CN113754791A - 一种白及多糖物质及其制备方法与应用 - Google Patents

一种白及多糖物质及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种白及多糖物质及其制备方法与应用，属于化妆品技术领域。其制备可包括以下步骤：用低元醇对白及鳞茎进行回流提取，将回流提取液经固液分离后得到的固相物与复合酶和水共同酶解提取，将酶解提取液经固液分离后得到的液相物进行第一次醇沉，收集第一次醇沉后的沉淀；除去上述沉淀中的蛋白质，进行第二次醇沉，收集第二次醇沉后的沉淀，复溶，第一次透析，收集截留于透析装置内的物质，得到白及粗多糖。白及粗多糖进一步采用离子交换和葡聚糖凝胶分别纯化可获得白及多糖。上述白及粗多糖和白及多糖均能够具有一定的抑制炎症因子表达以及缓解紫外线造成的皮肤损伤的作用，并表现出良好的保湿功能，可用于制备相应的化妆品或药物。

Description

一种白及多糖物质及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体而言，涉及一种白及多糖物质及其制备方法与应用。
背景技术
白及属(Bletilla)为兰科多年生草本植物，在我国有4个种群，分别为白及(B.striata(Thunb.)Reichb.f)、小白及(B.formosana(Hayata)Schltr)、黄花白及(Bletilla ochracea Schltr)和华白及(Bletilla sinensis(Rolfe)Schltr)，主要分布于长江流域和秦岭山区等地。该属植物在我国民间作为药用已有上千年的历史，《中国药典》收载了白及作为药材，而黄花白及、小白及和华白及作为地方习用品或代用品使用。白及属的几个种均具有药用价值，入药部分皆为其干燥假鳞茎，具有收敛止血、清热利湿、消肿生肌等功效。
多糖是一种天然的大分子聚合物，分子量为数万甚至数百万，广泛存在于生物体中，并在生命活动中携带着诸如核酸和蛋白质之类的重要生物学信息。近年来，越来越多的植物多糖被分离、鉴定出来，而且研究发现这些植物多糖具有不同的生物学活性，如抗肿瘤、免疫调节等。
使用不同的提取和纯化方法分离的白及多糖在功效方面具有差异，白及中的多糖类物质还有待进一步深入研究。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种白及多糖物质的制备方法，该方法简单可行，可工业化生产，通过该方法能够制备得到可用于化妆品领域，并具有一定抑制炎症因子表达、缓解皮肤损伤以及保湿功效的白及多糖物质。
本发明的目的之二在于提供一种由上述制备方法制得的白及多糖物质。
本发明的目的之三在于提供一种上述白及多糖物质的应用。
本发明的目的之四在于提供一种制备原料包括上述白及多糖物质的化妆品。
本发明的目的之五在于提供一种制备原料包括上述白及多糖物质的药物。
本申请可这样实现：
第一方面，本申请提供一种白及多糖物质的制备方法，其包括以下步骤：用低元醇对白及鳞茎进行回流提取去除小分子物质，将回流提取液经固液分离后得到的固相物与复合酶和水共同酶解提取，将酶解提取液经固液分离后得到的液相物进行第一次醇沉，收集第一次醇沉后的沉淀；
除去上述沉淀中的蛋白质，随后进行第二次醇沉，收集第二次醇沉后的沉淀，复溶，第一次透析，收集截留于透析装置内的物质，得到白及粗多糖。
在可选的实施方式中，回流提取过程中，低元醇与白及鳞茎的料液比为1g：8-12mL，低元醇的浓度为92-98vt％。
在可选的实施方式中，低元醇为乙醇。
在可选的实施方式中，回流提取的次数为2-3次。
在可选的实施方式中，每次回流提取均于20-30℃的条件下进行2-3h。
在可选的实施方式中，白及鳞茎为粉碎过筛后的白及鳞茎粉。
在可选的实施方式中，酶解提取过程中，固相物与水的料液比为1g：8-12mL；复合酶包括纤维素酶和木瓜蛋白酶，纤维素酶的用量为固相物的1.2-1.8wt％，木瓜蛋白酶的用量为固相物的0.8-1.2wt％；
在可选的实施方式中，酶解提取是于52-58℃且pH为5.2-5.8的条件下进行1.5-2.5h。
在可选的实施方式中，酶解提取的次数为2-3次。
在可选的实施方式中，除去蛋白质包括：将第一次醇沉后的沉淀经溶解得到的多糖溶液与Sevage试剂混合，待蛋白质变性后离心，除去处于多糖溶液层和Sevage试剂层中间的蛋白质变性层。
在可选的实施方式中，多糖溶液与Sevage试剂的体积比为2.5-3.5：1。
在可选的实施方式中，离心是将由多糖溶液与Sevage试剂混合后的混合物摇晃25-35min后，以3800-4200r/min的转速离心8-12min。
