CN113768028A - 一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法及其应用 - Google Patents
一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113768028A CN113768028A CN202111072419.4A CN202111072419A CN113768028A CN 113768028 A CN113768028 A CN 113768028A CN 202111072419 A CN202111072419 A CN 202111072419A CN 113768028 A CN113768028 A CN 113768028A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sorghum
- ustilago
- protein
- separating protein
- crude extract
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 title claims abstract description 61
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 title claims abstract description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 241000221566 Ustilago Species 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 26
- -1 pplication Species 0.000 title abstract description 5
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 13
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims abstract description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 13
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 9
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 8
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 claims description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 claims description 4
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 claims description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 3
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 20
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 abstract description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract description 2
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 6
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 6
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 3
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 235000009200 high fat diet Nutrition 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 2
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 2
- 238000013116 obese mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 2
- 102100036009 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010023302 HDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 238000013218 HFD mouse model Methods 0.000 description 1
- 101000783681 Homo sapiens 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010028554 LDL Cholesterol Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000317981 Podosphaera fuliginea Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000893482 Sporisorium sorghi Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003712 anti-aging effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 244000000005 bacterial plant pathogen Species 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N chloral hydrate Chemical compound OC(O)C(Cl)(Cl)Cl RNFNDJAIBTYOQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002327 chloral hydrate Drugs 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000013325 dietary fiber Nutrition 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 210000000918 epididymis Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 230000004110 gluconeogenesis Effects 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000020939 nutritional additive Nutrition 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 1
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
- A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
- A23J1/008—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/195—Proteins from microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种具有降脂活性蛋白的制备方法,特别是涉及一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法及其应用,它属于食品或药品技术领域。一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法,其制备步骤包括浸提、粗提物制备和分离提纯。本发明提供了所述蛋白的制备方法,经内外降脂实验证明本发明提供的蛋白具有降低体脂含量、降低血清脂质水平和减轻体重的作用,对于开发新型的减肥、降血脂等天然食品和治疗药物具有重要意义。本发明的制备方法简单,成本低,提取纯度高,重现性好,可实现工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有降脂活性蛋白的制备方法,特别是涉及一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法及其应用,它属于功能性食品或药品技术领域。
背景技术
高粱丝黑穗病菌(Sphacelothecareiliana),俗称高粱黑粉菌,属于担子菌门,黑粉菌纲,是重要的植物病原真菌。高粱黑粉菌虽然是植物病原菌,但作为典型的黑色食品和食用菌,具有很高的营养价值和保健作用。高粱丝黑穗病菌也应用于民间常用中药,具有很多功效,例如调经、止血、预防结肠炎和冠心病;高粱丝黑穗病菌具有很强的抗肿瘤活性,对肿瘤细胞有很强的抑制力,对人体有抗衰老作用、促进蛋白质与核酸的合成、抵抗放射线的破坏并增加白细胞含量,有抗溃疡、抗炎症、降血糖、增强记忆、抗凝血的作用。高粱丝黑穗病菌是一种具有很高营养价值的食用菌,含有丰富的多糖、膳食纤维、微量元素、维生素、蛋白质、氨基酸,尤其是人体必须氨基酸含量丰富。
但国内外对黑粉菌研究的热点主要是作为植物病原菌侵染机理和分类上,对高粱黑粉菌的开发利用主要是加工成各类食品及添加剂。专利号200410082983.4、申请日为2004年12月15日的中国专利,公开了一种高粱黑粉真菌营养添加剂制备方法及其产品。专利号为200810229729.0、申请日为2008年12月15日的中国专利,公开了一种高粱黑粉真菌米肠。但高粱黑粉菌中分离的用于减肥、调节血脂的化合物,并用于制备降脂的药物至今未见有公开报道。
肥胖和高血脂在世界范围内发病率不断上升,是一种进行性发展且后期会严重危害身体健康甚至生命的疾病。研究表明,降低血脂水平是改善高血脂的有效方法。在对内体外降脂实验研究中,我们发现和发明了具有降脂活性的高粱黑粉菌蛋白质的制备方法和降脂用途。研究证明,它的体内外降脂作用呈一定的量效关系。高粱黑粉菌蛋白质属于天然植物来源的蛋白,可以减少脂肪和碳水化合物的吸收,从而具有降脂功效。
发明内容
本发明的目的是提供一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法及其应用,它从高粱黑粉菌中分离处具降脂活性的物质,采用了水提醇沉的方法,并且研究它的降脂生物活性,开拓了高粱黑粉菌食用及药用价值的新用途问题。
为了达到上述目的本发明是通过下述技术方案实现的。
一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法,其步骤如下:
(1)浸提:取高粱黑粉菌的脱脂粉与蒸馏水混合后,经NaOH溶液调节pH值、磁力搅拌得到粗提液;
(2)粗提物制备:取粗提液,采用HCl溶液调节pH值,静置8-12h,离心,收集沉淀,得粗提物;
(3)分离提纯:取粗提物,调节pH至7,透析袋中透析,于真空冷冻干燥机中冷冻干燥得高粱黑粉菌蛋白干燥粉末。
优选的,步骤(1)中高粱黑粉菌的脱脂粉制备方法如下:取鲜高粱黑粉菌去杂,60℃烘箱烘干,粉碎机粉碎,以料液比1:5与沸程60~90℃的石油醚混合分离油脂,通风厨中挥干,60目过筛,得到脱脂粉。
优选的,步骤(1)高粱黑粉菌脱脂粉与蒸馏水以1:10的质量比例进行混合,调节pH值为8.0。
优选的,步骤(1)中磁力搅拌是在室温条件下磁力搅拌30min,8000r/min离心10min。
