更加显著，因为文献中检测该物质的紫外检测器不如荧光检测器灵敏；在样品浓度检测方面，本发明的方法检测结果与常规检测方法无显著性差异，加标回收率也基本一致，说明本方法可替代常规检测方法。
表2 本发明方法与常规检测技术比较
Figure DEST_PATH_IMAGE002

Claims (4)

1.一种同时测定桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的方法，其特征在于：采用外标法测定桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的含量，具体步骤如下：
1）分别配置桔霉素标品溶液、1-羟基-2-萘甲酸标品溶液，以及桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的混合标品溶液，单标用于定性，混标用于绘制标曲，用液相色谱梯度体积进样法绘制浓度-峰面积的标准曲线；
2）将样品溶液过0.22μm滤膜后采用液相色谱法进行测定，根据步骤1）中的标准曲线计算浓度。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的方法，其特征在于：所述标品的配置方法为：在电子分析天平中分别准确称取1mg桔霉素和8mg的1-羟基-2-萘甲酸并用75%（v/v）乙醇分别稀释至1000ng/mL和8000ng/mL的单标溶液；各取1mL单标溶液混合成混标溶液，混标溶液中同时含有500ng/mL桔霉素和4000ng/mL的1-羟基-2-萘甲酸。
3.根据权利要求1所述的一种同时测定桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的方法，其特征在于：所述梯度体积进样的方法为：混标进样量分别为20μL、16μL、12μL、8μL、4μL，分别对应浓度为桔霉素500ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸4000ng/mL、桔霉素400ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸3200ng/mL、桔霉素300ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸2400ng/mL、桔霉素200ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸1600ng/mL、桔霉素100ng/mL和1-羟基-2-萘甲酸800ng/mL。
4.根据权利要求1所述的一种同时测定桔霉素和1-羟基-2-萘甲酸的方法，其特征在于：所述液相色谱的条件为：色谱柱：4.6×250mm、5μ的Agilent Zorbax SB-C18；激发波长331nm；发射波长500nm；柱温30℃；样品进样量20μL；标品为混标梯度体积进样；流动相：A相按体积百分比计为同时含有0.02%三乙胺、0.32%四氢呋喃和0.1%磷酸的水溶液，B相为体积分数为100%的乙腈；流动相的洗脱梯度为：0~2min，70%A+30%B，流速1mL/min；2~5min，A液由70%减少至30%，B液由30%增加至70%，流速1mL/min；5~7.5min，A液体由30%减少至15%，B液由70%增加至85%，流速由1mL/min升至1.5mL/min；7.5~8min，A液由15%减少至10%，B液由85%增加至90%，流速1.5mL/min；8~8.5min，A液由10%减少至5%，B液由90%增加至95%，流速1.5mL/min；8.5~9min，A液由5%减少至0%，B液由95%增加至100%，流速1.5mL/min；9~11min，B液保持100%，流速由1.5mL/min降至1.2mL/min；11~12.5min，B液保持100%，流速保持1.2mL/min；12.5~13.5min，A液由0%升至30%，B液由100%降至70%，流速由1.2mL/min降至1mL/min；13.5~15min，A液由30%升至70%，B液由100%降至30%，流速保持1min/mL；15~17min，70%A+30%B，流速1mL/min。
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