在可选的实施方式中，除去蛋白质之前，还包括用浓度为92-98vt％的乙醇对第一次醇沉后的沉淀进行洗涤。
在可选的实施方式中，第一次醇沉和第二次醇沉所用的乙醇加入液相物中后，最终浓度均为78-82vt％。
在可选的实施方式中，先将酶解提取后的液相物浓缩后再进行第一次醇沉。
在可选的实施方式中，还包括对白及粗多糖进行纯化，得到白及多糖。
在可选的实施方式中，纯化包括：采用离子交换柱对白及粗多糖进行初步纯化，初步纯化是用纯水、0.08-0.12mol/L的NaCl溶液、0.28-0.32mol/L的NaCl溶液和0.48-0.52mol/L的NaCl溶液依次作为洗脱剂进行梯度洗脱；收集最后洗脱液中活性成分含量最多的部分。
在可选的实施方式中，初步纯化过程中每个洗脱剂的体积为离子交换柱的体积的1-2倍；
在可选的实施方式中，离子交换柱为DEAE-52纤维素阴离子交换柱。
在可选的实施方式中，纯化还包括：采用凝胶柱对初步纯化步骤中收集的部分进行再次纯化，再次纯化过程中所用的洗脱剂为去离子水，收集洗脱液中活性成分含量最多的部分。
在可选的实施方式中，再次纯化过程中，洗脱剂的洗脱体积为凝胶柱的体积的1-2倍。
在可选的实施方式中，凝胶柱为Sephadex-G100凝胶柱。
在可选的实施方式中，还包括将再次纯化后的洗脱液进行第二次透析。
在可选的实施方式中，第一次透析和第二次透析均于截留分子量为3400-3600Da的透析装置中进行；其中，第一次透析和第二次透析的时间均为48-72h。
在可选的实施方式中，两次透析后，均分别将截留于透析装置内的物质进行干燥。
第二方面，本申请提供一种白及多糖物质，其由前述实施方式任一项的制备方法制备而得。
在可选的实施方式中，白及多糖物质包括上述制备方法制备得到的白及粗多糖、初纯化白及多糖以及终纯化白及多糖中的至少一种。
第三方面，本申请提供如前述实施方式的白及多糖物质的应用，例如用于制备化妆品或药物。
在可选的实施方式中，白及多糖物质用于制备护肤品。
在可选的实施方式中，白及多糖物质用于制备改善或缓解紫外线造成的皮肤损伤的护肤品或药物。
在可选的实施方式中，白及多糖物质用于制备抑制炎症因子表达的护肤品或药物。
在可选的实施方式中，白及多糖物质用于制备保湿护肤品。
第四方面，本申请提供一种化妆品，化妆品的制备原料包括前述实施方式的白及多糖物质。
在可选的实施方式中，化妆品为用于抑制炎症因子表达的护肤品，或，用于改善或缓解H2O2诱导的细胞损伤的护肤品，或，用于保湿的护肤品。
第五方面，本申请提供一种药物，药物的制备原料包括前述实施方式的白及多糖物质。
在可选的实施方式中，药物为用于抑制炎症因子表达的药物，或，用于改善或缓解H2O2诱导的细胞损伤的药物。
本申请的有益效果包括：
本申请通过在特定的提取条件下，从白及的干燥假鳞茎中提取分离得到新的白及多糖类物质，该白及多糖类物质具有一定的抑制炎症因子表达以及缓解紫外线造成的皮肤损伤的作用，并表现出良好的保湿功能，可用于制备相应的化妆品或药物，具有较高的使用价值和应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例2中白及粗多糖SBSP的DEAE-52离子交换柱层析结果；
图2为实施例2中初纯化白及多糖DBSP的凝胶柱层析结果；
图3为实施例3中终纯化白及多糖BSP-1的分子量分布曲线；
图4为实施例3中单糖标准品和BSP-1的单糖组成测定结果；
图5为实施例4中BSP-1多糖对TNF-α(A)、IL-6(B)、IL-1β(C)、NO(D)炎症因子的表达情况结果，该图数据以均数±标准差表示，n＝5；#p<0.05，与空白组相比，*p<0.05，与模型组相比；
图6为实施例5中BSP-1减轻对H2O2诱导的细胞ROS积累结果图；结果以均数±标准差表示，n＝5；其中，A图表示流式细胞仪检测细胞内ROS的变化，B图表示细胞内ROS相对含量；#p<0.05，与空白组相比，*p<0.05，与模型组相比；
图7为实施例5中BSP-1对细胞内氧化应激和抗氧化防御酶的影响结果图；结果以均数±标准差表示，n＝5；A图为BOP-1对Hacat细胞MDA含量的影响，B图为BSP-1对Hacat细胞SOD含量的影响，C图为BSP-1对Hacat细胞GSH含量的影响，D图为BSP-1对Hacat细胞CAT含量的影响；#p<0.05，与空白组相比，*p<0.05，与模型组相比；
图8为实施例6中BSP-1对干燥损伤HaCaT细胞的影响图；结果以均数±标准差表示，n＝5；A图为BSP-1对HaCat细胞中AQP-3含量的影响，B图为BSP-1对HaCat细胞中HA含量的影响；#p<0.05，与空白组相比，*p<0.05，与模型组相比。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请提供的白及多糖及其制备方法与应用进行具体说明。