优选的,步骤(1)中所述的NaOH溶液是质量百分比浓度为1mol/l的溶液。
优选的,步骤(2)调节pH值为4.6,离心转速为8000r/min,时间为10min。
优选的,步骤(2)中所述的HCl溶液是质量百分比浓度为1mol/l的溶液。
优选的,步骤(3)中所述的透析方法是4℃下、6~8KD透析袋中透析72h。
一种所述从高粱黑粉菌中分离出的蛋白在制备治疗具有降脂和减肥食品或药品上的应用。
由于采用上述技术方案,使得本发明具有如下特点和效果:
本发明提供了所述蛋白的制备方法,所述的蛋白通过促进肝脏AMPK磷酸化,干预脂代谢,降低血脂。经内外降脂实验证明,本发明提供的蛋白具有降低体脂含量、降低血清脂质水平和减轻体重的作用,对于开发新型的减肥、降血脂等天然食品和治疗药物具有重要意义。本发明的制备方法简单,成本低,提取纯度高,重现性好,可实现工业化生产,所述蛋白在制备降脂功能食品及药物方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1是高粱黑粉菌蛋白WM-P1纯化前后的纯度对比图。
图2是小鼠肝脏组织病理切片(HE染色,×200)空白组图。
图3是小鼠肝脏组织病理切片(HE染色,×200)模型组图。
图4是小鼠肝脏组织病理切片(HE染色,×200)低计量组图。
图5是小鼠肝脏组织病理切片(HE染色,×200)中剂量组图。
图6是小鼠肝脏组织病理切片(HE染色,×200)高剂量组图。
图7是小鼠血液中TC情况图。
图8是小鼠血液中TG情况图。
图9是小鼠血液中HDL情况图。
图10是小鼠血液中LDL情况图。
图11是高粱黑粉菌蛋白对小鼠肝脏中p-AMPK的影响图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行进一步说明。以下实施例仅为本发明的几个具体实施例,但本发明的设计构思并不局限于此,凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动,均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
下述实施例和试验例中的方法,如无特别说明,均为常规方法。
一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法,其步骤如下:
(1)浸提:取鲜高粱黑粉菌去杂,60℃烘箱烘干,粉碎机粉碎,以料液比1:5与沸程60~90℃的石油醚混合分离油脂,通风厨中挥干,60目过筛,得到脱脂粉,取100质量份高粱黑粉菌的脱脂粉与1000质量份蒸馏水混合后,经质量百分比浓度为1mol/lNaOH溶液调节pH值为8.0、在室温条件下磁力搅拌30min,8000r/min离心10min,到粗提液;
(2)粗提物制备:取粗提液,采用质量百分比浓度为1mol/lHCl溶液调节pH值为4.6,静置8-12h,离心转速为8000r/min,时间为10min,收集沉淀,得粗提物;
(3)分离提纯:取粗提物,调节pH至7,4℃下、6~8KD透析袋中透析72h,于真空冷冻干燥机中冷冻干燥得高粱黑粉菌蛋白干燥粉末。
本实施例从高粱黑粉菌中分离出的蛋白可以应用于制备治疗具有降脂和减肥食品或药品上。
以下通过试验数据进一步说明本发明的特点和效果,下述试验例中,未特殊说明的试验方法,均为常规方法。以下实施例所用蛋白均为本发明方法制备的蛋白。
试验例1
考马斯亮蓝法测蛋白含量试验
仪器:可见分光光度计,离心机,移液枪
样本制备:组织样品,称取约实施例0.03g高粱黑粉菌蛋白粉末,加入0.3ml提取液(蒸馏水),冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心10min,取上清液,即待测液。
将粗提液稀释到10倍再进行测定,设定波长为600nm,蒸馏水调零在EP管中依次加入,见表1。
表1主要试验试剂用量及配置方法表
组织样本:
蛋白含量(mg/g)=[(△A+0.0044)/8.3429]/(W×V1/V)×D=32.825mg/g
样本前处理:配制6mol/L HCl溶液称取大约0.4g高粱黑粉菌蛋白粉,向瓶中加入2ml 6mol/L的盐酸。将其放在干燥箱内,在110-120℃下水解24h,将水解液倒进蒸发皿中,放入沸水浴上加热以除去盐酸。再向蒸发皿内加入少量蒸馏水溶解残留物,继续在沸水浴上加热除去水分。
试验例2
纯化前后的蛋白采用测SDS-PAGE电泳谱,进行纯度分析。配制SDS浓度分别为12%和5%的分离胶与浓缩胶,取定量后的蛋白样品15-20μg,按照体积加入上样缓冲液、DTT、marker,用沸水煮3-10min,取上清进行电泳,至漠酪蓝指示剂跑至胶底,停止电泳。
由图1可以看出,纯化后的高粱黑粉菌蛋白WM-P1纯度可以达到80%以上,证明此方法可以获得较高纯度的高粱黑粉菌蛋白WM-P1。
试验例3
降脂活性评价
降脂活性测试,构建高脂诱导的C57BL/6小鼠的肥胖模型,通过观察及测量肝脏、肾脏及附睾脂肪组织的变化,计算小鼠体重、饮水量和饲料食用情况,结合各组小鼠体质指标、组织病理情况以及血液生化指标,探讨高粱黑粉菌蛋白WM-P1对小鼠肥胖的降脂作用。
本实验所用样品为上述提取到的高粱黑粉菌蛋白WM-P1。辽宁长生生物技术股份有限公司提供清洁级雄性C57BL/6小鼠,鼠龄在7-8周,体重18-20g,级别为SPF级。实验动物生产许可证号:SCXK(辽)2015-0001。小鼠在适宜的温湿条件室中保持12h光/暗循环,保证合适量的饲料和充足的水。所有小鼠在实验前要保证至少一周的时间适应环境条件。
40只SPF级雄性C57BL/6小鼠适应性饲喂一周后,随机分为5组:空白组、模型组、WM-P1低剂量组(10mg/kg)、WM-P1低剂量组(25mg/kg)和WM-P1高剂量组(50mg/kg),每组8只。饲养期间小鼠自由饮水,提供充足饲料,高脂饲料配方为70%普通饲料+15%猪油+15%蔗糖。每2d记录一次小鼠体重变化。
1、小鼠模型建立
高脂动物模型采用高脂饲料喂养,6w后当动物体重增加量高于实验前体重20%时,即视为肥胖小鼠造模成功。
表2小鼠体重变化情况
*与空白组比较P﹤0.05
