CN113755589A - 一种铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

一种铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用，其中，所述铂类代谢标志物包括ERCC1T354C、ERCC1C8092A、XRCC1A1196G三个位点的基因多态性，试剂盒针对ERCC1T354C、ERCC1C8092A、XRCC1A1196G的基因多态性设计特异性扩增引物和测序引物。本发明一方面采用提取扩增同管的方式，免去提取多次移管、核酸丢失风险；另一方面通过加入抗抑制剂进行快速恒温扩增；第三方面采用多重PCR扩增ERCC1T354C、ERCC1C8092A、XRCC1A1196G三个位点，同时一次反应进行三个位点的焦磷酸测序，以快速DNA制备、恒温PCR扩增和焦磷酸测序技术为组合对铂类疗效与不良反应预测的基因多态性进行检测，为临床个性化用药给出基因角度的建议。

Description

一种铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测 方法和应用
技术领域
本发明涉及一种铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用，属于基因检测领域。
背景技术
铂类药物是作用较强的抗肿瘤药物，广泛应用于肺癌、大肠癌、卵巢癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的治疗，取得了显著的疗效。铂类药物进人细胞后，与DNA结合形成加合物，造成DNA交联损伤，从而抑制细胞分裂，诱导细胞凋亡。铂类的药理作用不具有靶向性，在杀伤肿瘤细胞同时对机体正常细胞也会造成很大伤害，因此在临床应用中常导致严重的毒性反应，如神经毒性、肾毒性、胃肠毒性、骨髓抑制和耳毒性等。临床研究发现，在化疗方案与用药剂量相同的情况下，铂类化疗导致的毒性具有较大的个体差异，而这种差异在一定程度上与个体遗传多态性相关。
核苷酸切除修复途径DNA损伤修复在肿瘤的化疗耐药方面可能起着非常重要的作用，DNA损伤修复过程异常复杂，包括DNA损伤的识别、受损片段的切除、新DNA链的合成和新链DNA与母链的连接等。在人类细胞中，由化学药物造成的DNA损伤主要通过NER途径修复，且现己明确ERCCI基因是核苷酸切除修复的关键基因。ERCCI基因位于人类染色体19q13·2，编码由297个氨基酸组成的蛋白质。ERCCI的表达产物常与ERCC4(XPF)形成杂合二聚体ERCCI-XPF,该二聚体是一个特异性连接5端的核酸内切酶，具有损伤识别和切除5端的双重作用。研究中发现DNA损伤修复增强和ERCCI的高表达可能是导致顺铂耐药的主要原因，顺铂的细胞毒作用主要是形成Pt-DNA加合物，包括单加合物与链内交联，从而抑制DNA的复制及转录，导致DNA断裂和错误编码。若ERCC1低表达，机体核苷酸切除修复能力降低，细胞发生癌变的可能性将会增加；相反，若ERCC1过表达，则可使细胞停滞在G2/M期的DNA损伤迅速修复，从而降低肿瘤的发生。ERCC1基因多态性是ERCC1表达水平高低的主要影响因素。ERCC1基因多态性是ERCC1表达水平高低的主要影响因素。ERCC1(T354C/C8092A)多态性通过影响ERCC1基因mRNA的稳定性和翻译效率，导致不同基因型的ERCC1在肿瘤细胞中表达效率及高低不同,常见多态现象ERCC1(T354C)转变比未转变的病人更能显著降低ERCC1的表达水平，从而减弱ERCC1的活性，使ERCC1对铂类造成的DNA损伤的修复能力减弱。故携带有T碱基的患者对铂类的化疗反应更好。
XRCC1基因全称，X-ray repair complementing defective repairin Chinesehamster cells1，人类X射线交错互补修复基因1，位于第19号染色体19q13.2位置。XRCC1基因全长32.3kb，共有17个外显子，mRNA全长2,087nt，编码634个氨基酸残基组成的蛋白。XRCC1编码的蛋白对因电离辐射和烷基化物引起的DNA单链断裂能起到有效的修复作用，XRCC1作为重要的DNA损伤修复基因，与多种肿瘤以及铅中毒相关。XRCC1是DNA碱基切除修复中的关键基因，研究发现该基因编码区单核苷酸多态性与铂类药物敏感性密切相关。因此使用铂类药物前检测XRCC1基因多态性，可预测铂类药物的治疗效果，选择化疗治疗方案，提高生存率。XRCC1是DNA碱基切除修复中的关键基因，研究发现该基因编码区单核苷酸多态性与铂类药物敏感性密切相关。其中XRCC1的A1196G位点GG型患者对铂类药物的有效性是AG和AA型的2.7倍，患者总生存期明显延长。因此使用铂类药物前检测XRCC1基因多态性，可预测铂类药物的治疗效果，选择化疗治疗方案，提高生存率。
目前，基因多态性检测的方法有很多种，主要采用荧光PCR。主要包括高分辨率熔解曲线法、taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法。高分辨率熔解曲线法步骤简单，但特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增操作方法简单，但检测条件要求严格，实际操作中容易出现引物错配而产生假阳。taqman荧光探针法试验成本较高。
目前对血液DNA的获得方式主要有传统的柱式提取、磁珠法提取，此两种方法均耗时较久，操作较为繁琐。CN201610022581.8提出了一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法，将混合有磁珠的裂解液和待检测样品加入到PCR扩增管中，混匀，静置，进行磁吸后吸出混合液，将得到的磁珠洗涤一次；在上述PCR扩增管中加入配制好的PCR反应液，对目标核酸进行实时荧光定量PCR反应。该发明也同样需要对磁珠进行洗涤。因此，急需建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测基因多态性的焦磷酸测序方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒的技术方案如下：