本申请提出一种白及多糖物质的制备方法，其包括以下步骤：用低元醇对白及鳞茎进行回流提取以去除小分子物质，将回流提取液经固液分离后得到的固相物与复合酶和水共同酶解提取，将酶解提取液经固液分离后得到的液相物进行第一次醇沉，收集第一次醇沉后的沉淀。
除去上述沉淀中的蛋白质，随后进行第二次醇沉，收集第二次醇沉后的沉淀，复溶，第一次透析，收集截留于透析装置内的物质，得到白及粗多糖。
在较佳的实施方式中，上述白及鳞茎为经粉碎过筛后的白及鳞茎粉。具体的，可用高速粉碎机进行粉碎，并过40目筛。
上述回流提取过程中，低元醇与白及鳞茎的料液比可以为1g：8-12mL，如1g：8mL、1g：9mL、1g：10mL、1g：11mL或1g：12mL等，优选为1g：10mL。低元醇的浓度可以为92-98vt％，优选为95vt％。可参考地，上述低元醇可以选自甲醇或乙醇等，优选为乙醇。
回流提取的次数可以仅为1次，也可以为2-3次，还可根据需要增加回流提取次数。每次回流提取均可以于20-30℃的条件下进行2-3h。
回流提取后，采用过滤的方式将回流提取液进行固液分离，收集滤渣并晒干。当回流提取次数为多次时，可以将每次提取后的回流提取液分别固液分离再合并滤渣，也可将每次提取后的回流提取液先合并再统一进行固液分离，收集滤渣。
随后将上述滤渣与复合酶以及水共同进行酶解提取。
在酶解提取过程中，固相物(即滤渣)与水的料液比可以为1g：8-12mL(优选1g：10mL)。
本申请中，复合酶包括纤维素酶和木瓜蛋白酶，其中，纤维素酶的用量为滤渣的1.2-1.8wt％(优选为1.5wt％)，木瓜蛋白酶的用量为滤渣的0.8-1.2wt％(优选为1wt％)。
需说明的是，本申请所用的复合酶中，纤维素酶为专属酶，其可将白及鳞茎的细胞壁水解为葡萄糖，使其内容物更容易被溶解和提取出来。并且，纤维素酶只破坏白及鳞茎的细胞壁，而白及鳞茎的细胞内部物质中不含有纤维素类物质，因此纤维素酶不会对白及鳞茎内容物的成分结构产生不利影响。通过比较，发明人得出，木瓜蛋白酶较其它蛋白酶对白及鳞茎中的蛋白质物质具有更高的去除能力，且其作用条件温和，对多糖结构不造成破坏。
可参考地，上述酶解提取可以于52-58℃且pH为5.2-5.8的条件下进行1.5-2.5h。优选可以于55℃、pH为5.5的条件下进行2h。酶解提取次数可以仅1次，也可以为2-3次，还可根据需要增加酶解提取次数。当酶解提取次数为多次时，可以将每次提取后的酶解液分别固液分离(如采用离心方式)后合并液相物，也可将每次提取后的酶解液先合并再统一进行固液分离(如采用离心方式)，收集液相物。
随后将上述液相物进行第一次醇沉，收集第一次醇沉后的沉淀。该过程中，所用醇为乙醇，其加入液相物中后的最终浓度为78-82vt％(优选80vt％)。在优选的实施方式中，可以先将酶解提取后的液相物浓缩后再进行第一次醇沉。
进一步地，除去第一次醇沉后的沉淀中的蛋白质。可参考地，可以是将第一次醇沉后的沉淀进行溶解(例如可用蒸馏水溶解)，并将溶解得到的多糖溶液与Sevage试剂混合，待蛋白质变性后离心，除去处于多糖溶液层和Sevage试剂层中间的蛋白质变性层。该过程即可有效除去白及鳞茎中所含的蛋白质，提高多糖类物质的提取纯度。
作为参考地，上述多糖溶液与Sevage试剂的体积比可以为2.5-3.5：1，优选为3:1。离心可以是将由多糖溶液与Sevage试剂混合后的混合物摇晃(剧烈摇晃)25-35min(优选30min)后，以3800-4200r/min(优选4000r/min)的转速离心8-12min(优选10min)。进行上述操作后，混合液分为明显的三层，蛋白质层处在多糖溶液和Sevage试剂层中间。较佳地，吸出位于上层的糖液，并重复进行上述去除蛋白质的操作，直至无中间蛋白质变性层为止。
在优选的实施方式中，除去蛋白质之前，还包括用浓度为92-98vt％(如95vt％)的乙醇对第一次醇沉后的沉淀进行洗涤(例如可洗涤3次)。
进一步地，将除去蛋白质的多糖溶液进行第二次醇沉。第二次醇沉所用的醇也可为乙醇，其加入液相物中后最终浓度为78-82vt％(如80vt％)。离心后收集沉淀即可。
进一步地，将第二次醇沉后的沉淀用蒸馏水进行复溶，装入截留分子量为3400-3600Da(如3500Da)的透析装置(如透析袋)中进行第一次透析，透析时间可以为48-72h。优选地，第一次透析过程的前12h，每隔3h换一次去离子水，之后早中晚各换一次去离子水。
第一次透析结束后，将截留于透析装置内的物质进行浓缩、干燥(例如可采用真空冷冻干燥机冷冻干燥)，即可得到白及粗多糖(本申请中以SBSP表示白及粗多糖)。
