CN113749109B - 一种几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统的制备方法 - Google Patents

一种几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统的制备方法。本发明创造性地以羧酸功能化的MCM‑41型介孔纳米材料为载体，在其中载药后，以可修饰的壳聚糖包封，并最后通过乙酰化反应将包封层转化为几丁质制得几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统。该递送系统在几丁质酶条件下48h内累积释放量达40.8％，是无几丁质酶条件下释放量的近2倍。其良好的几丁质酶响应性控释特征，能够降低被包封的伊维菌素等杀虫药物在动物体内的泄露而引起的副作用，而选择性地在昆虫体内被几丁质酶抽发释放并杀虫，优化杀虫剂的合理给药。

Description

一种几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统的制备 方法
技术领域
本发明属于农药领域，具体涉及一种几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统的制备方法。
背景技术
近年来，随着人民日益提高的生活需求，畜牧生产的规模化、集约化经营逐渐成为国内外发展的主要趋势。高密度、集约化养殖畜舍内大量繁殖孳生的苍蝇作为动物疫情的重要传播媒介，严重制约着畜牧养殖业的健康发展。长期以来畜舍灭蝇主要依赖于施用伊维菌素(ivermectin,IVM)等大环内酯类、氨基甲酸酯类、有机氯、有机磷、药物的化学杀虫剂。为了保证灭蝇效果，除了空间喷洒和在蝇类停留面施药外，通常还在饲料中全群添加杀灭蝇蛆的药物或者添加剂，用以驱除、杀灭养殖动物体内外的各阶段寄生虫，从而达到控制苍蝇的效果。然而畜舍内大量残存的杀虫剂会严重危害着从业人员的健康；另外，养殖动物因长期大量地接触和摄入杀虫剂而在肝脏和脂肪中蓄积，引起慢性中毒和动物源食品药品残留，给广大人民群众的食品带了极大的安全隐患。
虽然伊维菌素在畜舍苍蝇防治方面起着十分重要的作用，但因其可造成从业人员、养殖动物中毒、引起动物源食品安全等问题。迄今为止，伊维菌素可供临床应用的剂型有浇泼剂、注射剂、片剂、干混悬剂、胶囊剂、舔剂等。但伊维菌素半衰期短，目前有一些关于乳油、粉剂及微胶囊等形式的长效缓释制剂来维持伊维菌素的作用时间和效果的报道，虽能他们延长有效血药浓度时间，实际上却是低剂量重复给药，易产生耐药性。因而，设计开发低毒、低污染的伊维菌素载药系统成为当前绿色养殖的迫切需要。
环境响应型智能微载体材料可以响应光、温度、pH值、磁场、化学物质等环境刺激的微小变化，实现物质的自律式控制释放。与常规剂型相比，环境响应型智能药物在改善药物疗效，降低副作用，具有广泛的应用前景。但是，到目前为止，并没有环境响应型智能绿色灭蝇剂的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统的制备方法，具体采用以下的技术方案：
一种几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统的制备方法，包括以下步骤：将羧酸功能化介孔二氧化硅纳米粒子MSN-COOH作为载体，负载伊维菌素后采用壳聚糖进行包封，然后通过乙酰化反应将包封层转化为几丁质，制得所述几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统IVM@MSN-CT；
所述MSN-COOH由以下步骤制得：通过CTAB和TEOS反应得到介孔二氧化硅纳米颗粒CTAB@MSN，然后将其表面进行氨基化得到CTAB@MSN-NH2，溶于甲醇并加入浓盐酸后于油浴锅内冷凝回流去除孔道CTAB，得到MSN-NH2，最后将表面的氨基羧基化得到MSN-COOH。
几丁质酶是广泛存在于苍蝇等昆虫中肠、蜕皮腺及某些昆虫毒腺中的一类糖蛋白酶，它可以水解昆虫体壁和中肠中的几丁质(又称甲壳素或甲壳质，Chitin,Ct)。由于蜕皮和进食等生理需求，苍蝇在生长发育的过程中需要不断地进行几丁质的合成和降解，因此几丁质代谢系统的正常运转对于苍蝇的正常生长发育至关重要。然而，哺乳动物则不以几丁质代谢作为生命活动的必需系统，故以几丁质酶作为靶标的药物具有对人、畜无害的优点。