所述铂类疗效与不良反应预测的基因多态性检测试剂盒针对ERCC1(T354C)、ERCC1(C8092A)、XRCC1(A1196G)的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、ERCC1(T354C)、ERCC1(C8092A)、XRCC1(A1196G)测序引物、阳性对照。
具体的，所述特异性引物序列如下表1所示：
Figure BDA0003255874860000031
优选的，所述ERCC1(T354C)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:2所示；所述ERCC1(C8092A)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示；所述XRCC1(A1196G)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。
优选的，所述的ERCC1(T354C)测序引物、ERCC1(C8092A)、XRCC1(A1196G)测序引物分别如序列表SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:9所示。
更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定。
优选的，ERCC1(T354C)测序引物对应的测序区域为ERCC1(T354C)待检序列，如序列表SEQ ID NO:10所示；ERCC1(C8092A)测序引物对应的测序区域为ERCC1(C8092A)待检序列，如序列表SEQ ID NO:11所示。XRCC1(A1196G)测序引物对应的测序区域为XRCC1(A1196G)待检序列，如序列表SEQ ID NO:12所示。
优选的，ERCC1(T354C)、ERCC1(C8092A)、XRCC1(A1196G)共用一个分配指令如序列表SEQ ID NO:13所示。SEQ ID NO:13中“ddC”表示ERCC1(T354C)测序反应最后一个加入碱基ddCTP，该碱基的加入可终止该测序反应。SEQ ID NO:13中“ddG”表示ERCC1(C8092A)测序反应最后一个加入碱基ddCTP，该碱基的加入可终止该测序反应，SEQ ID NO:13中“-”表示暂停试剂加入3min。该暂停期间会加入后续测序引物。
优选的，所述样本处理液，不包含胍盐，通过碱性条件和表面活性剂对样本进行裂解。包括0.1％-0.6％十二烷基硫酸锂、0.1-0.5％曲拉通X-100、2-50mg/mL氢氧化钠、5-15％海藻糖、3～7mmol/L BSA、20-80mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝8.5-9.5。
更优选的，所述样本处理液，包括0.3％-0.5％十二烷基硫酸锂、0.2-0.4％曲拉通X-100、10-20mg/mL氢氧化钠、8-12mM甜菜碱、8-12％海藻糖、4～6mM BSA、50mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝9。
优选的，所述的磁珠为羧基磁珠，粒径为600mm，悬浮性较好，磁性能较强，吸附量大。反应液中磁珠浓度为0.2mg/25μL，血液样本中DNA吸附量为30ng～260ng，完全满足扩增所需的DNA量。
优选的，所述的扩增试剂1包括：扩增缓冲液，15mM醋酸镁。
优选的，所述的扩增试剂2包括：ERCC1(T354C)前引物(0.32uM)，ERCC1(T354C)后引物(0.32uM)，ERCC1(C8092A)前引物(0.32uM)，ERCC1(C8092A)后引物(0.32uM)dNTPS(0.3mM)、XRCC1(A1196G)前引物(0.32uM)，XRCC1(A1196G)后引物(0.32uM)链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)。
更优选的，所述的扩增试剂2包括：海藻糖(0.2％)，10mM醋酸锰、0.1M山梨糖醇、5ug/mL BSA。海藻糖对生物活性物质具有非特异性保护作用，能提高DNA聚合酶热稳定性、降低DNA模板解链温度，减少G-C丰富区由于自身互补配对所形成的二级结构，因此提高PCR反应的特异性。山梨糖醇和醋酸锰具有PCR预混液稳定效应，同时在冷冻干燥过程中具有稳定作用。牛血清白蛋白能提高PCR反应的扩增效率并减少体系中PCR抑制物对反应的影响。
优选的，所述的反应体积为25ul，反应条件为：42℃30min。
优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的ERCC1(T354C)、ERCC1(C8092A)、XRCC1(A1196G)杂合型基因组DNA。阳性对照对应所检测基因位点的杂合型，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
本发明还公开了一种采用上述试剂盒的铂类疗效与不良反应预测的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
a.样本处理液100ul、4ul磁珠和30ulEDTA抗凝全血样本混合，室温静置5min；
b.将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
c.将配制好的PCR反应液加入到步骤b)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行恒温反应；
d.结合液(含微珠)与扩增产物进行结合；