进一步地，还包括对白及粗多糖进行纯化，以得到纯化后的白及多糖。
可参考地，纯化包括：采用离子交换柱对白及粗多糖进行初步纯化，初步纯化是用纯水、0.08-0.12mol/L的NaCl溶液、0.28-0.32mol/L的NaCl溶液和0.48-0.52mol/L的NaCl溶液依次作为洗脱剂进行梯度洗脱；收集最后洗脱液中活性成分含量最多的部分，得到初纯化白及多糖(本申请中以DBSP表示白及粗多糖)。
较佳地，初步纯化是用纯水、0.1mol/L的NaCl溶液、0.3mol/L的NaCl溶液和0.5mol/L的NaCl溶液依次作为洗脱剂进行梯度洗脱。
上述初步纯化过程中，每个洗脱剂的体积为离子交换柱的体积的1-2倍(优选为1.5倍)。离子交换柱的尺寸为2.6cm(直径)×30cm(填料高度)。
本申请中，离子交换柱优选采用DEAE-52纤维素阴离子离子交换柱。阴离子离子交换柱适合于分离各种酸性、中性多糖和黏多糖。DEAE纤维素阴离子交换柱较DEAE葡聚糖阴离子交换柱和DEAE琼脂糖阴离子交换柱而言，能够使得多糖自由进入其载体中并进行迅速扩散。DEAE-52纤维素阴离子离子交换柱较DEAE-22纤维素阴离子离子交换柱、DEAE-23纤维素阴离子离子交换柱、DEAE-32纤维素阴离子离子交换柱和DEAE-11纤维素阴离子离子交换柱对白及鳞茎中的蛋白具有更强的吸附能力，以其进行白及多糖类物质的分离纯化，不仅能够将中性多糖与酸性多糖分离开，而且还能使多糖中未除干净的蛋白质吸附在柱子上，从而达到较佳的分离纯化效果。
本申请中，收集最后洗脱液中活性成分含量最多的部分可采用苯酚-硫酸法进行监测，在490nm波长下绘制洗脱曲线，收集多糖峰峰面积最大对应的部分即可。随后，将上述收集的部分进行浓缩，冷冻干燥，即可得到初纯化白及多糖DBSP。
进一步地，本申请的纯化还可包括：采用凝胶柱对初步纯化步骤中收集的部分进行再次纯化，再次纯化过程中所用的洗脱剂为去离子水，收集洗脱液中活性成分含量最多的部分。
上述再次纯化过程中，洗脱剂的洗脱体积为凝胶柱的体积的1-2倍(优选1.5倍)。凝胶柱的尺寸为1.6cm(直径)×130cm(填料高度)。
本申请中，凝胶柱优选采用Sephadex-G100凝胶柱。该凝胶柱型号是基于本申请初步纯化所得的多糖分子量范围针对性使用的，以将多糖按照分子量的大小不同得以有效分离开。
同理地，收集洗脱液中活性成分含量最多的部分也可采用苯酚-硫酸法进行监测，对其主要的吸收峰进行收集。随后，将上述收集的部分进行浓缩(可采用旋转蒸发仪进行)。
进一步地，将再次纯化后的洗脱液进行第二次透析，得到终纯化白及多糖(本申请中以BSP-1表示终纯化白及多糖)。经测定和比对，该终纯化白及多糖BSP-1为从白及中首次提取出的新型多糖。
可参考地，第二次透析可于截留分子量为(如3500Da)的透析装置(如透析袋)中进行。第二次透析时间也可以为48-72h。优选地，第二次透析过程的前12h，每隔3h换一次去离子水，之后早中晚各换一次去离子水。
在可选的实施方式中，两次透析后，均分别将截留于透析装置内的物质进行干燥(如用冷冻干燥机进行冷冻干燥)。
相应地，本申请提供了一种白及多糖物质，其由上述制备方法制备而得。
需要说明的是，上述白及多糖物质包括上述制备方法制备得到的白及粗多糖、初纯化白及多糖以及终纯化白及多糖中的至少一种。也即，上述白及多糖物质可单指本申请所涉及的白及粗多糖(SBSP)、初纯化白及多糖(DBSP)或终纯化白及多糖(BSP-1)，也不排除可指同时包括SBSP、DBSP和BSP-1中任意两种或三种的混合物。
此外，本申请还提供了上述白及多糖物质的应用，例如可用于制备化妆品或药物。
其中，化妆品可以为护肤品，也可其它类型的化妆品。
在一些优选的实施方式中，白及多糖物质可用于制备改善或缓解紫外线造成的皮肤损伤的护肤品或药物，也可用于制备抑制炎症因子表达的护肤品或药物；还可用于制备具有保湿功效的护肤品。
对应地，本申请还提供了一种化妆品，其制备原料包括上述白及多糖物质。上述化妆品为用于抑制炎症因子表达的护肤品，或，用于改善或缓解H2O2诱导的细胞损伤的护肤品，或，用于保湿的护肤品。
对应地，本申请还提供了一种药物，其制备原料包括前述实施方式的白及多糖物质。上述药物为用于抑制炎症因子表达的药物，或，用于改善或缓解H2O2诱导的细胞损伤的药物。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
白及粗多糖SBSP的制备
步骤(1)：取白及(Bletilla striata)鳞茎1.0g，用高速粉碎机粉碎，过40目筛，得白及粉，用料液比为1g:10mL的95vt％的乙醇水溶液回流提取3次，过滤后收集滤渣并晒干。