鉴于几丁质酶在苍蝇等昆虫和哺乳动物类存在的差异性，以几丁质酶作为靶标的药物因其具有对人、畜无害的优点而有着广阔的应用前景。在该载药系统中，具有毒副作用的杀虫药将被装载到无生理毒性、高比容的介孔纳米材料中，然后通过几丁质将杀虫剂包封于介孔材料之中。由于人、畜等哺乳动物的肠道中并无几丁质水解酶，所以即便饲养者或者养殖动物接触、摄取了该智能纳米药物，包封于介孔纳米孔道中的杀虫剂也不会释放出来引起不良后果；然而蝇类、蚊子等昆虫在摄入该几丁质包封的纳米药物后，纳米药物外层的几丁质会被昆虫体内的几丁质酶降解而导致杀虫剂的释放，进而起到选择性杀灭蝇类、蚊子等昆虫而不伤害人、畜的目的。此外，我们将深入研究构建该智能载药系统时几丁质包被条件对该智能药物的漏药情况及几丁质酶敏感性的影响，通过调控智能纳米药物的制备条件，全面优化该载药系统的体外载药-释药特性；为这一新型智能载药系统的进一步发展提供理论基础和实验依据。这一研究的实施将为绿色兽用灭蝇剂乃至绿色智能杀菌剂、农业杀虫剂甚至是化疗药物等研究领域的发展提供新的导向，对生命科学、农业、医药的发展将具有重要意义。
伊维菌素介孔纳米材料制备的过程相对来说比较繁多，对于介孔纳米材料的制备是影响整个试验的关键。在制备介孔纳米材料的过程中，比较难以控制的是整体介孔纳米材料的粒径问题，无法做到十分的规则整齐，在合成CTAB@MSN的过程中，对于溶液的加入以及温度的把控都有一定的要求，同时在去除介孔表面的CATB过程中，对于反应的进行也介孔表面CATB是否完全清除，这是无法从直接的试验过程中得知的。因此，发明人具体提供了以下优选。
其中，CTAB@MSN的具体制备过程为：将CTAB溶于水后，加入2mol/L NaOH溶液搅拌，并加热至80℃，逐滴滴加TEOS并搅拌2h，CTAB、水、NaOH和TEOS的比例为2g：960mL：7mL：10mL；取下层白色沉淀，抽滤，依次用水和甲醇冲洗，干燥后得到介孔二氧化硅纳米颗粒CTAB@MSN。
CTAB@MSN-NH2的具体制备过程为：将CTAB@MSN、正己烷和硅烷偶联剂按照10g：20mL：10mL的比例混合，常温搅拌48h，离心得到下层白色沉淀，然后用甲醇冲洗，干燥后得到表面氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒CTAB@MSN-NH2。
MSN-NH2的具体制备过程为：将CTAB@MSN-NH2分散于甲醇中，加入浓盐酸，CTAB@MSN-NH2、甲醇和浓盐酸的比例为3g：300mL：5mL，于油浴锅中冷凝回流12h，离心回收下层沉淀，再次分散于与第一次冷凝回流操作等量的甲醇中，加入第一次冷凝回流操作等量的浓盐酸，于油浴锅中冷凝回流12h，离心得下层沉淀，然后用体积比为1:1的三乙胺和甲醇组成的混合液进行清洗，再用甲醇进行清洗，真空干燥，去除多余溶剂，得到MSN-NH2。
MSN-COOH的具体制备过程为：将NH2-MSN加入至DMSO溶液中，然后于0℃的条件下加入丁二酸酐和三乙胺，搅拌1h，然后升温至40℃，搅拌47h，离心回收沉淀后用甲醇洗涤，得到MSN-COOH。
IVM@MSN-CT的具体制备过程为：将MSN-COOH、伊维菌素、甲醇按照500mg：500mg：10mL的比例混合，常温搅拌48h，离心收集固体得IVM@MSN-COOH，然后加入壳聚糖溶液中混匀，随后加入第一添加物搅拌48h，离心收集固体后用水洗涤，真空干燥后得到IVM@MSN-CTS；壳聚糖溶液中的壳聚糖、MSN-COOH和第一添加物的比例为1000g：500mg：500mg；将IVM@MSN-CTS加入至第二添加物中，然后加入第一添加物搅拌48h，离心收集固体后用水洗涤，得到IVM@MSN-CT；IVM@MSN-CT、第一添加物和第二添加物的比例为200mg：400mg：80mL；第一添加物由NHS和EDC按照1:1的质量比混合得到；第二添加物为pH＝5的NaOH溶液和乙酸溶液的混合溶液。在负载伊维菌素时，我们选用了甲醇为溶解伊维菌素的溶剂，主要的目的是伊维菌素在甲醇中的溶解性较好，同时甲醇对于介孔材料载体本身也不会出现相互溶解等问题，其中与介孔材料的性质有关。同时，对于甲醇溶剂，其沸点低便于缩短干燥时间，在恒温真空干燥箱干燥，不会存在在样品中存在残留等问题。
