CN113747922A - Glp-1分泌促进用组合物 - Google Patents

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Abstract

期待更优异的GLP‑1分泌促进成分的开发。根据本发明，提供一种GLP‑1分泌促进用组合物，其特征在于，含有乳化粒子，该乳化粒子含有GLP‑1分泌促进成分和水中油型乳化剂。

Description

GLP-1分泌促进用组合物
技术领域
本发明涉及含有乳化粒子的GLP-1分泌促进用组合物等，所述乳化粒子含有GLP-1分泌促进成分和水中油型乳化剂。
背景技术
GLP-1[胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1)]为由消化道粘膜上皮等分泌的激素。作为GLP-1的作用，已知胰岛素合成或分泌的刺激、胰高血糖素分泌的阻碍、食物摄取阻碍、高血糖症的降低等。通过使GLP-1的分泌活性化，可期待这些作用的提高。
在专利文献1中，作为新型GLP-1分泌促进成分，记载有苦瓜中所含的11种葫芦烷型三萜类。此外，专利文献2中记载有甜菊苷、瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷D具有促进GLP-1的分泌的性质的主旨。
专利文献
专利文献1：国际公开第2017/159725号
专利文献2：国际公开第2017/018404号
发明内容
本发明期待更优异的GLP-1分泌促进成分的开发。
本发明的一种方式提供以下内容。
[1]一种GLP-1分泌促进用组合物，其特征在于，含有乳化粒子，该乳化粒子含有GLP-1分泌促进成分和水中油型乳化剂。
[2]根据上述[1]所述的组合物，其特征在于，所述水中油型乳化剂的HLB值为7～18。
[3]根据上述[1]或[2]所述的组合物，其特征在于，所述水中油型乳化剂包含选自聚甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、酶处理卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯及有机酸单甘油酯中的至少1种的乳化剂。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的组合物，其特征在于，所述水中油型乳化剂的亲水基包含磷酸基。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的组合物，其特征在于，所述GLP-1分泌促进成分包含糖苷甜味剂。
[6]根据上述[5]所述的组合物，其特征在于，所述糖苷甜味剂包含选自瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、罗汉果皂苷V及甜菊苷中的至少1种。
[7]根据上述[1]～[4]中任一项所述的组合物，其特征在于，所述GLP-1分泌促进成分包含选自单糖、双糖、蔗糖衍生物、氨基酸、肽、蛋白质、糖蛋白质、脂质及脂肪酸中的至少1种。
[8]根据上述[1]～[4]中任一项所述的组合物，其特征在于，所述GLP-1分泌促进成分包含乳蛋白质、卵黄蛋白质、卵白蛋白质、大豆蛋白质、小麦蛋白质、豌豆蛋白质、黏蛋白、蛋白多糖或它们的加工品。
[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳化粒子不在核中含有GLP-1分泌促进成分。
[10]根据上述[1]～[9]中任一项所述的组合物，其特征在于，所述GLP-1分泌促进成分通过平板法测定的表面张力为40～70mN/m。
[11]根据上述[1]～[10]中任一项所述的组合物，其特征在于，所述水中油型乳化剂相对于所述GLP-1分泌促进成分的比例为0.001～50质量％。
[12]根据上述[1]～[11]中任一项所述的组合物，其特征在于，以0.1～5质量％的比例含有所述水中油型乳化剂。
[13]根据上述[1]～[12]中任一项所述的组合物，其特征在于，以1～99.9质量％的比例含有所述GLP-1分泌促进成分。
[14]根据上述[1]～[13]中任一项所述的组合物，其特征在于，用于改善糖代谢、用于抑制食欲或用于预防或改善糖尿病或肥胖症。
[15]一种GLP-1分泌促进用饮料，其特征在于，含有上述[1]～[14]中任一项所述的组合物。
[16]一种GLP-1分泌促进用食品，其特征在于，含有上述[1]～[14]中任一项所述的组合物。
[17]一种医药组合物，其特征在于，含有上述[1]～[14]中任一项所述的组合物。
[18]一种GLP-1分泌促进用组合物的制造方法，其特征在于，包含将水中油型乳化剂、水性介质和油脂搅拌形成乳化粒子，制备含有乳化粒子的混合物的工序，及将所述含有乳化粒子的混合物和含有GLP-1分泌促进成分和水性介质的含有GLP-1分泌促进成分的混合物混合的工序。
在本发明中，使组合物中存在含有GLP-1分泌促进成分和水中油型乳化剂的乳化粒子，可提高GLP-1分泌促进成分的GLP-1分泌促进效果。
附图说明
图1为表示实验例1中的各种甜味剂的GLP-1分泌量的图表。
图2为表示实验例2中所得的含有瑞鲍迪苷C(以下，有时将瑞鲍迪苷简称为Reb。)的试样的浓度与GLP-1分泌量的关系的图表。
图3为表示实验例3中所得的含有甜菊苷的试样的浓度与GLP-1分泌量的关系的图表。
图4为表示实验例4中所得的含有瑞鲍迪苷A的试样的浓度与GLP-1分泌量的关系的图表。
图5为表示实验例5中所得的含有RebA乳化物的试样的浓度与GLP-1分泌量的关系的图表。
图6为表示实验例6中的各种甜味剂所具有的表面张力的图表。
图7为表示实验例7中的RebA的香味特性的图表。
图8为表示实验例8～13中所得的各种试样的浓度与GLP-1分泌量的关系的图表。
图9为表示实验例8中所得的含有RebA的试样的浓度与GLP-1分泌量的关系的图表。
图10为表示实验例9中所得的含有RebA乳化物的试样的浓度与GLP-1分泌量的关系的图表。
图11为表示实验例10中所得的含有乳化粒子的试样的浓度与GLP-1分泌量的关系的图表。
图12为表示实验例11中所得的含有RebA的试样和含有乳化粒子的试样的混合液的浓度与GLP-1分泌量的关系的图表。
图13为表示实验例12中所得的含有甘油的试样的浓度与GLP-1分泌量的关系的图表。
图14为表示实验例13中所得的含有MCT油的试样的浓度与GLP-1分泌量的关系的图表。
图15为表示实验例15～20中所得的各种试样的细胞毒性(以死细胞为指标)的图表。a为自投用起2小时后，b为24小时后的结果。
图16为表示实验例21～31中所得的各种试样的GLP-1分泌量的图表。a为自投用起2小时后，b为24小时后的结果。
图17为表示实验例32中所得的各甜菊醇糖苷的分配比率与试验中的情况的照片。
图18为表示在实验例32中，试验后的含有RebA的溶液的状态的照片。
图19为表示实验例33中的保管温度对香味特性的影响的图。
图20为表示实验例33中的振动环境下的稳定性的图。
图21为表示实验例33中的基于乳化的甜味强度的降低程度的图。
图22为表示实验例34中的GLP-1分泌量的图。
具体实施方式
通过本发明者的研究得知，通过在组合物中含有：含有RebA等GLP-1分泌促进成分和水中油型乳化剂(以下，有时仅称作乳化剂。)的乳化粒子，可实现更优异的GLP-1分泌促进能力。
＜GLP-1分泌促进成分＞
GLP-1分泌促进成分是指以下物质或组合物，该物质或组合物具有其自身作用于人类或具有GLP-1分泌能力的非人类动物的细胞而使GLP-1的分泌量增加的性质(以下，称作GLP-1分泌促进能力。)。