步骤(2)：采用酶辅助水提取法，将步骤(1)中的滤渣在55℃，料液比为1g:10mL，pH5.5、酶解时间为2h的条件下酶解提取两次，酶解过程中添加有由纤维素酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶，其中，纤维素酶的用量为滤渣重量的1.5wt％，木瓜蛋白酶的用量为滤渣重量的1wt％，离心后合并滤液。
步骤(3)：将步骤(2)中的滤液浓缩后，以终浓度为80vt％的乙醇第一次醇沉，离心后收集沉淀。
步骤(4)：将步骤(3)中的沉淀使用95vt％的乙醇洗涤3次。
步骤(5)：将步骤(4)中已经洗涤过的沉淀用蒸馏水溶解，将多糖溶液和Sevage试剂，按照体积比为3：1进行混合，剧烈摇晃30min，以4000r/min离心10min。可见混合液分为明显的三层，蛋白质层处在多糖溶液和Sevage试剂的中间。小心吸出上层糖液，重复上述除蛋白步骤直至无中间蛋白质变性层。
步骤(6)：将步骤(5)中已除去蛋白的多糖溶液通过80vt％乙醇第二次醇沉，离心得到沉淀。
步骤(7)：将步骤(6)中所得沉淀蒸馏水复溶，装入截留分子量为3500Da的透析袋中进行第一次透析72h(前12h需每隔3h换一次去离子水，之后早中晚各换一次去离子水)，透析结束后浓缩，真空冷冻干燥机冷冻干燥得白及粗多糖SBSP。
实施例2
白及粗多糖SBSP的纯化
步骤(1)：将白及粗多糖SBSP配成50mg/mL的多糖溶液，4000r/min离心10min，采用DEAE-52离子交换柱(2.6×30cm)初步纯化，依次用去离子水、0.1mol/L、0.3mol/L和0.5mol/L的NaCl溶液进行梯度洗脱，各梯度的洗脱体积为1.5倍柱体积。用苯酚-硫酸法进行监测，在490nm波长下绘制洗脱曲线，得到四个多糖部位(如图1所示)，第一个多糖峰峰面积最大，说明其是四个部分中含量最多的一个部分，故收集第一个峰，浓缩，冷冻干燥得初纯化白及多糖(DBSP)。
步骤(2)：将步骤(1)中的初纯化白及多糖(DBSP)配置成30mg/mL，取5mL通过葡聚糖凝胶柱通过凝胶柱Sephadex-G100(1.6×130cm)进一步纯化，用去离子水进行洗脱，洗脱体积为1.5倍柱体积，自动收集器进行收集，苯酚-硫酸法进行监测。对其主要的吸收峰进行收集，采用旋转蒸发仪进行浓缩，并使用分子截留量为3500Da的透析袋进行第二次透析72h(前12h需每隔3h换一次去离子水，之后早中晚各换一次去离子水)，然后用冷冻干燥机进行冷冻干燥，得到终纯化白及多糖(BSP-1)(如图2所示)。
实施例3
多糖BSP-1的结构鉴定及解析
(1)多糖BSP-1的分子量测定
采用高效凝胶渗透色谱系统测定分子量分布，色谱柱为Shodex OH-pak SB-804HQ柱(8mm×300mm)；检测器为视差检测器RID和二极管阵检测器(DAD)联用；柱温35℃；进样量30μL；流动相为0.1mol/L的NaCl；流速为0.5mL/min。用不同分子量的D系列右旋糖苷标准品(分子量分别为D0-180Da,D1-2.7KDa,D2-5.25KDa,D3-9.75KDa,D4-13.05KDa,D5-36.8KDa,D6-64.65KDa,D7-135.35KDa,D8-300.6KDa,D2000-2000KDa)配置成浓度为1mg/ml的标准品溶液，通过上述高效凝胶渗透色谱系统测定后，以保留时间为横坐标，重均分子量Mw为纵坐标制作标准曲线，并用GPC软件对标准曲线进行校正后，多糖BSP-1的重均分子量分别为15670Da，数均分子量为10800Da，多分散系数(Mw/Mn)为1.45，表明多糖BSP-1的分子量分布范围较宽。
如图3分子量积分分布曲线(Ht％图)显示，多糖BSP-1中分子量≤1000Da的所有多糖片段总和大约占全部多糖片段的0％，随着分子量的不断增大，分子量较小的多糖片段质量百分数不断累积，多糖BSP-1的分子量≤40000Da的所有多糖片段大约占全部多糖片段的100％。
(2)多糖BSP-1的单糖组成测定
多糖BSP-1以及各单糖标准品采用2mol/L TFA 2mL 110℃水解4h，冷却至室温后，用2mol/L NaOH调节pH值至中性，然后采用高效液相色谱分析，色谱柱为Agilent ZorbaxSB-C18(150mm×4.6mm)，柱温为35℃；流动相A为15％乙腈+85％KH2PO4-NaOH缓冲液(pH为6.9)，流动相B为40％乙腈+60％KH2PO4-NaOH缓冲液(pH为6.9)；流速为1mL/min；洗脱梯度：0-25min，0-25％B；25-30min，100％A。单糖标准品和BSP1的单糖组成测定结果如图4所示。根据标准单糖的保留时间及外标法测定摩尔比，得到BSP-1单糖组成甘露糖比葡萄糖2:1。
(3)多糖BSP-1的红外光谱测定
多糖BSP-1制成KBr压片，用Bruker Tensor 27红外光谱仪扫描4000-400cm-1范围内的光谱信号，得到红外吸收光谱图。
表1BSP-1的FT-IR归属
Figure BDA0003312488600000141
BSP-1的FT-IR归属如表1所示，其结果显示：BSP-1在3385cm-1处出现宽而强的吸光度键，为O-H伸缩振动引起；2877cm-1和1373cm-1处吸收被归属为吡喃糖的C-H伸缩振动和弯曲振动；1726cm-1和1242cm-1处的吸收是由O-乙酰基的C＝O价振动和C-O振动引起的。1056cm-1的吸收峰代表吡喃糖苷的存在。此外，根据以往文献，873cm-1的弱峰归因于甘露糖残基。
(4)多糖BSP-1的GC-MS甲基化分析
称取多糖样品5mg溶于1mL二甲基亚砜(DMSO)，加入50mg氢氧化钾粉末(KOH)，磁力搅拌直至KOH溶解，加入0.9mL碘甲烷，在氮气密封的条件下超声反应1h，反应后加入2mL水分解碘甲烷终止反应，采用二氯甲烷进行萃取，得到甲基化多糖。加入2mol/L的TFA溶液1mL，使甲基化产物溶解，并在110℃对甲基化后的多糖进行酸水解4h。然后用2mol/L的KOH溶液调pH至10后，加入硼氢化钠25mg，50℃水浴搅拌还原2h，加入冰乙酸终止反应，冻干。采用GC-MS进行分析，HP-5MS石英毛细管柱(50mm×0.25mm×0.25mm)；柱温：起始温度150℃，程序升温2℃/min至200℃，再5℃/min升温至280℃，保持20min；柱流量为1.0mL/min；进样口温度250℃；柱前压100kPa；分流比10:1；载气为高纯氦气，进样量1μL。MS条件：电离方式EI；电子能量70；传输线温度290℃；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；质量范围50～600；与CCRC光谱数据库进行对比，判断糖苷键类型。
表2BSP-1甲基化产物的GC-MS信号归属
甲基化糖 糖链类型 保留时间 摩尔比例 离子碎片(m/z)
2,3,4,6-Me<sub>4</sub>-Glc terminal Manp 19.62 1.01 71,87,101,118,129,145,161,205
2,3,4,6-Me<sub>4</sub>-Man terminal Glcp 19.72 1.00 71,87,101,118,129,145,161,205
2,3,6-Me<sub>3</sub>-Glc 1,4-linked Manp 21.67 2.47 71,87,99,101,117,129,145,161,233
2,3,6-Me<sub>3</sub>-Man 1,4-linked Glcp 21.78 2.19 71,87,101,117,129,145,161,233
如表2所示，BSP-1的各糖醇乙酸酯衍生物分别是2,3,4,6-四-O-甲基-1,5-二-O-乙酰基-甘露糖醇、2,3,4,6-四-O-甲基-1,5-二-O-乙酰基-葡萄糖醇、2,3,6-三-O-甲基-1,4,5-三-O-乙酰基-甘露糖醇和2,3,6-三-O-甲基-1,4,5-三-O-乙酰基-葡萄糖醇，其摩尔比分别为1.01:1.00:2.47:2.19。
上述糖链中可能含有以下结构片段：
[Glc-1→4-β-D-Man-1→4-β-D-Man-1→4-β-D-Glc-1→4-β-D-Man-1→4-β-D-Glc-1→4-β-D-Man→]。
实施例4
多糖BSP-1的抗炎活性评价
(1)RAW264.7细胞的复苏与培养：RAW264.7细胞从液氮罐中取出，放入37℃左右的水杯中迅速解冻，在生物安全柜中，将细胞快速转移到15mL离心管中，并加入4mL完全培养基，吹打均匀，1000rmp离心3min。倒掉上清液后，向离心管中加入2mL培养基，吹打均匀，转移到细胞培养皿中，培养基补足10mL，摇晃均匀，放置于细胞培养箱(5％CO2，37℃)中进行细胞培养。按时观察细胞状态，在细胞长满至培养皿内80-90％左右进行细胞传代。传至第三代时，使用细胞计数仪进行计数，观察细胞活率和状态，通过调整细胞密度后待细胞活率大于95％可进行后续实验。
(2)MTT细胞活力实验：把细胞密度调整为1.0×105个/mL，接板于96孔中贴壁生长，每孔200μL，24h后，分别将白及多糖BSP-1用培养基稀释成200、100和50(μg/mL)，每个分别做5个平行组，培养20h。加入浓度为0.5mg/mL MTT溶液100μL，4h后，加入100μL DMSO溶液，并在暗处使用细胞震板仪充分震荡10min，使用酶标仪在570nm测定各孔吸光值。