#与模型组比较P﹤0.05
2、对小鼠体脂的影响
实验进行到第6周后的最后一天,采用活体动物体质分析仪EchoMRI-1100H检测各组小鼠的体脂肪、肌肉、自由水、总水含量。结果表明,高脂饮食小鼠的体脂肪含量显著高于空白组和样品组,而肌肉、自由水和总水无显著差异,推测体重差异可能由于脂肪含量不同引起的。样品组各项指标均与模型组有明显差异,计算其脂肪、肌肉、自由水、总水所占体重的百分比发现除脂肪含量有所差别外,其肌肉、自由水和总水含量无明显差异(P>0.05),说明样品组小鼠在体脂降低的同时其他机体指标并未受到明显影响。
表3小鼠体脂分析
注:各组间相比,同一行结果上标记字母不同表示组间具有显著性差异,P<0.05。
3、小鼠肝脏、肾脏和附睾脂肪的情况
完成体质实验后,当天各组小鼠进行麻醉(腹腔注射10%水合氯醛),然后摘眼球取血,全血室温静置30min后,在4℃下3500r/min离心15min,取上清血清存放于-80℃冰箱。小鼠采取颈椎脱臼处死,并取出完整的肝脏、肾脏和附睾脂肪组织。用滤纸清理干组织液后,称重并记录。
表4小鼠肝脏、肾脏和附睾脂肪的重量
注:各组间相比,同一行结果上标记字母不同表示组间具有显著性差异,P<0.05。
解剖结果显示,模型组小鼠由于脂肪的积累导致其肝脏和附睾脂肪重量显著高于其他两组,肾脏重量没有明显差异,说明高脂饮食主要增加肝脏及附睾脂肪的积累。
4、肝脏病理切片
由图2和图6可见,比较各组实验小鼠肝脏病理切片图,发现空白组的动物肝细胞未见任何病理改变,见图2;模型组,动物肝脏中央静脉周围可见大量肝细胞出现脂肪空泡变性,见图3;经低剂量组,高粱黑粉菌蛋白WM-P1处理后,动物肝细胞变性程度明显减轻,仅少量肝细胞存在空泡变性,见图4;经中剂量组,高粱黑粉菌蛋白WM-P1干预处理后,动物肝细胞仍有明显可见的脂肪空泡,见图5;高剂量组,高粱黑粉菌蛋白WM-P1处理组的动物肝细胞未见明显的空泡,见图6,结果表明,高粱黑粉菌蛋白WM-P1干预可以逆转实验动物肝细胞脂肪变性的状态,且呈浓度依赖性。
5、血清酶学检测
采用自动血液分析仪检测血常规项目。采用7180型日立自动生化分析仪及试剂盒检测TC、TG、HDL-C、LDL-C四个血液生化指标。
由图7和图8所示,小鼠血液中TC和TG情况。
与模型组相比,低剂量、中剂量和高剂量组高粱黑粉菌蛋白WM-P1的TC和TG水平显著降低(P<0.05)。可以推测,高粱黑粉菌蛋白WM-P1对高脂饮食导致的肥胖小鼠具有降低总胆固醇和降低总甘油三酯的作用,并且呈剂量依赖性。
由图9和图10所示,小鼠血液中HDL和LDL情况。
与模型组相比,低剂量、中剂量和高剂量组高粱黑粉菌蛋白WM-P1的HDL水平显著升高,而LDL水平显著降低(P<0.05),并且具有明显的剂量-效应关系。据此推测,低剂量、中剂量和高剂量组高粱黑粉菌蛋白WM-P1对高脂饮食导致的肥胖小鼠具有良好的胆固醇调节作用。
6肝脏组织的p-AMPK蛋白表达
如图11所示,灌胃6周后高粱黑粉菌蛋白WM-P1对小鼠肝脏糖异生关键蛋白酶p-AMPK蛋白表达量情况,与模型组相比,低剂量组、中剂量组合高剂量组的p-AMPK的含量能够显著的増加(P<0.05),即能够增加p-AMPK表达。实验证明,高粱黑粉菌蛋白WM-P1可在动物体内使AMPK磷酸化,激活AMPK,因此推测其可以干预肥胖小鼠的脂代谢。
Claims (9)
1.一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法,其特征在于步骤如下:
(1)浸提:取高粱黑粉菌的脱脂粉与蒸馏水混合后,经NaOH溶液调节pH值、磁力搅拌得到粗提液;
(2)粗提物制备:取粗提液,采用HCl溶液调节pH值,静置8-12h,离心,收集沉淀,得粗提物;
(3)分离提纯:取粗提物,调节pH至7,透析袋中透析,于真空冷冻干燥机中冷冻干燥得高粱黑粉菌蛋白干燥粉末。
2.根据权利要求1所述的一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法,其特征在于步骤(1)中高粱黑粉菌的脱脂粉制备方法如下:取鲜高粱黑粉菌去杂,60 °C烘箱烘干,粉碎机粉碎,以料液比1:5与沸程60~90°C的石油醚混合分离油脂,通风厨中挥干,60目过筛,得到脱脂粉。
3.根据权利要求1所述的一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法,其特征在于步骤(1)高粱黑粉菌脱脂粉与蒸馏水以1:10的质量比例进行混合,调节pH值为8.0。
4.根据权利要求1所述的一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法,其特征在于步骤(1)中磁力搅拌是在室温条件下磁力搅拌30 min,8000 r/min离心10 min。
5.根据权利要求1所述的一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法,其特征在于步骤(1)中所述的NaOH溶液是质量百分比浓度为1mol/L的溶液。
6.根据权利要求1所述的一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法,其特征在于步骤(2)调节pH值为4.6,离心转速为8000 r/min,时间为10 min。
7.根据权利要求1所述的一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法,其特征在于步骤(2)中所述的HCl溶液是质量百分比浓度为1mol/L的溶液。
8.根据权利要求1所述的一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法,其特征在于步骤(3)中所述的透析方法是4 °C下、6~8 KD透析袋中透析72 h。