优选地，所述壳聚糖溶液通过以下过程制得：将壳聚糖溶于pH＝1的吗啉乙磺酸溶液中，然后用2mol/L的NaOH溶液调节pH＝5得到。在对壳聚糖进行溶解的时候，我们选择用的是吗啉乙磺酸而不选择用无机酸或者较好溶解的醋酸，主要的原因是像醋酸为羧酸，加入羧基影响介孔材料表面与壳聚糖的结合，进而影响IVM@MSN表面修饰壳聚糖的反应。
根据上述方法制得的几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统IVM@MSN-CT，其在几丁质酶条件下48h内累积释放量为40.8％，能够有效的应用在制备农业杀虫剂和绿色杀菌剂中。
本发明的有益效果为：本发明创造性地以羧酸功能化的MCM-41型介孔纳米材料为载体，在其中载药后，以可修饰的壳聚糖包封，并最后通过乙酰化反应将包封层转化为几丁质制得几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统。本发明通过电镜观察、傅里叶红外光谱、气体吸附等方式对中间体及最终产物进行了表征和鉴定。体外释放结果表明，该递送系统在几丁质酶条件下48h内累积释放量达40.8％，是无几丁质酶条件下释放量的近2倍。其良好的几丁质酶响应性控释特征，能够降低被包封的伊维菌素等杀虫药物在动物体内的泄露而引起的副作用，而选择性地在昆虫体内被几丁质酶抽发释放并杀虫，优化杀虫剂的合理给药。
附图说明
图1所示为IVM@MSN-CT的制备流程图；
图2所示为CTAB@MSN-NH2(a)、MSN-COOH(b)、IVM@MSN-COOH(c)、IVM@MSN-CTS(d)和IVM@MSN-Ct(e)的扫描电镜图；
图3所示为CTAB@MSN-NH2(A)、MSN-COOH(B)、IVM@MSN-COOH(C)、IVM@MSN-CTS(D)和IVM@MSN-Ct(E)的透射电镜图；
图4所示为CTAB@MSN-NH2(A)、MSN-COOH(B)、IVM@MSN-COOH(C)和IVM@MSN-Ct(D)的粒径分布图；
图5所示为CTAB@MSN-NH2、MSN-COOH、IVM@MSN-COOH和IVM@MSN-Ct的Zeta电位图；
图6所示为CTAB@MSN-NH2、MSN-COOH、IVM@MSN-COOH和IVM@MSN-Ct的热重曲线图；
图7所示为CTAB@MSN-NH2、MSN-COOH、IVM@MSN-COOH、IVM@MSN-CTS、IVM@MSN-Ct、IVM和Cs的傅里叶红外光谱图；
图8所示为CTAB@MSN-NH2、MSN-COOH、IVM@MSN-COOH、IVM@MSN-CTS和IVM@MSN-Ct的氮气吸附-脱附等温曲线图；
图9所示为CTAB@MSN-NH2、MSN-COOH、IVM@MSN-COOH、IVM@MSN-CTS和IVM@MSN-Ct的孔径分布曲线图；
图10所示为伊维菌素的紫外吸收光谱图；
图11所示为伊维菌素的标准曲线图；
图12所示为IVM@MSN-CTS和IVM@MSN-Ct的药物释放曲线图；
图13所示为IVM@MSN-Ct的零级拟合曲线图；
图14所示为IVM@MSN-Ct的一级拟合曲线图；
图15所示为IVM@MSN-Ct的Higuchi拟合曲线图。
具体实施方式
以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
以下实施例中使用的实验设备和材料如表1和表2所示。
表1
Figure BDA0003256696700000051
表2
Figure BDA0003256696700000052
实施例1：
一种几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统IVM@MSN-CT，其制备过程如图1所示，具体如下：
(1)介孔二氧化硅纳米颗粒CTAB@MSN的合成
准备2g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶解在960mL双蒸水中，加入7mL浓度为2mol/L的NaOH溶液中，搅拌加热溶液至80℃。逐滴滴加10mL正硅酸乙酯(TEOS)维持原有条件搅拌2h，取得下层白色沉淀，将沉淀通过布氏漏斗抽滤，分别用双蒸水和有机溶液甲醇冲洗，冲洗完毕，将产物放入真空干燥箱干燥过夜得固体粉末CTAB@MSN。
(2)介孔二氧化硅纳米颗粒表面氨基化CTAB@MSN-NH2的合成
取10gCTAB@MSN加入20mL正己烷，混合均匀后加入10mL硅烷偶联剂(3-氨丙基三乙氧基硅烷)，在常温条件搅拌48h，产物离心得下层白色沉淀，加入甲醇洗去多余物质，将沉淀样品放入真空干燥箱得CTAB@MSN-NH2。