将具有GLP-1分泌促进能力的物质或组合物提供给GLP-1分泌细胞时，GLP-1分泌量增多。GLP-1分泌量的多少可通过与实验例相同的方法来确认。即，准备含有被检物质或组合物的样本，以及除了不含被检物质或组合物以外具有相同组成的无刺激阴性对照样本，在相同条件下将两样本提供给具有GLP-1分泌能力的来自人类结肠的细胞(例如H716)，确认与无刺激阴性对照样本相比GLP-1分泌量的多/少。
在一种方式中，本发明中使用的GLP-1分泌促进成分优选为两亲性。“两亲性”是指“分子及原子团中，同时具有与水的亲和性大的部分(亲水基)和亲和性小的部分(疏水基)两者”(参考：数字大辞泉)。
两亲性的GLP-1分泌促进成分有具有比水小的表面张力的倾向。
两亲性的GLP-1分泌促进成分优选包含糖苷甜味剂。糖苷甜味剂优选包含具有GLP-1分泌促进能力的甜菊醇糖苷或罗汉果皂苷(以下，有时将罗汉果皂苷简称为Mog。)，更优选包含瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、甜菊萃取物、具有键合有鼠李糖的结构的甜菊醇糖苷、甜菊苷及罗汉果皂苷V，进一步优选包含瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、甜菊苷及罗汉果皂苷V。
上述糖苷甜味剂优选具有以下任一种表面张力Q(mN/m)。
Q＝40～70、45～65、40～60、50～70、58～63、59～62、60～61、50～63、51～63、52～63、53～63、54～63、55～63、56～63、57～63、59～63、60～63、58～62、58～61、58～60
表面张力Q通过平板法来测定。例如，以通过蔗糖换算达到Brix10的量，调配作为被检物质的糖苷甜味剂，制备水溶液。通过使用自动表面张力计(CBVP-Z型，协和界面科学公司制)的平板法测定制备的水溶液的表面张力。
从对于饮食品的适用等的观点出发，作为具有GLP-1分泌促进能力的糖苷甜味剂，优选甜菊醇糖苷，瑞鲍迪苷A最为优选。
作为糖苷甜味剂以外的GLP-1分泌促进成分，例如可列举葡萄糖等单糖类、蔗糖等双糖类、三氯蔗糖等蔗糖衍生物等(参考：Hyeung-Jin Jang et al.,"Gut-expressedgustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1"PNAS,2007,vol.104,no.38,15069-15074)。作为单糖类、双糖类，此外可列举果糖；麦芽糖；乳糖；稀少糖等。单糖类、双糖类也可在含于高果糖糖浆；果糖葡萄糖糖浆；葡萄糖果糖糖浆；低聚糖；蜂蜜；甘蔗榨汁液(黑糖蜜)；砂糖(白糖、三温糖、黑糖、和三盆等)；枫糖浆；糖蜜；麦芽糖等中的状态下使用。此外，还可列举谷氨酰胺等氨基酸、二肽、三肽等肽、蛋白质、糖蛋白质、脂质、脂肪酸等(参考：Gwen Tolhurst et al.,"Nutritional regulation ofglucagon-like peptide-1secretion"J Physiol587.1(2009)pp 27-32)。作为蛋白质，可列举包括酪朊、酪朊盐或乳清蛋白质的乳蛋白质、卵黄蛋白质、卵白蛋白质、大豆蛋白质、小麦蛋白质、豌豆蛋白质或它们的加工品等。作为糖蛋白质，可列举黏蛋白、蛋白多糖或它们的加工品等。糖苷甜味剂以外的GLP-1分泌促进成分优选包含乳蛋白质、卵黄蛋白质、卵白蛋白质、大豆蛋白质、小麦蛋白质、豌豆蛋白质、黏蛋白、蛋白多糖或它们的加工品。
＜乳化剂＞
本发明中使用的乳化剂为水中油型乳化剂。
就水中油型乳化剂而言，HLB值优选为7～18、9～18、11～18、13～18、15～18、7～17、7～15、7～13、7～11、7～9、9～16或11～14。
在本发明中，HLB值通过Griffin法来计算。
在本发明中，并无限定，可使用已知的水中油型乳化剂。例如，作为水中油型乳化剂，在HLB值为上述任一值的条件下，可列举单甘油酯、有机酸单甘油酯、聚甘油脂肪酸酯等甘油脂肪酸酯；山梨糖醇苷脂肪酸酯；蔗糖脂肪酸酯；丙二醇脂肪酸酯；硬脂酰乳酸盐；聚山梨醇酯；植物卵磷脂、卵黄卵磷脂、分离卵磷脂、酶处理卵磷脂等卵磷脂类；皂皮树萃取物、丝兰萃取物；植物性甾醇；鞘脂类；胆汁粉末；动物性甾醇等。
水中油型乳化剂在HLB值为上述任一值的条件下，优选包含选自聚甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、酶处理卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯及有机酸单甘油酯中的至少1种。
或者，所使用的乳化剂，在HLB值为上述任一值的条件下，优选包含亲水基为来自甜味成分的乳化剂，特别优选包含选自聚甘油脂肪酸酯及蔗糖脂肪酸酯中的至少1种的乳化剂。
此外进一步，乳化剂，在HLB值为上述任一值的条件下，优选包含亲水基包含磷酸基的乳化剂，特别优选包含卵磷脂类。
在本发明的组合物中，存在含有GLP-1分泌促进成分和水中油型乳化剂的乳化粒子。
在本发明中，所谓“乳化粒子”是指来自乳化剂的分子或离子集合而成的胶体粒子。在乳化剂的领域中，胶体粒子有时根据大小分别称作胶粒、纳米乳浊液、乳浊液等(参考：Toshiyuki Suzuki,J.Soc.Cosmet.Jpn.,Vol.44,No.2,2010)，本发明中的“乳化粒子”包括这些全部。
在本发明的组合物中，乳化粒子优选不在核中含有GLP-1分泌促进成分。“乳化粒子不在核中含有GLP-1分泌促进成分”是指至少一部分的乳化粒子不在核中含有GLP-1分泌促进成分，优选至少一部分的GLP-1分泌促进成分既不含于乳化粒子的核中也不含于壳中，为未被乳化的非乳化状态。“核”是指乳化粒子的中心部(核)。使用水中油型乳化剂时，核尤其由乳化剂的疏水基围成。壳位于核的外侧，主要为由乳化剂的亲水基至疏水基的部分形成的区域。
<组合物>
乳化剂相对于GLP-1分泌促进成分的比例(质量％)，优选为0.001～50、0.005～50、0.01～50、0.05～50、0.1～50、0.4～50、0.7～50、1～50、5～50、10～50、20～50、30～50、40～50、0.001～40、0.001～30、0.001～20、0.001～10、0.001～5、0.001～1、0.001～0.5、0.001～0.1、0.005～40、0.01～30、0.05～20、0.1～10、0.4～5或0.7～1质量％。
或者，乳化剂相对于GLP-1分泌促进成分的比例(质量％)优选为5～200、7～200、9～200、10～200、30～200、50～200、70～200、90～200、110～200、130～200、150～200、170～200、5～180、5～160、5～140、5～120、5～100、5～80、5～60、5～40、5～30、5～20、7～180、9～160、10～140、30～120、50～100、10.0～180、10.0～160、10.0～140、10.0～120、10.0～100、10.0～80或10.0～60质量％。
本发明的组合物中的乳化剂的含有比例(质量％)，优选为0.1～5、0.1～4、0.1～3、0.1～2、0.1～1、0.3～5、0.5～5、0.7～5、0.9～5、1.1～5、2.1～5、3.1～5、4.1～5、0.3～4、0.5～3、0.7～2、0.9～1、0.3～5、0.5～5.0、0.7～5.0、0.9～5.0、1～5.0、1.5～5.0、2～5.0、2.5～5.0、3～5.0、3.5～5.0、4～5.0、4.5～5.0、0.1～4、0.1～3、0.1～2、0.1～1、0.1～0.8、0.1～0.6、0.1～0.4、0.1～0.2、0.2～4.5、0.3～4.0、0.4～3.5、0.5～3.0、0.6～2.5、0.7～2.0、0.8～1.5或0.9～1.0质量％。