(3)NO和炎症因子含量的测定：按照测定试剂盒说明书方法测定150μg/mL、100μg/mL和50μg/mL下白及多糖BSP1对LPS诱导的过量NO及其炎症因子产生的抑制作用。
如图5所示，经LPS诱导后的RAW264.7细胞模型组促炎因子表达明显升高，与空白组相比有显著性差异(p<0.05)，而经多糖BSP-1干预后的多糖组，炎症因子的表达情况明显受到抑制；高剂量的多糖BSP-1对TNF-α、IL-6和IL-1β均具有较好的抑制效果，其中对于IL-6的抑制效果最为明显；因此推测多糖BSP-1可以有效地抑制炎症因子的表达，从而达到抗炎的作用。
实施例5
多糖BSP-1保护H2O2诱导的细胞损伤实验
HaCaT细胞的复苏和细胞活力的测定同实施例4(1)和(2)。在无毒剂量下，将HaCaT细胞接板培养24h后，分别加入150μg/mL、100μg/mL和50μg/mL的多糖BSP-1与HaCaT细胞共同培养24h，弃掉旧的培养液，加入PBS溶液洗涤1-2次，给予剂量为0.7mmol/L的H2O2溶液培养24h诱导细胞衰老，最后根据试剂盒中的说明书进行测定细胞内活性氧以及抗氧化酶活力。
活性氧(ROS)是主要由线粒体产生的自由基，与正常生理功能和人类疾病密切相关。ROS的产生和清除处于动态平衡状态，以维持正常的生理功能。然而，当细胞产生的活性氧水平超过自我清除能力时，就会发生氧化应激，从而导致一系列慢性疾病。为了研究BSP-1对Hacat细胞内ROS的影响，我们首次使用DCFH-DA荧光探针通过流式细胞术检测细胞内的ROS水平。如图6所示，与对照组相比，APAP处理H2O2细胞使得Hacat细胞内ROS含量增加(p<0.05)。但是，与模型组相比，BSP-1以计量依赖的方式显著的抑制H2O2引起的细胞内ROS积累(p<0.05)。
丙二醛(MDA)是脂质过氧化的指标，超氧化物歧化酶含量(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是生物氧化过程中保护细胞完整性的两种重要抗氧化酶。谷胱甘肽(GSH)被认为是抵御氧化应激的第一道屏障。为了确定BSP-1对Hacat细胞内氧化应激和抗氧化酶的影响，我们检测Hacat细胞内MDA、GSH、CAT和SOD的变化。如图7所示，与对照组相比，H2O2显著的诱导细胞内MDA的增加以及细胞内GSH、CAT和SOD的减少(p<0.05)。值得注意的是，BSP-1预处理以剂量依赖的方式显著的诱导细胞内MDA的减少以及细胞内GSH、CAT和SOD的增加(p<0.05)。表明BSP-1通过调节细胞内氧化应激酶和抗氧化防御酶抑制细胞内ROS积累从而保护Hacat细胞免受H2O2诱导的损伤。
实施例6
多糖BSP-1的保湿活性
取生长状态良好的HaCaT细胞稀释成3×105个/mL，按照每孔2mL的体积加入到6孔板中培养24h后，将细胞液吸出建立干燥模型，干燥风速设置为0.6m/s，干燥25min后，加入分别含有150μg/mL、100μg/mL和50μg/mL多糖BSP-1的培养基继续培养细胞24h，最后收集细胞培养上清液按照试剂盒步骤测定其水通道蛋白AQP-3和透明质酸HA的含量。
由图8可知，在较高的实验浓度下，干燥损伤的HaCat细胞用不同浓度的多糖BSP-1处理后，AQP-3的含量均较高，且呈剂量依赖性增加，与模型组相比具有显著提高。同样，HA含量也随着多糖浓度的增加而增加，且与模型组相比具有显著性差异，这说明多糖BSP-1能够促进干燥处理后的HaCat细胞分泌水通道蛋白AQP-3和透明质酸HA。AQP-3和HA等生理调节剂有助于皮肤保持水分平衡，因此通过人永生角质层细胞HaCat分泌AQP-3和HA的含量可以判断出样品是否具有保湿效果。
综上，本申请通过从白及的干燥假鳞茎中提取分离得到一种白及多糖BSP-1，药理实验表明制得的多糖BSP-1能够剂量依赖性地抑制炎症因子的表达以及紫外线造成的皮肤损伤，并表现出良好的保湿功能，可应用制备皮肤护理化妆品。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种白及多糖物质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：用低元醇对白及鳞茎进行回流提取去除小分子物质，将回流提取液经固液分离后得到的固相物与复合酶和水共同酶解提取，将酶解提取液经固液分离后得到的液相物进行第一次醇沉，收集第一次醇沉后的沉淀；
除去所述沉淀中的蛋白质，随后进行第二次醇沉，收集第二次醇沉后的沉淀，复溶，第一次透析，收集截留于透析装置内的物质，得到白及粗多糖。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，回流提取过程中，所述低元醇与所述白及鳞茎的料液比为1g：8-12mL，所述低元醇的浓度为92-98vt％；
优选地，所述低元醇为乙醇；
优选地，回流提取的次数为2-3次；
优选地，每次回流提取均于20-30℃的条件下进行2-3h；
优选地，所述白及鳞茎为粉碎过筛后的白及鳞茎粉。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，酶解提取过程中，所述固相物与水的料液比为1g：8-12mL；所述复合酶包括纤维素酶和木瓜蛋白酶，所述纤维素酶的用量为所述固相物的1.2-1.8wt％，所述木瓜蛋白酶的用量为所述固相物的0.8-1.2wt％；
优选地，酶解提取是于52-58℃且pH为5.2-5.8的条件下进行1.5-2.5h；
优选地，酶解提取的次数为2-3次。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，除去所述蛋白质包括：将第一次醇沉后的沉淀经溶解得到的多糖溶液与Sevage试剂混合，待蛋白质变性后离心，除去处于多糖溶液层和Sevage试剂层中间的蛋白质变性层；
优选地，所述多糖溶液与所述Sevage试剂的体积比为2.5-3.5：1；
优选地，离心是将由所述多糖溶液与所述Sevage试剂混合后的混合物摇晃25-35min后，以3800-4200r/min的转速离心8-12min；
优选地，除去所述蛋白质之前，还包括用浓度为92-98vt％的乙醇对第一次醇沉后的沉淀进行洗涤。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，第一次醇沉和第二次醇沉所用的乙醇加入液相物中后，最终浓度均为78-82vt％；
优选地，先将酶解提取后的所述液相物浓缩后再进行第一次醇沉。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括对所述白及粗多糖进行纯化，得到白及多糖；
优选地，纯化包括：采用离子交换柱对所述白及粗多糖进行初步纯化，初步纯化是用纯水、0.08-0.12mol/L的NaCl溶液、0.28-0.32mol/L的NaCl溶液和0.48-0.52mol/L的NaCl溶液依次作为洗脱剂进行梯度洗脱；收集最后洗脱液中活性成分含量最多的部分，得到初纯化白及多糖；
优选地，初步纯化过程中每个洗脱剂的体积为所述离子交换柱的体积的1-2倍；
优选地，所述离子交换柱为DEAE-52纤维素阴离子交换柱；
优选地，纯化还包括：采用凝胶柱对纯化步骤中收集的部分进行再次纯化，再次纯化过程中所用的洗脱剂为去离子水，收集洗脱液中活性成分含量最多的部分；
优选地，再次纯化过程中，洗脱剂的洗脱体积为凝胶柱的体积的1-2倍；
优选地，所述凝胶柱为Sephadex-G100凝胶柱；
优选地，还包括将再次纯化后的洗脱液进行第二次透析，得到终纯化白及多糖；
优选地，第一次透析和第二次透析均于截留分子量为3400-3600Da的透析装置中进行；其中，第一次透析和第二次透析的时间均为48-72h；
优选地，两次透析后，均分别将截留于透析装置内的物质进行干燥。
7.一种白及多糖物质，其特征在于，由权利要求1-6任一项所述的制备方法制备而得；
优选地，所述白及多糖物质包括权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的白及粗多糖、权利要求6所述的制备方法制备得到的初纯化白及多糖、权利要求6所述的制备方法制备得到的终纯化白及多糖中的至少一种。
8.如权利要求7所述的白及多糖物质的应用，其特征在于，所述白及多糖物质用于制备化妆品或药物；
优选地，所述白及多糖物质用于制备护肤品；
优选地，所述白及多糖物质用于制备改善或缓解紫外线造成的皮肤损伤的护肤品或药物；
优选地，所述白及多糖物质用于制备抑制炎症因子表达的护肤品或药物；
优选地，所述白及多糖物质用于制备保湿护肤品。
9.一种化妆品，其特征在于，所述化妆品的制备原料包括权利要求7所述的白及多糖物质；
优选地，所述化妆品为用于抑制炎症因子表达的护肤品，或，用于改善或缓解H2O2诱导的细胞损伤的护肤品，或，用于保湿的护肤品。
10.一种药物，其特征在于，所述药物的制备原料包括权利要求7所述的白及多糖物质；
优选地，所述药物为用于抑制炎症因子表达的药物，或，用于改善或缓解H2O2诱导的细胞损伤的药物。
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