(3)介孔二氧化硅纳米颗粒孔道CTAB的清除
取CTAB@MSN-NH2 3g分散于300mL甲醇，加入5mL浓盐酸(质量分数约为37％)，与油浴锅中进行冷凝回流12h，离心回收样品，再次分散于300mL甲醇，加入5mL浓盐酸，再次循环回流12h，离心得下层沉淀，用三乙胺：甲醇(质量比为1:1)清洗后，再用甲醇洗去多余物质，进行真空干燥，除去多余溶剂，即得MSN-NH2。
(4)介孔二氧化硅纳米粒子表面氨基羧基化
将10g的NH2-MSN加入约15mL的二甲基亚砜(DMSO)溶液中，然后于0℃分别加入丁二酸酐(7.5g)和三乙胺(7.5mL)，维持此温度搅拌1h，后升温至40℃搅拌47h，产物经离心回收，并用甲醇洗涤数次直至DMSO、三乙胺和过量的丁二酸酐全部除掉，即得MSN-COOH。
(5)IVM@MSN-CTS的合成
取500mg羧基化功能介孔二氧化硅纳米粒子MSN-COOH和500mg伊维菌素于10mL甲醇，常温搅拌48h，离心收集固体样品得IVM@MSN-COOH；取1000g壳聚糖溶于pH＝1的吗啉乙磺酸溶液100mL用2mol/L的NaOH溶液调节pH＝5，加入介孔二氧化硅纳米材料搅拌均匀后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的混合物(质量比为1：1)500mg搅拌48h，离心回收样品用双蒸水洗涤数次，真空干燥即得IVM@MSN-CTS。
(6)IVM@MSN-CTS转化IVM@MSN-Ct
配置1％的乙酸溶液，用2mol/L的NaOH溶液调节溶液至pH＝5，从中取出80mL加入IVM@MSN-CTS 200mg，搅拌均匀加入NHS和EDC的混合物(质量比为1：1)400mg搅拌48h，离心回收样品，用双蒸水洗涤即得IVM@MSN-CT产物。
效果测试：
(1)对实施例1中制得的CTAB@MSN-NH2、MSN-COOH、IVM@MSN-COOH、IVM@MSN-CTS和IVM@MSN-Ct进行形貌分析，冷场发射扫描电子显微镜测试为日本日立-S4800型；样品制备：将固体样品均匀粘到导电胶上，喷金，再粘到样品台上，进样，抽真空，过电子进行扫描。
其扫描电镜图如图2所示。由图2可知，IVM@MSN-Ct在扫描电子显微镜下呈现出粒径大小相对均匀，形貌呈球形及类球形，扫描电镜显示在高倍率下，由直径200～300nm圆球组成的，分散性能一般，造成这种原因归咎于制备过程中使用较多的溶剂纳米药物由于其扫描电镜照都具有相似的结构，且图中并未见明显的伊维菌素IVM晶体，初步可以断定伊维菌素进入载体纳米材料内部，形成一个整体，负载于介孔材料孔道内部。
同时，还通过透射电镜对上述化合物的微观结构进行了观察，场发射透射电子显微镜测试为美国FEI-Tecnai G2型。样品制备：将样品加入到合适溶剂中，进行超声分散处理，然后滴到铜网上或者铜网捞样，自然晾干，进高真空观察形貌，加电压，选取较好的形貌拍照，保存照片。
其结果如图3所示。由图3可知，A是未去除纳米粒孔道结构，B、C和D是去除纳米粒孔道之后的结构，可以清晰可见蜂窝状的孔道结构；如D、E是载入伊维菌素药物，外部加以壳聚糖修饰后，所产生的结果，因壳聚糖修饰进行了两步反应，故根据E不难看出，随着壳聚糖在纳米材料外部修饰，其蜂窝状孔道结构明显模糊，以至部分区域消失。同样根据C、D可以表明，伊维菌素药物载入对纳米粒结构不会造成损坏或变化，依旧维持基本的圆球形。从上述图中，根据样品的不同区域获得大多部分图像，同样证实伊维菌素纳米粒样品的粒径较小，粒径平均为200～300nm左右。
(2)对实施例1中制得的CTAB@MSN-NH2、MSN-COOH、IVM@MSN-COOH和IVM@MSN-Ct进行粒径测试，其结果如图4所示。
根据粒径粒度分析仪，主要是为了通过代表性扫描颗粒数目进行统计。因为我们合成的样品含有少量大颗粒，同时在动态光散射的计算原理会导致平均粒径有误，故一般我们选择在本次试验中，采用粒径分布的最高点对应的粒径值来表示平均粒径。其中，样品CTAB@MSN-NH2显示图4的A其中平均粒径为122.4nm，样品MSN-COOH显示图4的B其中平均粒径为217.6nm，样品IVM@MSN-COOH显示图4的C其中平均粒径为257.8nm，样品IVM@MSN-Ct显示图4的D其中平均粒径为261.7nm。根据粒径图显示伊维菌素介孔纳米材料平均粒径在200nm左右，符合之前对介孔纳米材料的表征要求。