或者，本发明的组合物中的乳化剂的含有比例(质量％)，以质量标准计，优选为0.001～1、0.001～0.5、0.001～0.25、0.001～0.2、0.01～1、0.01～0.5、0.01～0.25、0.01～0.2、0.1～1、0.1～10、0.4～10、0.7～10、1～10、3～10、5～10、7～10、0.1～8、0.1～6、0.1～4、0.1～2、1～8、1～7、1～6、3～10、3～7、3～6或5～7％。
本发明的组合物中的GLP-1分泌促进成分的含有比例(质量％)优选为1～99.9、5～99.9、9～99.9、10～99.9、20～99.9、30～99.9、40～99.9、50～99.9、60～99.9、70～99.9、80～99.9、1～90、1～80、1～70、1～60、1～50、1～40、1～30、1～20、1～10、5～90、5～80、5～70、5～60、5～50、5～40、5～30、5～20或5～10质量％。
本发明的组合物中的GLP-1分泌促进成分的含有比例(质量％)优选为0.001～1.4、0.001～1.3、0.001～1.2、0.001～1.1、0.001～1.0、0.001～0.9、0.001～0.8、0.001～0.7、0.001～0.6、0.001～0.5、0.001～0.4、0.001～0.3、0.001～0.2、0.010～1.4、0.01～1.3、0.01～1.2、0.01～1.1、0.01～1.0、0.01～0.9、0.01～0.8、0.01～0.7、0.01～0.6、0.01～0.5、0.01～0.4、0.01～0.3或0.01～0.2质量％。
或者，以质量标准计，优选为1～500,000、1～400,000、1～300,000、1～200,000、1～100,000、1～80,000、1～60,000、1～40,000、1～20,000、1～10,000、1～8,000、1～6,000、1～4,000、1～2,000、1～1,000、1～500、50～500,000、100～500,000、500～500,000、1,000～500,000、1,500～500,000、3,000～500,000、4,500～500,000、6,000～500,000、7,500～500,000、9,000～500,000、10,000～500,000、50,000～500,000、100,000～500,000、200,000～500,000、300,000～500,000、400,000～500,000、50～400,000、100～300,000、500～200,000、1,000～100,000、1,500～80,000、3,000～60,000、4,500～40,000、6,000～20,000或7,500～10,000ppm。或者，优选为25～550、30～550、35～550、40～550、45～550、50～550、55～550、20～540、25～540、30～540、35～540、40～540、45～540、50～540、55～540、20～530、25～530、30～530、35～530、40～530、45～530、50～530、55～530、20～520、25～520、30～520、35～520、40～520、45～520、50～520、55～520、20～510、25～510、30～510、35～510、40～510、45～510、50～510、55～510、20～505、25～505、30～505、35～505、40～505、45～505、50～505、55～505、20～500、25～500、30～500、35～500、40～500、45～500、50～500、55～500、20～495、25～495、30～495、35～495、40～495、45～495、50～495、55～495、20～490、25～490、30～490、35～490、40～490、45～490、50～490或55～490ppm。或者，优选为1～1500、1～1200、5～1200、1～1000、5～1000、10～1000、1～900、5～900、10～900、15～900、20～900、25～900、30～900、35～900、40～900、45～900、50～900、55～900、1～800、5～800、10～800、15～800、20～800、25～800、30～800、35～800、40～800、45～800、50～800、55～800、1～700、5～700、10～700、15～700、20～700、25～700、30～700、35～700、40～700、45～700、50～700、55～700、1～600、5～600、10～600、15～600、20～600、25～600、30～600、35～600、40～600、45～600、50～600、55～600、1～550、1～540、1～530、1～520、1～510、1～505、1～500、1～495、1～490、5～550、5～540、5～530、5～520、5～510、5～505、5～500、5～495、5～490、10～550、10～540、10～530、10～520、10～510、10～505、10～500、10～495、10～490、15～550、15～540、15～530、15～520、15～510、15～505、15～500、15～495或15～490ppm。
或者，以质量标准计，优选为10～500,000、10～450,000、10～400,000、10～350,000、10～300,000、10～250,000、10～200,000、10～150,000、10～100,000、10～50,000、10～40,000、10～30,000、10～20,000、100～500000、100～450,000、100～400,000、100～350,000、100～300,000、100～250,000、100～200,000、100～150,000、100～100,000、100～50,000、100～40,000、100～30,000、100～20,000、1,000～500000、1,000～450,000、1,000～400,000、1,000～350,000、1,000～300,000、1,000～250,000、1,000～200,000、1,000～150,000、1,000～100,000、1,000～50,000、1,000～40,000、1,000～30,000或1,000～20,000ppm。
本发明的组合物的GLP-1分泌促进能力与GLP-1分泌促进成分单体相比有所增加。本发明的组合物的GLP-1分泌促进能力与GLP-1分泌促进成分单体相比是否有所增加，可通过以下方法来确认。即，制备对于本发明的组合物，除了作为有效成分仅调配GLP-1分泌促进成分以外皆相同的比较对象组合物。将本发明的组合物和比较对象组合物提供给GLP-1分泌细胞，并测定GLP-1分泌量。提供本发明的组合物时的GLP-1分泌量的一方比提供比较对象组合物多时，判断GLP-1分泌促进能力得到提高。GLP-1分泌促进能力与GLP-1分泌促进成分单体相比优选增加1.05倍以上，更优选增加1.1倍以上，特别优选增加1.2～100倍，最优选增加2～50倍。
本发明的组合物还可含有GLP-1分泌促进成分和乳化剂以外的其他成分。
其他成分可根据本发明的组合物的用途等适当决定，例如可列举甜味剂、赋形剂、结合剂、崩解剂、涂布剂、润滑剂、着色剂、矫味矫臭剂、稳定化剂、吸收促进剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、维生素类、微量金属成分等等。