9.一种权利要求1所述从高粱黑粉菌中分离出的蛋白在制备治疗具有降脂和减肥食品或药品上的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111072419.4A CN113768028B (zh) | 2021-09-14 | 2021-09-14 | 一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202111072419.4A CN113768028B (zh) | 2021-09-14 | 2021-09-14 | 一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113768028A true CN113768028A (zh) | 2021-12-10 |
CN113768028B CN113768028B (zh) | 2024-01-23 |
Family
ID=78843308
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111072419.4A Active CN113768028B (zh) | 2021-09-14 | 2021-09-14 | 一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113768028B (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114470011A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-05-13 | 延边大学 | 预防和/或治疗肠道及肝脏炎性损伤的产品、方法及应用 |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001328944A (ja) * | 2000-05-18 | 2001-11-27 | Naoyuki Nishizawa | 血液中の脂質濃度を低下させ、抗酸化機能を有するモロコシの抽出物 |
CN1620916A (zh) * | 2004-12-15 | 2005-06-01 | 辽宁省农业科学院食品与加工研究所 | 高粱黑粉真菌营养添加剂制备工艺及其产品 |
CN101250217A (zh) * | 2008-03-07 | 2008-08-27 | 中国计量学院 | 一种茭白总蛋白质的提取纯化方法 |
CN101744257A (zh) * | 2008-12-15 | 2010-06-23 | 沈阳市和平区高新技术企业创业服务中心 | 一种高粱黑粉真菌米肠 |
US20100247733A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-09-30 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety cv006790 |
CN103327827A (zh) * | 2010-11-26 | 2013-09-25 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 用于活性成分的保护性水胶体 |
WO2015042621A2 (en) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Bombom Alexander Jr | Methods for production of fertile putative intergeneric hybrid plants from sorghum and maize and/or maize and sorghum crosses |
CN105167185A (zh) * | 2015-07-28 | 2015-12-23 | 云南天宏香精香料有限公司 | 一种天然滤棒颗粒材料及其制备方法与应用 |
CN110117607A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-08-13 | 贵州大学 | 一种玉米黑粉菌效应蛋白Pit2基因的重组载体和表达方法 |
CN114470011A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-05-13 | 延边大学 | 预防和/或治疗肠道及肝脏炎性损伤的产品、方法及应用 |
-
2021
- 2021-09-14 CN CN202111072419.4A patent/CN113768028B/zh active Active
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001328944A (ja) * | 2000-05-18 | 2001-11-27 | Naoyuki Nishizawa | 血液中の脂質濃度を低下させ、抗酸化機能を有するモロコシの抽出物 |
CN1620916A (zh) * | 2004-12-15 | 2005-06-01 | 辽宁省农业科学院食品与加工研究所 | 高粱黑粉真菌营养添加剂制备工艺及其产品 |
CN101250217A (zh) * | 2008-03-07 | 2008-08-27 | 中国计量学院 | 一种茭白总蛋白质的提取纯化方法 |
CN101744257A (zh) * | 2008-12-15 | 2010-06-23 | 沈阳市和平区高新技术企业创业服务中心 | 一种高粱黑粉真菌米肠 |
US20100247733A1 (en) * | 2009-03-31 | 2010-09-30 | Monsanto Technology Llc | Plants and seeds of corn variety cv006790 |
CN103327827A (zh) * | 2010-11-26 | 2013-09-25 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 用于活性成分的保护性水胶体 |
WO2015042621A2 (en) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Bombom Alexander Jr | Methods for production of fertile putative intergeneric hybrid plants from sorghum and maize and/or maize and sorghum crosses |