(3)对实施例1中制得的CTAB@MSN-NH2、MSN-COOH、IVM@MSN-COOH和IVM@MSN-Ct进行Zeta电位测试，其结果如图5所示。
利用Zeta电位对介孔二氧化硅负载伊维菌素表面功能化过程进行了检测。根据图5可以看出在未进行去除孔道结构前，CTAB@MSN-NH2表现出正电位(23.2±0.53mV)，此原因是在CTAB@MSN-NH2表面有氨基，氨基在水中显碱性同时与酸结合带正电，同时介孔二氧化硅是以CTAB(阳离子表面活性剂)为模板制备，所以呈现正电形式。而我们将其表面进行功能化修饰之后，介孔纳米材料由原来的正电，发生了逆转变为了负电。这原因归于因进行功能化修饰后，我们将MSN-NH2上的氨基，变成了MSN-COOH表面的羧基，既表现出负电位(-28.03±0.29mV)。当介孔材料负载伊维菌素后，电位显示为(-29.46±0.44mV)因伊维菌素表面是不存在电荷的，故电位点显示并未引起明显的顺逆差异。当我们进行后壳聚糖表面修饰后，电位发生了变化显示为(-20.3±1.13mV)。并没有发生我们之前设想的进行逆转电位，可能的原因是因介孔材料的表面中，依旧存在多数的羧基，没有被壳聚糖所取代，但是还是有部分羧基被取代了，所以根据图像显示依然会发现电位增大的情况。总体上根据Zeta电位上的情况分析，较好的地反应介孔表面功能化。
(4)对实施例1中制得的CTAB@MSN-NH2、MSN-COOH、IVM@MSN-COOH和IVM@MSN-Ct进行热重分析，热重分析选用的是PerkinElmerTGA4000型，样品处理：将称取少量样品研磨均匀，放入坩埚中，放入仪器中等待显示平稳，选择在通入N2环境下，样品的加热速率调节为10℃/min。其结果如图6所示。
通过对样品的热稳定性分析，如图6所示CTAB@MSN-NH2、MSN-COOH、IVM@MSN-COOH和IVM@MSN-Ct的TGA曲线中减重分别为19.74％、25.91％、42.53％和53.71％。可以看出介孔材料载体以及通过介孔材料负载的伊维菌素在100℃～400℃的失重现象是相似的，在300℃～500℃，IVM@MSN-COOH和IVM@MSN-CS都存在明显的失重现象，主要是负载在介孔材料孔道中的伊维菌素经高温分解导致的。对比MSN-COOH和IVM@MSN-COOH，可以看出在整个高温区域失重率比载体材料多16.62％，此失重率与伊维菌素负载介孔中的载药量相吻合。而IVM@MSN-Ct曲线中可以看出，介孔材料表面的几丁质对纳米粒子的改性产生的结果。通过热重分析的结果，进一步证明负载伊维菌素是成功的。
(5)对实施例1中制得的CTAB@MSN-NH2、MSN-COOH、IVM@MSN-COOH、IVM@MSNCTS和IVM@MSN-Ct，以及IVM(伊维菌素原料药)和Cs(壳聚糖)进行傅里叶红外光谱测定，样品制备方法为：取一定量的KBr放入研钵干燥，后加入一定量的样品和KBr混合，用研钵研碎，用压片机压成片。其结果如图7所示。
不同载体材料官能团，在负载伊维菌素前后的红外光谱也较为不同，如图7所示，载体材料MSN-COOH和纳米药物IVM@MSN-Ct的傅里叶红外光谱图上分别位于462cm-1、799cm-1、1080cm-1处的吸收峰依次是介孔二氧化硅中Si—O—Si的弯曲振动的吸收、对称伸缩振动和不对称伸缩振动。伊维菌素存在特征吸收峰2967.15cm-1甲基不对称伸缩，1730.84cm-1饱和烃脂肪酮伸缩振动，1680.76cm-1酰胺I带吸收峰。与MSN-COOH相比，在经过负载处理IVM@MSN-Ct在1688cm-1出现新吸收峰，表明伊维菌素负载介孔纳米材料中。通过对MSN-COOH与IVM@MSN-Ct对比分析，表明IVM@MSN与壳聚糖通过缩合反应耦联，在1636cm-1发现酰胺键(-NH-CO-)振动增强，说明壳聚糖已包裹在介孔纳米材料表面。以上对比可以进一步证明通过负载伊维菌素后的介孔纳米材料，同时进行过壳聚糖的修饰所获得的最终产物是比较成功的。
(6)对实施例1中制得的CTAB@MSN-NH2、MSN-COOH、IVM@MSN-COOH、IVM@MSNCTS和IVM@MSN-Ct进行氮气吸附-脱附分析，氮气吸附-脱附试验采用的是美国康塔仪器公司Autosorb-IQ型，主要通过体积法(真空容量法)将气体分子作为吸附探针，基于被校准过的体积和压力，进入样品管的总气体量和自由空间中的气体量的差值计算出吸附量，数据通过分析BET-BJH方法计算样品的比表面积和孔径。其结果如图8-9和表3所示。