其他甜味剂除GLP-1分泌促进成分以外，可为天然甜味剂、糖醇、人工甜味剂等。例如可列举阿斯巴甜、纽甜、阿力甜等肽类甜味剂；乙酰磺胺酸钾、糖精、爱德万甜、甜蜜素、甘素等合成甜味剂；莫奈林(Monellin)、仙茅甜蛋白、甜味蛋白(Brazzein)、索马甜等植物性的蛋白质类甜味剂；奇异果甜蛋白(Thaumatin)；新橙皮苷二氢查尔酮；赤藓糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、甘露糖醇等糖醇；等。
此外，作为其他成分，优选使用不具有GLP-1分泌促进能力的油脂等。所述油脂为可选择性存在于乳化粒子的核中的成分。作为油脂，优选由C6～C12的脂肪酸构成的MCT油。
可选择性存在于乳化粒子的核中的成分，优选相对于GLP-1分泌促进成分以0.1～500质量％的量含有。
此外进一步，作为其他成分，优选使用甘油等水性基剂。
水性基剂优选相对于GLP-1分泌促进成分以0.4～600质量％的量含有。
虽然下文会进行详述，但将本发明的组合物制成饮食品时，作为其他成分也可含有食品添加剂。作为食品添加剂，例如可列举赋形剂(例如，小麦淀粉、玉米淀粉、纤维素、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、α化淀粉、硅酸铝酸镁、硅酸钙等)、结合剂(例如，α化淀粉、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等)、崩解剂(例如，纤维素、羟丙基纤维素、玉米淀粉等)、流动化剂(例如，轻质无水硅酸等)、油脂(例如，大豆油、芝麻油、橄榄油、亚麻籽油、紫苏油、菜籽油、椰子油、玉米油等植物油或来自动物及鱼的油)、营养素(例如，各种矿物质、各种维生素)、香料、甜味剂、矫味剂、着色料、溶剂(例如，乙醇)、盐类、pH调节剂、缓冲剂、抗氧化剂、稳定化剂、凝胶化剂、增粘剂、润滑剂、胶囊化剂、悬浊剂、涂布剂、防腐剂等。食品添加剂可单独含有或可2种以上组合含有。
作为本发明的组合物的一个例子，作为GLP-1分泌促进成分可列举RebA，作为水中油型乳化剂可列举选自聚甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、酶处理卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯及有机酸单甘油酯中的至少1种，作为可选择性存在于乳化粒子的核中的成分可列举由C6～C12的脂肪酸构成的MCT油，作为水性基剂可列举甘油，及作为分散介质可列举水性介质，特别是含有水的物质。尤其，作为GLP-1分泌促进成分可列举RebA，作为水中油型乳化剂可列举聚甘油脂肪酸酯，作为可选择性存在于乳化粒子的核中的成分可列举由C6～C12的脂肪酸构成的MCT油，作为水性基剂可列举甘油，及作为分散介质可列举含有水的物质。
进一步，作为本发明的组合物的一个例子，可列举：作为GLP-1分泌促进成分含有RebA，作为水中油型乳化剂含有选自聚甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、酶处理卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯及有机酸单甘油酯中的至少1种，作为可选择性存在于乳化粒子的核中的成分含有由C6～C12的脂肪酸构成的MCT油，作为水性基剂含有甘油，及作为分散介质含有水性介质，尤其是水，且水中油型乳化剂的含有比例为GLP-1分泌促进成分的0.001～50质量％，可选择性存在于乳化粒子的核中的成分的含有比例为GLP-1分泌促进成分的0.1～500质量％，水性基剂的含有比例为GLP-1分泌促进成分的0.4～600质量％的组合物。尤其可列举：作为GLP-1分泌促进成分含有RebA，作为水中油型乳化剂含有聚甘油脂肪酸酯，作为可选择性存在于乳化粒子的核中的成分含有由C6～C12的脂肪酸构成的MCT油，作为水性基剂含有甘油，及作为分散介质含有水，且水中油型乳化剂的含有比例为GLP-1分泌促进成分的0.001～50质量％，可选择性存在于乳化粒子的核中的成分的含有比例为GLP-1分泌促进成分的0.1～500质量％，水性基剂的含有比例为GLP-1分泌促进成分的0.4～600质量％的组合物。
本发明的组合物可为任意形状，例如可为固体状(例如，粉末状)、凝胶状或液状。此外，也可分别准备含有GLP-1分泌促进成分的组合物和含有乳化粒子的组合物，将两组合物混合进行摄取、服用或投用，或者分别摄取、服用或投用两组合物。
本发明的组合物可适用于GLP-1分泌促进的用途。
例如，本发明的组合物可用于选自抑制血糖值上升用、抑制食欲用、抑制过度饮食用、改善糖代谢用、预防或治疗糖尿病用、预防或治疗肥胖症用、降低体重用及降低体脂肪率用中的至少1种的用途。可优选用于选自改善糖代谢用、抑制食欲用及预防或改善糖尿病或肥胖症用中的至少1种的用途。
此外，可用于促进胃内容物排出、抑制胃酸分泌、抑制肝糖释放、保护心肌、提高学习记忆能力、预防或治疗饭后高血糖(隐性糖尿病)、预防或治疗溃疡性大肠炎等目的。
此外，还可用于粉瘤性动脉硬化等血管性疾病、神经变性疾病、非酒精性肝炎、肝性褐黄斑、气喘的预防或治疗用(参考：Young-Sun Lee et al.,"Anti-InflammatoryEffects of GLP-1-Based Therapies beyond Glucose Control",Mediators ofInflammation Volume 2016,Article ID 3094642,11pages)。
本发明的组合物其自身可直接用于(摄取、服用或投用)人类或具有GLP-1分泌能力的非人类动物。
作为直接用于人类或非人类动物时的本发明的组合物的状态，可列举抑制血糖值上升用、抑制食欲用、抑制过度饮食用、改善糖代谢用、预防或治疗糖尿病用、预防或治疗肥胖症用、降低体重用、降低体脂肪率用、促进胃内容物排出用、抑制胃酸分泌用、抑制肝糖释放用、心肌保护用、提高学习记忆能力用、预防或治疗血管性疾病用、预防或治疗神经变性疾病用、预防或治疗非酒精性肝炎用、预防或治疗肝性褐黄斑用或预防或治疗气喘用的食品，例如面类(荞麦、乌冬、中华面、方便面等)、豆腐、糕点类(糖、口香糖、巧克力、零食、饼干、饼干(cookie)、软糖等)、面包类、水产或畜牧业加工食品(鱼糕、火腿、香肠等)、乳制品(发酵乳等)、油脂及油脂加工食品(色拉油、天妇罗油、人造黄油、蛋黄酱、起酥油、奶油、调味汁、低脂人造黄油等)、调味剂(酱料、酱汁等)、烹饪品或半烹饪品(琉球菜等)、杀菌袋装食品(咖喱、炖菜、盖饭、粥、菜粥等)、冰点(冰淇淋、雪葩、刨冰等)、粉末食品(粉末饮料、粉末汤料等)、经肠流食等。此外，上述用途的食品中，除了所谓的健康食品之外，还包含特定保健用食品、营养功能食品等保健功能食品、补充剂(营养补充食品)及饲料。
此外，还可列举抑制血糖值上升用、抑制食欲用、抑制过度饮食用、改善糖代谢用、预防或治疗糖尿病用、预防或治疗肥胖症用、降低体重用、降低体脂肪率用、促进胃内容物排出用、抑制胃酸分泌用、抑制肝糖释放用、心肌保护用、提高学习记忆能力用、预防或治疗血管性疾病用、预防或治疗神经变性疾病用、预防或治疗非酒精性肝炎用、预防或治疗肝性褐黄斑用或预防或治疗气喘用的饮料，例如茶饮料、清凉饮料、碳酸饮料(包括无酒精啤酒)、营养饮料、果实饮料、乳酸饮料、果汁、饮用剂、酒精饮料、加工乳、调制豆乳等。
将本发明的组合物制剂化来使用时，作为剂型，例如可列举片剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、干糖浆剂、包衣片剂、口腔内崩解片剂、咀嚼片剂、胶囊剂、软胶囊剂、糖浆剂、经肠营养剂等。
＜制造方法＞
本发明的组合物可通过对应其用途、组成等的已知的方法来制造。
优选经过以下工序来制造：搅拌乳化剂、水性介质和油脂形成乳化粒子，制备含有乳化粒子的混合物的工序，以及将所述含有乳化粒子的混合物和含有GLP-1分泌促进成分和水性介质的含有GLP-1分泌促进成分的混合物混合的工序。此时，搅拌优选使用高速搅拌机等的高速搅拌。此外，混合优选以GLP-1分泌促进成分不进入乳化粒子的核中的方式，通过用比形成乳化粒子的搅拌更温和的条件来实施。进一步，也可另外设置将GLP-1分泌促进成分和水性介质混合制备含有GLP-1分泌促进成分的混合物的工程。
对于高速搅拌而言，搅拌速度优选为5,000～10,000、5,000～8,000或8,000～10,000rpm。
从而，本发明的一个侧面涉及一种GLP-1分泌促进用组合物的制造方法，其特征在于，包含搅拌水中油型的乳化剂、水性介质和油脂形成乳化粒子，制备含有乳化粒子的混合物的工序，及将所述含有乳化粒子的混合物和含有GLP-1分泌促进成分和水性介质的含有GLP-1分泌促进成分的混合物混合的工程，以及通过所述方法而制造的GLP-1分泌促进用组合物。在由所述方法制造的GLP-1分泌促进用组合物中，存在乳化粒子不在核中含有GLP-1分泌促进成分的倾向。
＜应用＞
本发明的组合物可在含于饮料、食品、医药组合物等中的状态下，用于经口、经鼻、经肠等路径或基于经管的路径。
将本发明的组合物添加至饮食品中(或使其含有)来使用时，饮食品的种类并无特别限定。作为食品，例如可列举面类(荞麦、乌冬、中华面、方便面等)、豆腐、糕点类(糖、口香糖、巧克力、零食、饼干、饼干(cookie)、软糖等)、面包类、水产或畜牧业加工食品(鱼糕、火腿、香肠等)、乳制品(发酵乳等)、油脂及油脂加工食品(色拉油、天妇罗油、人造黄油、蛋黄酱、起酥油、奶油、调味汁、低脂人造黄油等)、调味剂(酱料、酱汁等)、烹饪品或半烹饪品(琉球菜等)、杀菌袋装食品(咖喱、炖菜、盖饭、粥、菜粥等)、冰点(冰淇淋、雪葩、刨冰等)、粉末食品(粉末饮料、粉末汤料等)、经肠流食等。此外，除了所谓的健康食品之外，还包含特定保健用食品、营养功能食品等保健功能食品、补充剂(营养补充食品)及饲料等。
作为饮料，例如可列举茶饮料、清凉饮料、碳酸饮料(包括无酒精啤酒)、营养饮料、果实饮料、乳酸饮料、果汁、饮用剂、酒精饮料、加工乳、调制豆乳等。
饮食品只要含有本发明的组合物，也可含有其他成分。作为这种情况的其他成分的例子，可列举与在＜组合物＞的项中所示的其他成分的例子相同的物质。
在本发明中，GLP-1分泌促进成分的摄取量(服用量、投用量)并无特别限定，可根据年龄、体重、健康状态等适当选择。
本发明适用或使用于治疗的用途(医疗用途)或非治疗用途均可。具体而言，不论是否分类为医药品、医药部外品、化妆品等，可作为明示或暗示地诉求促进GLP-1的分泌的功能或起因于GLP-1的分泌促进的功能的组合物或饮食品使用或适用。此外，使用本发明的制品，也可标示促进GLP-1的分泌的功能或起因于GLP-1的分泌促进的功能。作为这样的标示，并无特别限定，可列举GLP-1的分泌促进功能或起因于GLP-1的分泌促进的功能，例如，血糖值上升抑制功能、食欲抑制功能、过度饮食抑制功能、糖代谢的改善功能、糖尿病的预防或治疗功能、肥胖症的预防或治疗功能、体重的降低功能、体脂肪率的降低功能、胃内容排出促进功能、胃酸分泌抑制功能、肝糖释放抑制功能、心肌保护功能、学习记忆能力提高功能、血管性疾病的预防或治疗功能、神经变性疾病的预防或治疗功能、非酒精性肝炎的预防或治疗功能、肝性褐黄斑的预防或治疗功能、气喘的预防或治疗功能或者可视作与这些等同的标示等。
本发明的组合物的使用的时机并无特别限定，例如可为饭前、饭中、饭间、饭后、就寝前等。
本发明的一个侧面涉及一种组合物，其特征在于，含有GLP-1分泌促进成分和含有水中油型乳化剂的乳化粒子，且用于通过GLP-1分泌的促进而可改善的疾病的处置。此外，本发明的一个侧面涉及一种方法，其特征在于，包含将一种组合物投用至需要其的对象，且促进对象的GLP-1的分泌或治疗对象的通过GLP-1的分泌促进而可改善的疾病，其中所述组合物为含有GLP-1分泌促进成分和含有水中油型乳化剂的乳化粒子。此外，本发明的一个侧面进一步涉及一种应用，其特征在于，为将GLP-1分泌促进成分及含有水中油型乳化剂的乳化粒子用于治疗通过GLP-1分泌的促进而可改善的疾病的医药的制造的应用。另外，上述各侧面，具有本说明书记载的各种特征。
疾病包括高血糖症、过食症、胃酸过多症、糖尿病、肥胖症、血管性疾病、神经变性疾病、非酒精性肝炎、肝性褐黄斑、气喘等。
在本说明书中，用语“对象”是指具有GLP-1分泌能力的任意的生物个体，优选为动物，进一步优选为哺乳动物，进一步优选为人类个体。虽然对象可为健康的对象(例如，没有特定或任意的疾病)，也可为罹患某种疾病的对象，但是在企图获得可通过GLP-1的分泌促进而改善的疾病的处置等时，典型而言意味着罹患该疾病，或者具有罹患风险的对象。
在本说明书中，用语“处置”包括以疾病的治愈，一时的缓解或预防等为目的的医学上允许的所有种类的预防性及/或治疗性的介入。例如，“处置”包括以下各种目的的医学上允许的介入，各种目的包含：疾病的发展的延迟或停止、病变的消退或消失、该疾病发病的预防或复发的防止等。从而，本发明的组合物可用于疾病的治疗及/或预防。
此外，本发明的一个侧面涉及一种GLP-1分泌促进成分的GLP-1分泌促进能力的增强方法，其特征在于，包含将GLP-1分泌促进成分与包含水中油型乳化剂的乳化粒子组合使用。
实施例
以下通过实施例进一步具体地说明本发明。另外，实验例14欠缺。
＜实验例1＞
对RebA、RebB、RebM、RebN、RebD、RebC、MogV及甜菊苷是否具有GLP-1分泌促进效果进行研究。具体而言，通过以下步骤，测定GLP-1分泌量，并将与作为对照的无样本相比，分泌量多的物质判定为具有GLP-1分泌促进效果。
(各被检物质的制备)
使用PBS(Thermo Fisher Scientific)(Cat.No.14190250)溶解各被检物质(B，C，D，E，F，G，I，J)，获得储备液。储备液的浓度示于以下。
B(RebA)；5mM，C(RebB)；1M，D(RebM)；2.5mM，
E(RebN)；1M，F(RebD)；2.5mM，G(RebC)；2.5mM，
I(MogV)；1M，J(甜菊苷)；1M
(GLP-1的定量)
用RPMI1640(10％FBS(Thermo Fisher Scientific)(Cat.No.10439024)，1mMSodium Pyruvate)，于37℃、5％CO2的恒温箱中对H716(ATCC)(Cat.No.ATCC(注册商标)CCL-251)进行培养。
实施前培养2周，在细胞充分觉醒后，制作细胞的储备。
向96孔的板上以每孔2×105cells/90μL(high)播种细胞(N＝4)。此时将培养基中所含的FBS降低至0.5％，抑制细胞的增殖。
24小时后逐一添加10μL最高浓度的样本(即储备液)。
进一步，于24小时后实施GLP-1的定量。具体的步骤依照Perkin Elmer公司提供的Human GLP-1(7-36amide)Immunoassay kit(Cat.No.AL359)(Lot number 2361115)使用指南。另外，作为阴性对照(无样本)使用PBS。
结果示于图1。根据图1，与无样本相比GLP-1分泌量显著多的是RebA、RebB、RebC、MogV、甜菊苷。
＜实验例2＞
相对于RebC20mg添加21μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)后，用旋涡混合器进行搅拌，静置数小时获得RebC浓度1,000mM的储备液。用所得储备液和PBS制作10mM溶液。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对10mM溶液进行稀释，获得试样G-1mM～试样G-10mM。表1中记载RebC的浓度。
＜实验例3＞
相对于甜菊苷15mg添加12.4μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)后，用旋涡混合器进行搅拌，获得甜菊苷浓度150mM的储备液。用所得储备液和PBS制作15mM溶液。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对15mM溶液进行稀释，获得试样J-0.1mM～试样J-15mM。表1中记载甜菊苷的浓度。
＜实验例4＞
相对于RebA20mg添加8.27μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)后，加入74.5μL的PBS并用旋涡混合器进行搅拌，获得RebA浓度250mM的储备液。用所得储备液和PBS制作25mM溶液。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对25mM溶液进行稀释，获得试样B-1mM～试样B-25mM。表1中记载RebA的浓度。
＜实验例5＞
将甘油490g、RebA100g及聚甘油脂肪酸酯10g混合，于70℃下升温溶解制成水系混合溶液。作为油脂添加MCT油300g至该水系混合溶液，通过高速搅拌机(特殊机化工业制)以旋转数8000rpm进行乳化。搅拌结束后冷却至40℃，加入水100g获得RebA加工液。
相对于所得RebA加工液241.8μL添加10μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)及748.2μL的PBS，用旋涡混合器进行搅拌，获得RebA浓度25mM的储备液。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对储备液进行稀释，获得试样B加工-0.25mM～试样B加工-25mM。表1中记载RebA的浓度。
＜GLP-1分泌量的测定＞
在表1示出的条件下，将实验例2～5中所得试样添加至培养基，于所得培养基中培养细胞，测定2小时后的GLP-1分泌量。具体步骤如下所示。
用RPMI1640(Thermo Fisher Scientific制，型号：61870-036)(10％FBS(Hyclone制，型号：SH30396.03)，1mM Sodium Pyruvate)，于37℃、5％CO2的恒温箱中对H716(来自人类结肠的细胞)进行培养。
实施前培养2周，在细胞充分觉醒后，制作细胞的储备。
向96孔板上以每孔2×105cells/90μL播种细胞。此时将培养基中所含的FBS降低至0.5％，抑制细胞的增殖。
24小时后逐一添加10μL各试样(试样B为n＝3～4、试样B加工、试样G、试样J为n＝4)。培养基中的最终浓度示于表1的“样本F.C.(mM)”一栏。
从添加起经过规定时间(2小时)后，回收96孔板。
以300g×5分钟对回收的96孔板进行离心，回收上清液。
用Human GLP-1(7-36amide)Immunoassay kit(PerkinElmer公司制，型号：AL359C)对回收的上清液中的GLP-1进行定量，结果示于图2～5。图2～5中还记载作为无刺激性对照(阴性对照)的含有1％DMSO的溶液的GLP-1分泌量，和作为阳性对照的PMA(富士胶片和光纯药公司制，型号：162-23591)的水系溶液的GLP-1分泌量。PMA的水系溶液通过以下方法获得：相对于PMA1mg添加16.21μL的DMSO制备储备液，向该储备液中添加PBS制作1mM溶液，并用含有1％DMSO的PBS对其进行稀释。
以下示出表1。表1中的阳性对照也称作阳性Control。阴性对照也称作阴性Control。
[表1]
Figure BDA0003319206280000181
·关于试样B加工，将最终浓度0.025mM(#11)及0.05mM(#12)追加至试验预定浓度(0.1～2.5mM)。
·关于试样G，由于未能溶解至最终浓度达到1.5mM(#24)，因此以最终浓度1mM以下进行评价。
＜实验例6：表面张力的测定＞
为了调查GLP-1分泌促进效果和乳化剂的表面张力之间是否存在相关关系，以下述步骤实施实验。
制备分别调配RebA、RebD及RebM(市售品)的水溶液。RebA、RebD及RebM的调配量以蔗糖换算计统一为Brix10。即，设置为RebA 333ppm、RebD351ppm、RebM 351ppm。通过使用自动表面张力计(CBVP-Z型，协和界面科学株式会社制)的平板法对所得水溶液的表面张力进行测定。以水作为对照，同样地进行试验。结果示于图6。
＜实验例7：香味特性的评价＞
RebA的乳化组合物的香味特性通过以下步骤进行评价。
将RebA溶解至纯水，制作100ppm及300ppm的水溶液，作为对照。接着将实验例5中制作的RebA加工液添加至纯水，同样制作100ppm及300ppm的水溶液。由经良好训练的感官评审7人，以对照为3分，以0.5分的刻度实施添加RebA加工液的水溶液的香味评价，将平均值示于图中。另外，香味评价以甜味强度、甜味余味、苦味强度进行评价。
结果示于图7。
＜实验例8＞
相对于RebA20mg添加8.27μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)后，加入74.43μL的PBS并用旋涡混合器进行搅拌，获得RebA浓度250mM的储备液。用所得储备液和PBS制作50mM溶液。
用含有1％DMSO的PBS对50mM溶液进行稀释，获得试样B-1mM～试样B-25mM。表2中记载RebA的浓度。
＜实验例9＞
将甘油490g、RebA100g及聚甘油脂肪酸酯10g混合，于70℃下升温溶解制成水系混合溶液。作为油脂添加MCT油300g至该水系混合溶液，通过高速搅拌机(特殊机化工业制)以旋转数8000rpm进行乳化。搅拌结束后冷却至40℃，加入水100g获得RebA加工液。
相对于所得RebA加工液241.8μL，添加10μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)及748.2μL的PBS，通过旋涡混合器进行搅拌，获得RebA浓度25mM的储备液。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对储备液进行稀释，获得试样B加工-1mM～试样B加工-25mM。表2中记载RebA的浓度。
＜实验例10＞
除了未使用RebA100g，而使用甘油490g、聚甘油脂肪酸酯10g、MCT油300g及水200g以外，以与实验例9的RebA加工液的制备同样的方式，获得C溶液。
相对于所得C溶液483.5μL添加DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)10μL及PBS 506.5μL，通过旋涡混合器进行搅拌，获得RebA相当浓度50mM的储备液。
用含有1％DMSO的PBS对所得储备液进行稀释，获得试样C-1mM～试样C-25mM。表2中记载RebA相当浓度。RebA相当浓度是指，某试样C中的甘油、聚甘油脂肪酸酯及MCT油的浓度与实验例9的某试样B加工中的甘油、聚甘油脂肪酸酯及MCT油的浓度相同时，该试样B加工中的RebA的浓度。
＜实验例11＞
以与实验例8同样的方式，获得含有试样B+C的2倍的浓度的RebA的试样B。即，获得试样B-2mM、试样B-5mM、试样B-10mM、试样B-20mM、试样B-30mM、试样B-40mM、试样B-50mM。连字符后的浓度表示RebA的浓度。
以与实验例10同样的方式，获得含有试样B+C的2倍的浓度的聚甘油脂肪酸酯等的试样C。即，获得试样C-2mM、试样C-5mM、试样C-10mM、试样C-20mM、试样C-30mM、试样C-40mM、试样C-50mM。连字符后的浓度表示RebA相当浓度。
将等量的相同浓度的试样B和试样C(例如试样B-2mM和试样C-2mM)逐一混和，获得试样B+C-1mM～试样B+C-25mM。表2中记载RebA的浓度。
＜实验例12＞
相对于甘油118.5μL添加10μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)及871.5μL的PBS，用旋涡混合器进行搅拌，获得RebA相当浓度25mM的储备液。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对所得储备液进行稀释，获得试样D-1mM～试样D-25mM。表2中记载RebA相当浓度。所谓RebA相当浓度，是指某试样D中的甘油浓度与实验例9的某试样B加工中的甘油浓度相同时，该试样B加工中的RebA的浓度。
＜实验例13＞
相对于MCT油72.5μL添加10μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)及917.5μL的PBS，用旋涡混合器进行搅拌，获得RebA相当浓度25mM的储备液。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对所得储备液进行稀释，获得试样E-1mM～试样E-25mM。表2中记载RebA相当浓度。所谓RebA相当浓度，是指某试样E中的MCT油的浓度与实验例9的某试样B加工中的MCT油的浓度相同时，该试样B加工中的RebA的浓度。
＜GLP-1分泌量的测定＞
在表2示出的条件下，将上述实验例8～13中所得试样添加至培养基，于所得培养基中培养细胞，测定2小时后的GLP-1分泌量。具体步骤如下所示。
用RPMI1640(Thermo Fisher Scientific制，型号：61870-036)(10％FBS(Hyclone制，型号：SH30396.03)，1mM Sodium Pyruvate)，于37℃、5％CO2的恒温箱中对H716(来自人类结肠的细胞)进行培养。
实施前培养2周，在细胞充分觉醒后，制作细胞的储备。
向96孔板上以每孔2×105cells/90μL播种细胞。此时将培养基中所含的FBS(Hyclone公司制，型号：SH30396.03)降低至0.5％，抑制细胞的增殖。
24小时后逐一添加10μL各试样(n＝3～4)。培养基中的最终浓度示于表2的“样本F.C.(mM)”一栏。
从添加起经过规定时间(2小时)后，回收96孔板。
以300g×5分钟对回收的96孔板进行离心，回收上清液。
用PerkinElmer公司制Human GLP-1(7-36amide)Immunoassay kit对回收的上清液中的GLP-1进行定量。此时，校正曲线的标准范围为30～100,000pg/mL，由于大于100,000pg/mL的值中出现错误的数值，因此将认为100,000pg/mL以上的值计算为100,000pg/mL。
通过Smirnov-Grubbs检验去除偏离值(p＜0.01)。
结果示于图8。图8中还记载作为无刺激性对照的含有1％DMSO的溶液的GLP-1分泌量，和作为阳性对照的PMA(富士胶片和光纯药公司制，型号：162-23591)的水系溶液的GLP-1分泌量。PMA的水系溶液通过以下方法获得：相对于PMA1mg添加16.21μL的DMSO制备储备液，向该储备液中添加PBS制作1mM溶液，并用含有1％DMSO的PBS对其进行稀释。
接着，为了确认，在其他平板上也实施了GLP-1分泌量的测定。具体而言，使用与图8相同的培养上清液，试样B～D在1枚化验板上，试样E在另1枚的化验板上实施GLP-1量的测定。在同一枚化验板上对2小时后的培养上清液进行测定的结果示于图9～14。所使用的各试样的浓度如图9～14中记载。另外，图11、13、14记载的C、D、E的浓度为RebA相当浓度。
校正曲线的范围为30～100,000pg/mL，而此次大于100,000pg/mL的值中未出现错误的数值，因此对于大于100,000pg/mL的值作为理论值计算。
以下示出表2。表2中的阳性对照也称作阳性Control。阴性对照也称作阴性Control。
[表2]
Figure BDA0003319206280000231
＜实验例15＞
相对于RebA36.3mg添加9.4μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)后，加入929.0μL的PBS并通过旋涡混合器进行搅拌，获得RebA浓度40mM的储备液。
用含有1％DMSO的PBS对所得储备液和PBS进行稀释，获得试样B-0.31mM～试样B-20mM。表3中记载RebA的浓度。
＜实验例16＞
将甘油490g、RebA100g及聚甘油脂肪酸酯10g混合，于70℃下升温溶解制成水系混合溶液。作为油脂将MCT油300g添加至该水系混合溶液，通过高速搅拌机(特殊机化工业制)以旋转数8000rpm进行乳化。搅拌结束后冷却至40℃，加入水100g获得RebA加工液。
相对于所得RebA加工液193.4μL添加10μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)及796.6μL的PBS，通过旋涡混合器进行搅拌，获得RebA浓度20mM的储备液。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对储备液进行稀释，获得试样B加工-0.31mM～试样B加工-20mM。表3中记载RebA的浓度。
＜实验例17＞
除了未使用RebA100g，而使用甘油490g、聚甘油脂肪酸酯10g、MCT油300g及水200g以外，以与实验例16的RebA加工液的制备同样的方式，获得C溶液。
相对于C溶液386.8μL添加10μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)及603.2μL的PBS，通过旋涡混合器进行搅拌，获得RebA相当浓度40mM的储备液。
用含有1％DMSO的PBS对储备液进行稀释，获得试样C-0.31mM～试样C-20mM。表3中记载RebA相当浓度。所谓RebA相当浓度，是指某试样C中的聚甘油脂肪酸酯的浓度与实验例16的某试样B加工中的聚甘油脂肪酸酯的浓度相同时，该试样B加工中的RebA的浓度。
＜实验例18＞
以与实验例15同样的方式，获得含有试样B+C的2倍的浓度的RebA的试样B。即，获得试样B-0.62mM、试样B-2.5mM、试样B-10mM、试样B-40mM。连字符后的浓度表示RebA的浓度。
以与实验例17同样的方式，获得含有试样B+C的2倍的浓度的聚甘油脂肪酸酯的试样C。即，获得试样C-0.62mM、试样C-2.5mM、试样C-10mM、试样C-40mM。连字符后的浓度表示RebA相当浓度。
将等量相同浓度的试样B和试样C(例如试样B-0.62mM和试样C-0.62mM)逐一混和，获得试样B+C-0.31mM～试样B+C-20mM。表3中记载RebA的浓度。
＜实验例19＞
相对于甘油94.8μL添加10μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)及895.2μL的PBS，通过旋涡混合器进行搅拌，获得RebA相当浓度20mM的储备液。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对所得储备液进行稀释，获得试样D-0.31mM～试样D-20mM。表3记载RebA相当浓度。所谓RebA相当浓度，是指某试样D中的甘油的浓度与实验例16的某试样B加工中的甘油的浓度相同时，该试样B加工中的RebA的浓度。
＜实验例20＞