e.变性液处理得到单链产物；
f.加入洗涤缓冲液漂洗；
g.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
h.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、ERCC1
(T354C)、ERCC1(C8092A)、XRCC1(A1196G)测序引物、ddGTP、ddCTP；
将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
i.焦磷酸测序。
本发明还公开了铂类疗效与不良反应预测的基因多态性检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒对ERCC1(T354C)、ERCC1(C8092A)、XRCC1(A1196G)进行检测，以从基因层面反应铂类疗效与不良反应预测，进一步为指导铂类剂量给出基因层面的建议。
与现有技术相比，本发明采用样本处理液快速样本释放出DNA，样本量为30ul全血，相比一步裂解法和直接扩增(约2-10ul)，可以得到足量的基因组DNA吸附在磁珠上供后续分析。通过将样本和裂解混合液移除可以去除大部分抑制物。DNA模板通过恒温PCR扩增ERCC1(T354C)、ERCC1(C8092A)、XRCC1(A1196G)基因位点，产生大量的生物素标记的单链DNA。生物素标记单链DNA与链霉亲和素结合，洗涤后加入测序引物和测序原料，进行焦磷酸测序，简化了测序流程和时间。本发明以快速DNA制备、恒温PCR扩增和焦磷酸测序技术为组合对铂类疗效与不良反应预测的基因多态性进行检测，为临床个性化用药给出基因角度的建议。
本发明的快速扩增方法主要从三方面进行了优化，一方面采用提取扩增同管的方式，免去提取多次移管、核酸丢失风险；另一方面通过加入抗抑制剂进行快速恒温扩增；第三方面采用多重PCR扩增ERCC1(T354C)、ERCC1(C8092A)、XRCC1(A1196G)三个位点，同时一次反应进行三个位点的焦磷酸测序。该测序首先加ERCC1(T354C)测序引物与测序原料进行焦磷酸测序，最后一个碱基加入ddCTP终止该测序反应。再加入ERCC1(C8092A)测序引物和进行测序，最后一个碱基加入ddGTP终止该测序反应。最后加入XRCC1(A1196G)测序引物进行dNTP测序，一次处理先后进行三个位点的测序，减少了操作的时间和提高了测序的通量。本发明的目的是以恒温PCR和焦磷酸检测为基础，获得铂类疗效与不良反应预测的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用。
附图说明
图1是本发明提供的ERCC1 354TC型、ERCC1 8092CA型、XRCC1 1196AG型焦磷酸检测结果示例图；
图2是本发明提供的ERCC1 354TT型、ERCC1 8092CC型、XRCC1 1196AA型焦磷酸检测结果示例图；
图3是本发明提供的ERCC1 354TT型、ERCC1 8092CC型、XRCC1 1196GG型焦磷酸检测结果示例图；
图4是本发明提供的ERCC1 354TC型、ERCC1 8092AA型、XRCC1 1196AA型焦磷酸检测结果示例图；
图5是本发明提供的ERCC1 354CC型、ERCC1 8092CA型、XRCC1 1196AA型焦磷酸检测结果示例图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
实施例1、试剂盒的制备
(一)特异性引物设计
本发明的试剂盒针对ERCC1(T354C)、ERCC1(C8092A)、XRCC1(A1196G)基因多态性设计了特异性扩增引物和测序引物，用于焦磷酸PCR检测。基因多态性序列以Genebank内的公开序列为准，引物序列如下表1所示。
表1引物序列表
Figure BDA0003255874860000071
(二)试剂盒组成
检测试剂盒包括如下表2所示的组分：
表2试剂盒组分表
Figure BDA0003255874860000072
Figure BDA0003255874860000081
(三)样本处理液配置体系如下：
样本处理液，包括0.4％十二烷基硫酸锂、0.3％曲拉通X-100、15mg/mL氢氧化钠、10mM甜菜碱、10％海藻糖、5mM BSA、50mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝9。
(四)本实施例的检测试剂盒扩增试剂1单人份配置体系如下：
成分 体积(ul)
扩增缓冲液 24
200mM醋酸镁 1
(五)本实施例的检测试剂盒扩增试剂2单人份配置体系如下：
ERCC1(T354C)前引物(0.32uM)，ERCC1(T354C)后引物(0.32uM)，ERCC1(C8092A)前引物(0.32uM)，ERCC1(C8092A)后引物(0.32uM)dNTPS(0.3mM)、XRCC1(A1196G)前引物(0.32uM)，XRCC1(A1196G)后引物(0.32uM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)，海藻糖(0.2％)，10mM醋酸锰、0.1M山梨糖醇、5ug/mL BSA。PCR体系如表3所示：
表3 PCR体系表
Figure BDA0003255874860000082
Figure BDA0003255874860000091
配置完成后98ul/管进行分装、冻干。
实施例2、试剂盒检测步骤
本发明中采用的仪器如下：恒温仪，焦磷酸测序仪(武汉菲思特生物科技有限公司)。
1)取30μL EDTA抗凝全血样品于PCR扩增管中；
2)加入100μL样本处理液和4ul磁珠，静置5min；
3)将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
4)将扩增试剂1加入扩增试剂2干粉中，充分溶解混匀；
5)将配制好的PCR反应液加入25ul到步骤4)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行恒温反应；
6)采用PCR仪进行扩增，反应体系为25μL，扩增条件：
扩增温度 时间 循环数
42℃ 30min 1
7)在PCR反应管中加入结合液40μL和琼脂糖凝胶颗粒3ul，再向其中加入PCR产物20μL，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使微珠和PCR产物充分结合；
8)7,000×g离心1min，弃上清；
9)加入22uL稀释后的变性液工作液，静置5min，7,000×g离心1min，EP管
收集得到单链产物；
10)向EP管中加入150uL洗涤缓冲液，7,000×g离心1min(重复3次)；
11)将EP管中的单链产物转移至测序管中，向每个测序管中加入3uL测序酶
和3uL测序底物；
12)测序管中分别加入3uL测序酶和3uL测序底物；
13)取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、、ERCC1(T354C)测序引物、ERCC1(C8092A)测序引物、XRCC1(A1196G)测序引物、ddGTP、ddCTP；将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
14)焦磷酸测序；测序结果如图1～5所示。
15)结果判读
1)有效性判定：
本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品的检出结果为ERCC1(T354C)、ERCC1(C8092A)、XRCC1(A1196G)杂合突变型。
2)结果判定标准
ERCC1(T354C)的DNA测序峰值图中，
T的频率≧90％，C的频率≦10％，即为TT型；
40％≦T的频率≦60％，40％≦C的频率≦60％，即为TC型；
C的频率≧90％，T的频率≦10％，即为CC型；
ERCC1(C8092A)的DNA测序峰值图中，
C的频率≧90％，A的频率≦10％，即为CC型；
40％≦C的频率≦60％，40％≦A的频率≦60％，即为CA型；
A的频率≧90％，C的频率≦10％，即为AA型；
XRCC1(A1196G)的DNA测序峰值图中为反序列，
T的频率≧90％，C的频率≦10％，即为AA型；
40％≦T的频率≦60％，40％≦C的频率≦60％，即为AG型；
C的频率≧90％，T的频率≦10％，即为GG型；
16)基因检测结果与铂类疗效与不良反应预测相关性表
基因位点 药物关系
ERCC1(T354C) TT型铂类的化疗反应较好
ERCC1(C8092A) CC型铂类的化疗反应较好
XRCC1(A1196G) GG型患者对铂类药物的有效性较高
五、试剂盒的性能测试结果
5.1.特异性
对特异性样本(包括非人类DNA模板和人类同一基因不同位点或同源性位点扩增产物稀释物)进行检测，结果为阴性。
5.2.准确性
对试剂盒范围内的不同基因型的参考品(包括ERCC1(T354C)、ERCC1(C8092A)、XRCC1(A1196G)野生、杂合、突变三种基因型)进行检测，应均能检出相应基因型。
5.3.最低检出限
最低检出限应不高于2ng/ul。
5.4.重复性
检测试剂盒范围内的不同基因型的重复性参考品，每个参考品进行10次检测，结果应均为相应突变类型，且相应检测通道的Ct值的变异系数(CV)应≤5.0％。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Figure BDA0003255874860000121
Figure BDA0003255874860000131
Figure BDA0003255874860000141
Figure BDA0003255874860000151
Figure BDA0003255874860000161
Figure BDA0003255874860000171
序列表
<110> 上海普然生物科技有限公司
<120> 一种铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 1
tcaagggtca tccctattga tggcttctgc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 2
gggcacaggt gctctggccc agcacatagt 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 3
tgggggtgtc accttctggt ggcccaggtg 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 4
aagaggagat gccagggccg ccactgaatt 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 5
ctttgccaac acccccaagt acagccaggt 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 6
caggccccag tctgactccc ctccagattc 30
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(15)
<400> 7
ctgaagttcg tgcgc 15
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(15)
<400> 8
gggacaagaa gcgga 15
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(16)
<400> 9
cgtgtgaggc cttacc 16
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(28)
<400> 10
aaygtgccct gggaatttgg cgacgtaa 28
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(28)
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<400> 11
agnagcagca gcagcagcct gtgtagtc 28
<210> 12
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(28)
<400> 12
tcygggaggg cagccgccga cgcatgcg 28
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 13
gactgtgddc cagctagcad dggtctgagc 30

Claims (10)

1.一种铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述铂类代谢标志物包括ERCC1 T354C、ERCC1 C8092A、XRCC1 A1196G三个位点的基因多态性，试剂盒针对ERCC1 T354C、ERCC1 C8092A、XRCC1 A1196G的基因多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、ERCC1 T354C、ERCC1 C8092A、XRCC1 A1196G测序引物和阳性对照。
2.根据权利要求1所述的铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述ERCC1 T354C的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示；所述ERCC1 C8092A的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示；所述XRCC1A1196G的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。
3.根据权利要求1所述的铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述ERCC1 T354C测序引物、ERCC1 C8092A、XRCC1 A1196G测序引物分别如序列表SEQ IDNO:7～SEQ ID NO:9所示。
4.根据权利要求1所述的铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，ERCC1 T354C、ERCC1 C8092A、XRCC1 A1196G共用一个分配指令如序列表SEQ ID NO:13所示。
5.根据权利要求1所述的铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述样本处理液包括0.1％-0.6％十二烷基硫酸锂、0.1-0.5％曲拉通X-100、2-50mg/mL氢氧化钠、5-15％海藻糖、3～7mmol/L BSA、20-80mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝8.5-9.5。
6.根据权利要求1所述的铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠为羧基磁珠，粒径为600mm。
7.根据权利要求1所述的铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂1包括：扩增缓冲液，15mM醋酸镁。
8.根据权利要求1所述的铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂2包括：ERCC1 T354C前引物0.32uM，ERCC1 T354C后引物0.32uM，ERCC1C8092A前引物0.32uM，ERCC1 C8092A后引物0.32uMdNTPS 0.3mM、XRCC1 A1196G前引物0.32uM，XRCC1 A1196G后引物0.32uM链置换DNA聚合酶1.2ng/μL，单链DNA结合蛋白3.2ng/μL，结合单链核酸的重组酶4.8ng/μL。
9.一种采用根据权利要求1～8任一项所述的铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
a.样本处理液100ul、4ul磁珠和30ulEDTA抗凝全血样本混合，室温静置5min；
b.将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
c.将配制好的PCR反应液加入到步骤b)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行恒温反应；
d.将含微珠的结合液与扩增产物进行结合；
e.变性液处理得到单链产物；
f.加入洗涤缓冲液漂洗；
g.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
h.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、ERCC1T354C、ERCC1 C8092A、XRCC1 A1196G测序引物、ddGTP、ddCTP；
i.焦磷酸测序。
10.一种根据权利要求1～9任一项所述的铂类药物代谢标志物的基因多态性检测试剂盒及其检测方法的应用，其特征在于，所述检测试剂盒及其检测方法用于同时检测ERCC1T354C、ERCC1 C8092A、XRCC1 A1196G的基因多态性。
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