氮气吸附-脱附等温线主要用于评价介孔纳米材料负载的伊维菌素情况以及为整体载药体系提供有效证据。根据图8的氮气吸附-脱附图形显示，介孔材料整体的图形表现为Ⅳ型特征，相对压力P/P0在0.2～0.4之间有明显增大的趋势。
表3
Figure BDA0003256696700000091
根据表3的记载和图9关于孔径的分布曲线可知，载体MSN-COOH的BET比表面积为1000.181m2/g，单点的孔容为1.2032cm3/g与未去除孔道前CTAB@MSH-NH2的BET比表面积为623.191m2/g，单点的孔容为0.4629cm3/g，经过负载伊维菌素后比表面积减少至661.688m2/g，孔容变回0.4275cm3/g，同时孔径也出现明显减少现象。由此可以看出原先介孔材料内的CTAB被清除，经负载伊维菌素后，伊维菌素进入原先介孔材料CTAB中的部分，此变化可以说明伊维菌素负载介孔材料中的孔道内空间。而经负载伊维菌素后，我们对其外表进行壳聚糖功能化处理，从IVM@MSN-CTS我们进行第一步的反应，介孔材料的比表面积进一步减小，同时孔容和孔径也都发生减少，说明我们进行的壳聚糖表面功能化修饰的成功的。然后通过乙酸化修饰，进一步反应生成最终产物IVM@MSN-Ct，不难看出材料BET比表面积减小为173.465m2/g，孔容减小至0.0769cm3/g。该变化猜测是介孔伊维菌素纳米材料表面有壳聚糖进行功能化修饰之后，壳聚糖汇聚在表面覆盖多数介孔孔道或有壳聚糖分子进入孔道空间内，导致其孔容和比表面积都减小，符合预期试验设想。
(7)取伊维菌素甲醇溶液，在200～700nm范围内进行波长扫描，其结果如图10所示。根据伊维菌素紫外吸收特征，在245nm处选择最大吸收波长为检测波长。
伊维菌素标准曲线的绘制，采用的是紫外分光光度计法。通过伊维菌素波长扫描测定，选用在245nm下测定。伊维菌素在0～50mg/L浓度范围内与吸光度有较好的线性关系，其中，横坐标代表的是浓度，纵坐标代表的是吸光度：其线性回归方程如图11所示，具体为Y＝0.0344X+0.0225，R2＝0.9991。
称取500mg伊维菌素药物，溶解在10mL的甲醇溶剂中，加入纳米材料介孔二氧化硅纳米粒子MSN-COOH 500mg，至于机械搅拌器中搅拌，调节转速为1000r/min，密闭搅拌48h，后进行离心，调节转速10000r/min，取上清液进行稀释一定的倍数，并检测上清稀释液在245nm处的吸光值，根据标准曲线计算伊维菌素浓度。最后通过计算负载的量m＝(M-ma)/M其中M为加入体系中伊维菌素的量，ma为根据吸光度算出上清液中伊维菌素的含量，m为载药量，计算得载药量为11.0％。
(8)对实施例1中制得的IVM@MSNCTS和IVM@MSN-Ct进行药物释放性能测定。评价伊维菌素纳米药物体外释放性能。
具体方法为：称取一定量的纳米材料IVM@MSN-Ct分散在5mL释放溶媒中，装入MD44透析袋中，放入50mL的30％甲醇的pH＝7.4的PBS缓冲溶液中进行透析，密闭下进行释放。设定5mL释放溶媒条件为含有几丁质酶和未含有几丁质酶，每组别设置3组平行试验，整体的释放试验温度控制为37℃，调节适宜的恒温振荡器振荡速度。每隔0、30、60、120、240、480、1440、2880min时间点分别吸取一定量6组试验中透析袋外的缓冲溶液，测定其吸光度。测试完倒回原溶液中进行释放，根据测定所取得缓冲溶液吸光度值，伊维菌素的紫外光谱，计算不同时间的释药率。
本试验研究主要围绕几丁质酶能否发挥效果以及通过衡量累积溶出率来确定释放指标。根据图12可以看出，伊维菌素介孔纳米药物IVM@MSN-Ct受几丁质酶响应释放影响较为明显，在模拟溶剂的环境下，伊维菌素药物本身释放性能以及速度就偏小。加入几丁质酶的组别，从释放速率以及整体的累积溶出都比未加入酶的组别更快。这体现出酶响应释放的优势，IVM@MSN-Ct伊维菌素在含有酶的条件下，经过24h累积溶出为33.11％，未含酶的组别释放为16.63％。经过酶反应的累积，随着酶效果的发挥介孔材料表面几丁质被水解，在48h后，IVM@MSN-Ct累积溶出达40.8％，相比于未加入酶IVM@MSN-Ct组别21.15％，是其释放效果2倍。由此可以说明由于几丁质酶的加入，水解破坏了介孔材料表面的几丁质，原本伊维菌素所负载在介孔的孔道里面，介孔材料表面的通道被打开，随着酶的水解，原先包裹在介孔材料表面的几丁质减少，介孔的孔道增多，故伊维菌素从孔道中释放的速度加快，累积的释放也就增加。由于介孔材料本身所能负载的伊维菌素的量就较少，负载性能较弱，所以整体的累积溶出率较低。由于对于介孔材料表面进行功能化修饰时，壳聚糖联接到介孔材料IVM@MSN是比较有限的，并不能完全将介孔材料表面所有的羧基都反应完，故在产物IVM@MSN-Ct中，本身孔道就占据一定的数量，所以对于介孔材料本身，在未含有酶的情况下是会存在释放的情况。
对于IVM@MSN-CTS介孔材料，同样我们也进行了对比试验，分为试验组含几丁质酶和未含几丁质酶，主要的目的是为了验证进行第一步的修饰后，既单纯的进行一步壳聚糖的合成，几丁质酶对壳聚糖能否发挥效果。根据释放结果显示，几丁质酶对IVM@MSN-CTS未产生效果，故在累积释放48h后，含有几丁质酶组别和未含有几丁质组别，累积释放率在18％左右，整体的释放曲线释放趋势也未有明显的差异。对此可以看出，只有经过乙酸化之后的介孔材料IVM@MSN-Ct将表面的壳聚糖转化为几丁质，几丁质酶才会发挥出水解效果。这是符合预期的效果，说明介孔材料IVM@MSN-Ct具有较好的控释效果，同时也满足伊维菌素介孔纳米材料的靶向释放特点，在有几丁质酶的条件下能快速释放，在未含有几丁质酶的情况下释放缓慢或者几乎不释放的效果。
(9)对实施例1中制得的IVM@MSN-Ct进行药物释放机理研究。
药物体外释放机制可以分为扩散与溶蚀释药。而缓控释药物释放数学模型通常有零级释药模型、一级释药模型和Higuchi方程模型。本试验选用三种模型对介孔材料IVM@MSN-Ct的释放曲线进行拟合分析，根据R2值确定最佳拟合模型。
零级释放是指药物根据释放周期以恒定的速率进行释放。通过对介孔材料IVM@MSN-Ct释放情况进行零级释放拟合如图13所示，根据拟合结果，拟合曲线常数R2小于0.9说明介孔材料IVM@MSN-Ct释放不属于恒定速率释放。
一级释放拟合的方程为Ln(1-mt/m∞)＝-kt(一级方程)，对介孔材料IVM@MSN-Ct释放情况进行一级释放拟合如图14所示，其中含酶的IVM@MSN-Ct与未含酶的IVM@MSN-Ct释放曲线，经过拟合后发现拟合曲线常数R2都在0.95以上，说明一级模型较符合纳米药物IVM@MSN-Ct的释放机制。
Higuchi模型的拟合是根据一级释放模型的基础上进行的拓展，同样适合研究药物的扩散机理，其主要是表示Fick扩散释药机制。其中Higuchi的拟合方程为Mt/M∞＝kt1 /2，Mt为t时刻的累积释放量，M∞为t＝∞时的累积释放量。通过对纳米药物IVM@MSN-Ct释放曲线进行Higuchi拟合，如图15可以看出拟合后的相关系数R2分别为0.9711和0.9746，都处于0.95以上。说明纳米药物IVM@MSN-Ct的释放机制是属于扩散作用，满足其作为控释制剂的要求。
通过扫描电镜、透射电镜、粒径以及Zeta电位分析、傅里叶红外光谱、热重分析以及气体吸附-脱附分析，主要对制备的介孔纳米材料进行结构表征，来证明介孔材料合成的每个环节的有效性。通过对伊维菌素介孔纳米材料的结构表征，我们可知，合成的介孔纳米材料整体粒径为200～300nm，在形态上为规则较好的近似圆球形。BET中看出介孔材料的孔径约为2.1～2.5nm。对于伊维菌素的负载，介孔材料在结构上并未发生变化，说明伊维菌素负载是进入到孔道里面的，同时伊维菌素也未发生化学反应，为单纯的负载。
通过对几丁质酶响应性释放试验结果分析表明，几丁质酶对IVM@MSN-Ct具有较好的控释效果，在经过48h的累积释放中，可以达到40.8％。对于伊维菌素介孔材料表面未含有几丁质的样品，几丁质酶未发挥明显的效果，释放曲线的趋势与累积的释放率与未放入几丁质酶的IVM@MSN-Ct趋势是接近的。既可在此方面表明，对于一些不含有几丁质酶的生物，其体内对于此药物的释放是缓慢的或几乎不释放介孔材料孔道内的伊维菌素，只有当介孔材料表面的几丁质被水解，伊维菌素从孔道中释放，发挥效果，这是符合试验纳米药物靶向传递。
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。

Claims (9)

1.一种几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将羧酸功能化介孔二氧化硅纳米粒子MSN-COOH作为载体，负载伊维菌素后采用壳聚糖进行包封，然后通过乙酰化反应将包封层转化为几丁质，制得所述几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统IVM@MSN-CT；
所述MSN-COOH由以下步骤制得：通过CTAB和TEOS反应得到介孔二氧化硅纳米颗粒CTAB@MSN，然后将其表面进行氨基化得到CTAB@MSN-NH2，溶于甲醇并加入浓盐酸后于油浴锅内冷凝回流去除孔道CTAB，得到MSN-NH2，最后将表面的氨基羧基化得到MSN-COOH。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，CTAB@MSN的具体制备过程为：将CTAB溶于水后，加入2 mol/L NaOH溶液搅拌，并加热至80 ℃，逐滴滴加TEOS并搅拌2 h，CTAB、水、NaOH和TEOS的比例为2 g：960 mL：7 mL：10 mL；取下层白色沉淀，抽滤，依次用水和甲醇冲洗，干燥后得到介孔二氧化硅纳米颗粒CTAB@MSN。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，CTAB@MSN-NH2的具体制备过程为：将CTAB@MSN、正己烷和硅烷偶联剂按照10 g：20 mL：10 mL的比例混合，常温搅拌48 h，离心得到下层白色沉淀，然后用甲醇冲洗，干燥后得到表面氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒CTAB@MSN-NH2。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，MSN-NH2的具体制备过程为：
将CTAB@MSN-NH2分散于甲醇中，加入浓盐酸，CTAB@MSN-NH2、甲醇和浓盐酸的比例为3g：300 mL：5 mL，于油浴锅中冷凝回流12 h，离心回收下层沉淀，再次分散于与第一次冷凝回流操作等量的甲醇中，加入第一次冷凝回流操作等量的浓盐酸，于油浴锅中冷凝回流12h，离心得下层沉淀，然后用体积比为1:1的三乙胺和甲醇组成的混合液进行清洗，再用甲醇进行清洗，真空干燥，去除多余溶剂，得到MSN-NH2。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，MSN-COOH的具体制备过程为：
将NH2-MSN加入至DMSO溶液中，然后于0 ℃的条件下加入丁二酸酐和三乙胺，搅拌1 h，然后升温至40 ℃，搅拌47 h，离心回收沉淀后用甲醇洗涤，得到MSN-COOH。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，IVM@MSN-CT的具体制备过程为：
将MSN-COOH、伊维菌素、甲醇按照500 mg：500 mg：10 mL的比例混合，常温搅拌48 h，离心收集固体得IVM@MSN-COOH，然后加入壳聚糖溶液中混匀，随后加入第一添加物搅拌48 h，离心收集固体后用水洗涤，真空干燥后得到IVM@MSN-CTS；壳聚糖溶液中的壳聚糖、MSN-COOH和第一添加物的比例为1000 g：500 mg：500 mg；
将IVM@MSN-CTS加入至第二添加物中，然后加入第一添加物搅拌48 h，离心收集固体后用水洗涤，得到IVM@MSN-CT；IVM@MSN-CT、第一添加物和第二添加物的比例为200 mg：400mg：80mL；
第一添加物由NHS和EDC按照1:1的质量比混合得到；第二添加物为pH=5的NaOH溶液和乙酸溶液的混合溶液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述壳聚糖溶液通过以下过程制得：将壳聚糖溶于pH=1的吗啉乙磺酸溶液中，然后用2 mol/L的NaOH溶液调节pH=5得到。
8.一种几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统，其特征在于，由权利要求1至7任一项所述的制备方法制得。
9.根据权利要求8所述的几丁质酶响应性伊维菌素介孔基纳米递送系统，其特征在于，其在几丁质酶条件下48 h内累积释放量为40.8 %。
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