CN105167185A (zh) * | 2015-07-28 | 2015-12-23 | 云南天宏香精香料有限公司 | 一种天然滤棒颗粒材料及其制备方法与应用 |
CN110117607A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-08-13 | 贵州大学 | 一种玉米黑粉菌效应蛋白Pit2基因的重组载体和表达方法 |
CN114470011A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-05-13 | 延边大学 | 预防和/或治疗肠道及肝脏炎性损伤的产品、方法及应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
VIRGINIA等: "Biochemical study of the extracellular aspartyl protease Eap1 from the phytopathogen fungus Sporisorium reilianum", PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION, pages 214 - 222 * |
赵欣锐: "高粱乌米活性肽的制备及其对RAW264.7细胞免疫调节作用", 工程科技Ⅰ辑, pages 18 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114470011A (zh) * | 2022-01-21 | 2022-05-13 | 延边大学 | 预防和/或治疗肠道及肝脏炎性损伤的产品、方法及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113768028B (zh) | 2024-01-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
TWI380823B (zh) | 脂聯素(Adiponectin)濃度上升劑 | |
AU2017337936A1 (en) | Novel Lactobacillus Sakei And Composition Comprising The Same | |
Lin et al. | Plasma lipid regulatory effect of compounded freshwater clam hydrolysate and Gracilaria insoluble dietary fibre | |
JP3644500B2 (ja) | キノコ乳酸発酵液の製造方法及びそれから製造されるキノコ乳酸発酵液(amethodforpreparingalacticacidfermentedsolutionofmushroomandlacticacidfermentedsolutionofmushroomproducedthereby) | |
TWI627959B (zh) | 羅伊氏乳桿菌GMNL-263 用於製備提升高油脂飲食者肝臟低密度脂蛋白受體與膽固醇7α-羥化酶基因表現之組合物之用途 | |
CN113768028B (zh) | 一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法及其应用 | |
EP2650005A2 (en) | Composition comprising fermented tea extracts for reducing lipid level | |
CN112979748B (zh) | 一种具有预防慢性酒精性肝损伤作用的活性肽 | |
JP2012526801A (ja) | 発酵茶抽出物を含有する血液循環改善用組成物、発酵茶抽出物を含む薬剤学的組成物及び健康食品組成物 | |
JP5344494B2 (ja) | 脂質代謝改善剤、機能性食品、食品添加物、抗酸化剤、医薬、動脈硬化予防・改善剤、香粧品、及び脂質代謝改善剤の製造方法 | |
CN114128890A (zh) | 营养补充性组合物 | |
CN101305766A (zh) | 一种活性山药蛋白粉及其制作方法 | |
JPH07284375A (ja) | イザリア型虫草を主成分とする免疫強化食品 | |
CN109771457A (zh) | 红菇提取物在制备治疗和/或预防高脂饮食致肝损伤相关疾病的制剂中的用途 | |
CN110074392A (zh) | 一种解酒保肝养胃护肠组合物及其制备方法 | |
CN109758485A (zh) | 红菇提取物在制备治疗和/或预防肠道菌群失调症及相关疾病的制剂中的用途 | |
KR101344055B1 (ko) | 더덕 추출물의 발효물을 유효성분으로 함유하는 간기능 개선용 조성물 | |
KR102501955B1 (ko) | 동과 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진용 조성물 | |
CN106173853B (zh) | 一种降血脂的营养组合物及其应用 | |
WO2021174801A1 (zh) | 一种牛樟芝水不溶性膳食纤维的制备方法 | |
CN111686139B (zh) | 一种松子壳水提物在降血脂类药物中的应用 | |
JP2002275087A (ja) | 抗糖尿病剤および糖尿病予防食品 | |
KR102470155B1 (ko) | 용쑥 및 서양민들레를 포함하는 체중 또는 체지방 감소용 경구용 조성물 | |
CN107712875A (zh) | 黑藜麦减肥代餐 | |
JP2010235517A (ja) | 生活習慣病予防材及びそれを用いた飲食品 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |