CN113699227A - 一种异烟肼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种异烟肼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法，其中，所述检测试剂盒针对异烟肼代谢标志物NAT2*6、NAT2*7和NAT2*5的基因多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、NAT2*6、NAT2*7和NAT2*5测序引物和阳性对照。本发明的快速扩增方法主要从三方面进行了优化，一方面采用提取扩增同管的方式，免去提取多次移管、核酸丢失风险；另一方面通过加入抗抑制剂进行快速恒温扩增；第三方面同时一次反应进行三个位点的焦磷酸测序，本发明对异烟肼不良反应风险预测的基因多态性进行检测，为临床个性化用药给出基因角度的建议。

Description

一种异烟肼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种异烟肼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法，属于基因检测领域。
背景技术
异烟肼(Isonlazicl，INH)属于小分子药物，它是治疗结核病的核心药物之一，与利福平(RMP)、吡嗪酰胺(PZA)和乙胺丁醇(EMB)合用一直是WHO推荐的初治标准方案。然而，INH在体内的代谢却有着非常明显的个体化差异。异烟肼推荐的血药浓度范围比较窄(2～5mg·L-1)，在使用它的过程中，浓度过低会导致疗效不佳；浓度过高可能会出现药物性肝损害(DILI)。异烟肼作为抗结核一线药物，它的肝损伤作用受到广泛的重视。临床使用过程中异烟肼可致20％患者出现肝功能改变，1-2％的患者出现严重肝损伤。有证据表明，INH血药浓度与药效、不良反应存在关系。在INH剂量相同的情况下，个体间INH血药浓度仍有非常显著的差异，有人发现，服用INH后2h血药浓度差异可达100-200倍。异烟肼在体内的浓度主要由乙酰化的速率决定，N-乙酰化酶(NAT)可能是决定乙酰化速率的关键因素之一。NAT2代谢能力存在多态性，多态性的存在使INH及其代谢物的血药浓度存在着显著差异，从而决定了是否发生肝损伤等不良反应。
N-乙酰基转移酶是一种II相药物代谢酶，催化多种药物的乙酰化代谢。人类有两个编码N-乙酰基转移酶的基因，分别是NAT1和NAT2，NAT2仅表达于肝脏和肠道，参与异烟肼、普鲁卡因胺、磺胺等20多种肼类化合物的乙酰化代谢。人群中N-乙酰基转移酶活性呈多态分布，根据乙酰化表型的不同将人群划分为三类：慢型乙酰化代谢者、快型乙酰化代谢者和中间型乙酰化代谢者。亚洲人中慢型乙酰化代谢者的发生率为10～30％。NAT2基因也具有高度多态性。NAT2基因多态性通过降低酶的稳定性、改变酶与底物亲和力以及促使蛋白酶降解等方式影响NAT2的功能。目前FDA已将NAT2列为异烟肼个体化用药的基因组标记物，推荐在使用异烟肼前对NAT2基因型进行检测。建议降低NAT2慢代谢型(携带两个慢代谢型等位基因或单倍型)个体异烟肼的用药剂量以预防蓄积中毒和周围神经炎；中间代谢型(携带一个慢代谢型等位基因和一个快代谢型等位基因)和快代谢型(具有两个快代谢型等位基因)患者可常规使用异烟肼进行治疗。
目前，基因多态性检测的方法有很多种，主要采用荧光PCR。主要包括高分辨率熔解曲线法、taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法。高分辨率熔解曲线法步骤简单，但特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增操作方法简单，但检测条件要求严格，实际操作中容易出现引物错配而产生假阳，taqman荧光探针法试验成本较高。目前对血液DNA的获得方式主要有传统的柱式提取、磁珠法提取，此两种方法均耗时较久，操作较为繁琐。CN201610022581.8提出了一种在一管中进行磁珠提取核酸与扩增的实时荧光定量PCR方法，将混合有磁珠的裂解液和待检测样品加入到PCR扩增管中，混匀，静置，进行磁吸后吸出混合液，将得到的磁珠洗涤一次；在上述PCR扩增管中加入配制好的PCR反应液，对目标核酸进行实时荧光定量PCR反应。该发明也同样需要对磁珠进行洗涤。因此，简化检测步骤，提高检测效率的基因多态检测试剂盒是十分有必要的。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是获得一种异烟肼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的异烟肼代谢标志物检测试剂盒的技术方案如下：
所述异烟肼不良反应风险预测的基因多态性检测试剂盒针对NAT2*6(G590A)、NAT2*7(G857A)、NAT2*5(T341C)的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、NAT2*6(G590A)、NAT2*7(G857A)、NAT2*5(T341C)测序引物、阳性对照。
具体的，所述特异性引物序列如下表1所示：
Figure BDA0003251891170000021
Figure BDA0003251891170000031
优选的，所述NAT2*6(G590A)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ IDNO:2所示；所述NAT2*7(G857A)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示；所述NAT2*5(T341C)的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。
优选的，所述的NAT2*6(G590A)测序引物、NAT2*7(G857A)、NAT2*5(T341C)测序引物分别如序列表SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:9所示。
更优选的，所述的测序引物，为核酸类似物，其骨架为肽键而非磷酸二酯键，肽键骨架连有相应的碱基。该结构具有生物学性质稳定，无论蛋白酶还是核酸酶都不易将其降解。与DNA结合较DNA/DNA的结合更为稳定。
优选的，NAT2*6(G590A)测序引物对应的测序区域为NAT2*6(G590A)待检序列，如序列表SEQ ID NO:10所示；NAT2*7(G857A)测序引物对应的测序区域为NAT2*7(G857A)待检序列，如序列表SEQ ID NO:11所示；NAT2*5(T341C)测序引物对应的测序区域为NAT2*5(T341C)待检序列，如序列表SEQ ID NO:12所示。
优选的，NAT2*6(G590A)、NAT2*7(G857A)、NAT2*5(T341C)共用一个分配指令如序列表SEQ ID NO:13所示。SEQ ID NO:13中“ddG”表示NAT2*6(G590A)测序反应最后一个加入碱基ddGTP，该碱基的加入可终止该测序反应。SEQ ID NO:13中“ddC”表示NAT2*7(G857A)测序反应最后一个加入碱基ddCTP，该碱基的加入可终止该测序反应，SEQ ID NO:13中“-”表示暂停试剂加入3min。该暂停期间会加入后续测序引物。
优选的，所述样本处理液，不包含胍盐，通过碱性条件和表面活性剂对样本进行裂解。包括0.1％-0.6％十二烷基硫酸锂、0.1-0.5％曲拉通X-100、2-50mg/mL氢氧化钠、5-15％海藻糖、3～7mmol/L BSA、20-80mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝8.5-9.5。
更优选的，所述样本处理液，包括0.3％-0.5％十二烷基硫酸锂、0.2-0.4％曲拉通X-100、10-20mg/mL氢氧化钠、8-12mM甜菜碱、8-12％海藻糖、4～6mM BSA、50mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝9。
优选的，所述的磁珠为羧基磁珠，粒径为600mm，悬浮性较好，磁性能较强，吸附量大。反应液中磁珠浓度为0.2mg/25μL，血液样本中DNA吸附量为30ng～260ng，完全满足扩增所需的DNA量。
优选的，所述的扩增试剂1包括：扩增缓冲液，15mM醋酸镁。
优选的，所述的扩增试剂2包括：NAT2*6(G590A)前引物(0.32uM)、NAT2*6(G590A)后引物(0.32uM)，NAT2*7(G857A)前引物(0.32uM)、NAT2*7(G857A)后引物(0.32uM)，NAT2*5(T341C)前引物(0.32uM)、NAT2*5(T341C)后引物(0.32uM)，dNTPS(0.3mM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)。
更优选的，所述的扩增试剂2包括：海藻糖(0.2％)，10mM醋酸锰、0.1M山梨糖醇、5ug/mL BSA。海藻糖对生物活性物质具有非特异性保护作用，能提高DNA聚合酶热稳定性、降低DNA模板解链温度，减少G-C丰富区由于自身互补配对所形成的二级结构，因此提高PCR反应的特异性。山梨糖醇和醋酸锰具有PCR预混液稳定效应，同时在冷冻干燥过程中具有稳定作用。牛血清白蛋白能提高PCR反应的扩增效率并减少体系中PCR抑制物对反应的影响。
优选的，所述的反应体积为25ul，反应条件为：42℃30min。
优选的，所述的阳性对照，包括浓度为20ng/ul的NAT2*6(G590A)、NAT2*7(G857A)、NAT2*5(T341C)杂合型基因组DNA。阳性对照对应所检测基因位点的杂合型，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
本发明还公开了一种采用上述试剂盒的异烟肼不良反应风险预测的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
a.样本处理液100ul、4ul磁珠和30ulEDTA抗凝全血样本混合，室温静置5min；
b.将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
c.将配制好的PCR反应液加入到步骤b)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行恒温反应；
d.结合液(含微珠)与扩增产物进行结合；
e.变性液处理得到单链产物；
f.加入洗涤缓冲液漂洗；
g.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
h.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、NAT2*6(G590A)、NAT2*7(G857A)、NAT2*5(T341C)测序引物、ddCTP、ddGTP，将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
i.焦磷酸测序。
本发明还公开了异烟肼不良反应风险预测的基因多态性检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒对NAT2*6(G590A)、NAT2*7(G857A)、NAT2*5(T341C)进行检测，以从基因层面反应异烟肼不良反应风险，进一步为指导异烟肼剂量给出基因层面的建议。
与现有技术相比，本发明的快速扩增方法主要从三方面进行了优化，一方面采用提取扩增同管的方式，免去提取多次移管、核酸丢失风险；另一方面通过加入抗抑制剂进行快速恒温扩增；第三方面同时一次反应进行三个位点的焦磷酸测序。该测序首先加NAT2*6(G590A)测序引物与测序原料进行焦磷酸测序，最后一个碱基加入ddGTP终止该测序反应。再加入NAT2*7(G857A)测序引物和进行测序，最后一个碱基加入ddCTP终止该测序反应。最后加入NAT2*5(T341C)测序引物进行dNTP测序，一次处理先后进行三个位点的测序，减少了操作的时间和提高了测序的通量。本发明的目的是以恒温PCR和焦磷酸检测为基础，获得异烟肼不良反应风险预测的基因多态性检测试剂盒及其应用。
本发明建立了一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测IRS-1基因多态性的焦磷酸测序方法。样本处理液快速样本释放出DNA，样本量为30ul全血，相比一步裂解法和直接扩增(约2-10ul)，可以得到足量的基因组DNA吸附在磁珠上供后续分析。通过将样本和裂解混合液移除可以去除大部分抑制物。DNA模板通过恒温PCR扩增NAT2*6(G590A)、NAT2*7(G857A)、NAT2*5(T341C)基因位点，产生大量的生物素标记的单链DNA。生物素标记单链DNA与链霉亲和素结合，洗涤后加入测序引物和测序原料，进行焦磷酸测序，简化了测序流程和时间。本发明以快速DNA制备、恒温PCR扩增和焦磷酸测序技术为组合对异烟肼不良反应风险预测的基因多态性进行检测，为临床个性化用药给出基因角度的建议。
附图说明
图1是本发明提供的NAT2*6(590GA)、NAT2*7(857GA)、NAT2*5(341TC)焦磷酸检测结果示例图；
图2是本发明提供的NAT2*6(590GG)、NAT2*7(857GG)、NAT2*5(341TT)焦磷酸检测结果示例图；
图3是本发明提供的NAT2*6(590GG)、NAT2*7(857GG)、NAT2*5(341CC)焦磷酸检测结果示例图；
图4是本发明提供的NAT2*6(590GG)、NAT2*7(857AA)、NAT2*5(341TT)焦磷酸检测结果示例图；
图5是本发明提供的NAT2*6(590AA)、NAT2*7(857GG)、NAT2*5(341TT)焦磷酸检测结果示例图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的异烟肼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
(一)特异性引物设计
本发明的试剂盒针对NAT2*6(G590A)、NAT2*7(G857A)、NAT2*5(T341C)基因多态性设计了特异性扩增引物和测序引物，用于焦磷酸PCR检测。基因多态性序列以Genebank内的公开序列为准，引物序列如下表1所示。
表1引物序列表
Figure BDA0003251891170000071
(二)试剂盒组成
检测试剂盒包括如下表2所示的组分：
表2试剂盒组分表
Figure BDA0003251891170000072
Figure BDA0003251891170000081
(三)样本处理液配置体系如下：
样本处理液，包括0.4％十二烷基硫酸锂、0.3％曲拉通X-100、15mg/mL氢氧化钠、10mM甜菜碱、10％海藻糖、5mM BSA、50mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝9。
(四)本实施例的检测试剂盒扩增试剂1单人份配置体系如下：
成分 体积(ul)
扩增缓冲液 24
200mM醋酸镁 1
(五)本实施例的检测试剂盒扩增试剂2单人份配置体系如下：
NAT2*6(G590A)前引物(0.32uM)，NAT2*6(G590A)后引物(0.32uM)，NAT2*7(G857A)前引物(0.32uM)，NAT2*7(G857A)后引物(0.32uM)、NAT2*5(T341C)前引物(0.32uM)，NAT2*5(T341C)后引物(0.32uM)、dNTPS(0.3mM)、链置换DNA聚合酶(1.2ng/μL)，单链DNA结合蛋白(3.2ng/μL)，结合单链核酸的重组酶(4.8ng/μL)，海藻糖(0.2％)，10mM醋酸锰、0.1M山梨糖醇、5ug/mL BSA。PCR体系如表3所示：
表3 PCR体系表
Figure BDA0003251891170000082
Figure BDA0003251891170000091
配置完成后72ul/管进行分装、冻干。
实施例2、试剂盒检测步骤
本发明中采用的仪器如下：恒温仪，焦磷酸测序仪(武汉菲思特生物科技有限公司)。
1)取30μL EDTA抗凝全血样品于PCR扩增管中；
2)加入100μL样本处理液和4ul磁珠，静置5min；
3)将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
4)将扩增试剂1加入扩增试剂2干粉中，充分溶解混匀；
5)将配制好的PCR反应液加入25ul到步骤4)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行恒温反应；
6)采用PCR仪进行扩增，反应体系为25μL，扩增条件：
扩增温度 时间 循环数
42℃ 30min 1
7)在PCR反应管中加入结合液40μL和琼脂糖凝胶颗粒3ul，再向其中加入PCR产物20μL，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使微珠和PCR产物充分结合；
8)7,000×g离心1min，弃上清；
9)加入22uL稀释后的变性液工作液，静置5min，7,000×g离心1min，EP管收集得到单链产物；
10)向EP管中加入150uL洗涤缓冲液，7,000×g离心1min(重复3次)；
11)将EP管中的单链产物转移至测序管中，向每个测序管中加入3uL测序酶和3uL测序底物；
12)测序管中分别加入3uL测序酶和3uL测序底物；
13)取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、、NAT2*6(G590A)测序引物、NAT2*7(G857A)测序引物、NAT2*5(T341C)测序引物、ddGTP、ddCTP。将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
14)焦磷酸测序；
15)结果判读，测序结果如图1～5所示。
i.有效性判定：
本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品的检出结果为NAT2*6(G590A)、NAT2*7(G857A)、NAT2*5(T341C)杂合突变型。
ii.结果判定标准
NAT2*6(G590A)的DNA测序峰值图中，
G的频率≧90％，A的频率≦10％，即为GG型；
40％≦G的频率≦60％，40％≦A的频率≦60％，即为GA型；
A的频率≧90％，G的频率≦10％，即为AA型；
NAT2*7(G857A)的DNA测序峰值图中，
G的频率≧90％，A的频率≦10％，即为GG型；
40％≦G的频率≦60％，40％≦A的频率≦60％，即为GA型；
A的频率≧90％，G的频率≦10％，即为AA型；
NAT2*5(T341C)的DNA测序峰值图中，
T的频率≧90％，C的频率≦10％，即为TT型；
40％≦T的频率≦60％，40％≦C的频率≦60％，即为TC型；
C的频率≧90％，T的频率≦10％，即为CC型。
16)基因检测结果与异烟肼不良反应风险预测相关性
目前FDA已将NAT2列为异烟肼个体化用药的基因组标记物，推荐在使用异烟肼前对NAT2基因型进行检测。建议降低NAT2慢代谢型(携带两个慢代谢型等位基因或单倍型)个体异烟肼的用药剂量以预防蓄积中毒和周围神经炎；中间代谢型(携带一个慢代谢型等位基因和一个快代谢型等位基因)和正常代谢型患者可常规使用异烟肼进行治疗。NAT2(T341C)TT、NAT2*6(G590A)GG、NAT2*7(G857A)GG为正常代谢型等位基因。
五、试剂盒的性能测试结果
5.1.特异性
对特异性样本(包括非人类DNA模板和人类同一基因不同位点或同源性位点扩增产物稀释物)进行检测，结果为阴性。
5.2.准确性
对试剂盒范围内的不同基因型的参考品(包括NAT2*6(G590A)、NAT2*7(G857A)、NAT2*5(T341C)野生、杂合、突变三种基因型)进行检测，应均能检出相应基因型。
5.3.最低检出限
最低检出限应不高于2ng/ul。
5.4.重复性
检测试剂盒范围内的不同基因型的重复性参考品，每个参考品进行10次检测，结果应均为相应突变类型，且相应检测通道的Ct值的变异系数(CV)应≤5.0％。
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Figure BDA0003251891170000121
Figure BDA0003251891170000131
Figure BDA0003251891170000141
Figure BDA0003251891170000151
Figure BDA0003251891170000161
Figure BDA0003251891170000171
序列表
<110> 菲思特（上海）生物科技有限公司
<120> 一种异烟肼代谢标志物检测试剂盒及其检测方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 1
gcctcaggtg ccttgcattt tctgcttgac 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 2
gtgaggatga agcccaccaa acagtaaacc 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 3
tgtttggtgg gcttcatcct cacctataga 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 4
aaataacgtg agggtagaga ggatatctga 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 5
cagttaacaa atacagcact ggcatggttc 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(30)
<400> 6
tctcctgatt tggtccaggt accagattcc 30
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(18)
<400> 7
ttatttacgc ttgaacct 18
<210> 8
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(15)
<400> 8
cccaaacctg gtgat 15
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(16)
<400> 9
aatgtaattc ctgccg 16
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(27)
<400> 10
craacaattg aagattttga gtctatg 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(27)
<400> 11
gratccctta ctatttagaa taaggaa 27
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(29)
<400> 12
tcartggtca cctgcaggag aaggtgaac 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(29)
<400> 13
tcgacatddg cgatctaddc ctgcagtgt 29

Claims (10)

1.一种异烟肼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒针对异烟肼代谢标志物NAT2*6、NAT2*7和NAT2*5的基因多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液、磁珠、扩增试剂1、扩增试剂2、NAT2*6、NAT2*7和NAT2*5测序引物和阳性对照。
2.根据权利要求1所述的异烟肼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述NAT2*6的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:2所示；所述NAT2*7的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:3～SEQ ID NO:4所示；所述NAT2*5的特异性引物组序列如序列表SEQ ID NO:5～SEQ ID NO:6所示。
3.根据权利要求1所述的异烟肼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述NAT2*6测序引物、NAT2*7测序引物、NAT2*5测序引物分别如序列表SEQ ID NO:7～SEQ ID NO:9所示。
4.根据权利要求1所述的异烟肼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述NAT2*6测序引物对应的测序区域为NAT2*6待检序列，如序列表SEQ ID NO:10所示；NAT2*7测序引物对应的测序区域为NAT2*7待检序列，如序列表SEQ ID NO:11所示；NAT2*5测序引物对应的测序区域为NAT2*5待检序列，如序列表SEQ ID NO:12所示。
5.根据权利要求1所述的异烟肼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，NAT2*6、NAT2*7、NAT2*5共用一个分配指令如序列表SEQ ID NO:13所示。
6.根据权利要求1所述的异烟肼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述样本处理液包括0.1％-0.6％十二烷基硫酸锂、0.1-0.5％曲拉通X-100、2-50mg/mL氢氧化钠、5-15％海藻糖、3～7mmol/L BSA、20-80mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝8.5-9.5。
7.根据权利要求1所述的异烟肼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述的扩增试剂1包括：扩增缓冲液，15mM醋酸镁。
8.根据权利要求1所述的异烟肼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述的扩增试剂2包括：NAT2*6前引物0.32uM、NAT2*6后引物0.32uM，NAT2*7前引物0.32uM、NAT2*7后引物0.32uM，NAT2*5前引物0.32uM、NAT2*5后引物0.32uM，dNTPS 0.3mM、链置换DNA聚合酶1.2ng/μL，单链DNA结合蛋白3.2ng/μL，结合单链核酸的重组酶4.8ng/μL。
9.根据权利要求1所述的异烟肼代谢标志物检测试剂盒，其特征在于，所述的扩增试剂2还包括：0.2％的海藻糖，10mM醋酸锰，0.1M山梨糖醇和5ug/mL BSA。
10.一种根据权利要求1～9任一项所述的异烟肼代谢标志物检测试剂盒的其检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
a.样本处理液100ul、4ul磁珠和30ulEDTA抗凝全血样本混合，室温静置5min；
b.将所述PCR扩增管放置在磁力架上，待磁珠全部吸附至一侧后从磁珠对侧将混合液吸出；
c.将配制好的PCR反应液加入到步骤b)得到的PCR扩增管中，使磁珠与所述PCR反应液充分混匀，离心，进行恒温反应；
d.将含微珠的结合液与扩增产物进行结合；
e.变性液处理得到单链产物；
f.加入洗涤缓冲液漂洗；
g.向每个测序管中加入测序酶和测序底物；
h.取一个8排管，自圆滑一端向平端依次加入dATP、dTTP、dGTP、dCTP、NAT2*6、NAT2*7、NAT2*5测序引物、ddCTP、ddGTP；
i.焦磷酸测序。
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