相对于MCT油58.0μL添加10μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)及932.0μL的PBS，通过旋涡混合器进行搅拌，获得RebA相当浓度20mM的储备液。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对所得储备液进行稀释，获得试样E-0.31mM～试样E-20mM。表3记载RebA相当浓度。所谓RebA相当浓度，是指某试样E中的MCT油的浓度与实验例16的某试样B加工中的MCT油的浓度相同时，该试样B加工中的RebA的浓度。
＜细胞毒性＞
在表3所示条件下，将上述实验例15～20中所得试样添加至培养基，在所得培养基中培养细胞，测定2小时后和24小时后的细胞毒性。具体步骤如下所示。
用RPMI1640(Thermo Fisher Scientific公司制，型号：61870-036)(10％FBS(Gibco制，型号：SH102770)，1mM Sodium Pyruvate)在37℃、5％CO2下于恒温箱内对H716细胞进行培养。以2×105cells/90μL/well将H716细胞播种至96孔板(死细胞评价用)，以及以4×105cells/180μL/well将H716细胞播种至48孔板(形态观察用)。向板上播种时培养基中的FBS为0.5％。细胞播种24小时后，以10μL/well(96孔板)或20μL/well(48孔板)的量添加各浓度的试样。培养基中的最终浓度示于表3的“样本F.C.”一栏。于试样添加2小时后对各试样的最高浓度(表3记载的#1、#6、#10、#14、#18、#22、#26、#30)进行评价。
(以死细胞为指标的评价)
试样添加2小时后及24小时后以100×g对细胞进行5分钟离心，去除上清液。逐一添加50μL/well的Propidium iodide溶液(0.66μg/mL，用PBS进行1：1500的稀释)，于室温下静置15分钟，进行死细胞的染色。用滴管吸取将细胞悬浊后，在显微镜下拍摄相位差图像及荧光图像。通过ImageJ以相位差图像为基础测定细胞总数，以荧光图像为基础测定死细胞数。使用测定的细胞数计算死细胞率。
死细胞率(％)＝死细胞数/细胞总数×100
就各试样添加时的死细胞率而言，将细胞播种24小时后的未添加时的死细胞率作为0％，添加70％乙醇并于冰上静置30分钟以上时的死细胞率为100％进行校正。结果示于图15。图15a示出2小时后的结果，图15b示出24小时后的结果。
由示出2小时后的结果的图15a可知在所有试样中未能诱导细胞死亡。
此外由示出24小时后的结果的图15b可理解，添加试样B+C(RebA浓度2mM)时的死细胞率最高，与PMA的最低浓度的死细胞率相同。关于试样B+C以外，死细胞率与阴性对照(-)(也称作阴性Control。)相同或比阴性对照低。因此，试样B+C中诱导细胞死亡的可能性低，在其他试样中未能诱导细胞死亡。
(以细胞形态为指标的评价)
试样添加2小时后及24小时后，在显微镜下对细胞进行摄影，确认有无形态变化。由于试样B加工、C及B+C呈白浊状，添加0.5mM及2mM时在显微镜下难以判定，而关于其他试样，即使添加至H716细胞，也未观察到细胞的收缩或破裂等形态变化。
以下示出表3。表3中的阳性对照也称作阳性Control。阴性对照也称作阴性Control。
[表3]
Figure BDA0003319206280000271
＜实验例21＞
相对于RebA134.3mg添加34.7μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)后，加入3438μL的PBS并通过旋涡混合器进行搅拌，获得RebA浓度40mM的储备液。
用含有1％DMSO的PBS对所得储备液进行稀释，获得试样B-1mM～试样B-20mM。表4中记载RebA的浓度。
＜实验例22＞
除了将RebA100g代替为水100g，以及作为乳化剂代替聚甘油脂肪酸酯10g使用蔗糖脂肪酸酯10g以外，与实验例16的RebA加工液的制备同样地获得C-1溶液。具体而言，将甘油490g、蔗糖脂肪酸酯10g(三菱化学食品制HLB＝16)混合，于70℃下升温溶解制成水系混合溶液。作为油脂添加MCT油300g至该水系混合溶液，通过高速搅拌机(特殊机化工业制)以旋转数8000rpm进行乳化。搅拌结束后冷却至40℃，加入水200g获得C-1溶液。
相对于所得C-1溶液580.2μL添加15μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)及904.8μL的PBS，通过旋涡混合器进行搅拌，获得RebA相当浓度40mM的储备液。
使用含有1％DMSO的PBS对所得储备液进行稀释，获得试样C-1-1mM～试样C-1-20mM。表4中记载RebA相当浓度。RebA相当浓度，是指某试样C-1中的甘油及乳化剂的浓度与实验例25的某试样B+C-1中的甘油及乳化剂的浓度相同时，该试样B+C-1中的RebA的浓度。
＜实验例23＞
除了代替蔗糖脂肪酸酯(三菱化学食品制HLB＝16)10g使用酶分解卵磷脂(太阳化学制HLB＝12.0)10g以外，以与实验例22同样的方式，获得试样C-2-1mM～试样C-2-20mM。表4中记载RebA相当浓度。RebA相当浓度，是指某试样C-2中的甘油及乳化剂的浓度与实验例26的某试样B+C-2中的甘油及乳化剂的浓度相同时，该试样B+C-2中的RebA的浓度。
＜实验例24＞
除了代替蔗糖脂肪酸酯(三菱化学食品制HLB＝16)10g使用有机酸单甘油酯(太阳化学制HLB＝9.0)10g以外，以与实验例22同样的方式，获得试样C-3-1mM～试样C-3-20mM。表4中记载RebA相当浓度。RebA相当浓度，是指某试样C-3中的甘油及乳化剂的浓度与实验例27的某试样B+C-3中的甘油及乳化剂的浓度相同时，该试样B+C-3中的RebA的浓度。
＜实验例25＞
以与实验例21同样的方式，获得含有试样B+C-1的2倍的浓度的RebA的试样B。即，获得试样B-2mM、试样B-5mM、试样B-10mM、试样B-20mM、试样B-30mM、试样B-40mM。连字符后的浓度表示RebA的浓度。
以与实验例22同样的方式，获得含有试样B+C-1的2倍的浓度的蔗糖脂肪酸酯的C-1试样。即，获得试样C-1-2mM、试样C-1-5mM、试样C-1-10mM、试样C-1-20mM、试样C-1-30mM、试样C-1-40mM。连字符后的浓度表示RebA相当浓度。
将等量的相同浓度的试样B和试样C(例如试样B-1-2mM和试样C-1-2mM)逐一混和，获得试样B+C-1-1mM～试样B+C-1-20mM。表4中记载RebA的浓度。
＜实验例26＞
除了代替蔗糖脂肪酸酯(三菱化学食品制HLB＝16)10g使用酶分解卵磷脂(太阳化学制HLB＝12.0)10g以外，以与实验例25同样的方式，获得试样B+C-2-1mM～试样B+C-2-20mM。表4中记载RebA的浓度。
＜实验例27＞
除了代替蔗糖脂肪酸酯(三菱化学食品制HLB＝16)10g使用有机酸单甘油酯(太阳化学制HLB＝9.0)10g以外，以与实验例25同样的方式，获得试样B+C-3-1mM～试样B+C-3-20mM。表4中记载RebA的浓度。
＜实验例28＞
相对于蔗糖脂肪酸酯13.1mg添加339μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)，并用旋涡混合器进行混合，进一步用DMSO进行20倍稀释，获得RebA相当浓度2,000mM的储备液。向所得储备液中调配PBS，获得20mM溶液。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对所得20mM溶液进行稀释，获得试样G-1-1mM～试样G-1-20mM。表4中记载RebA相当浓度。RebA相当浓度，是指某试样G-1中的蔗糖脂肪酸酯的浓度与实验例25的某试样B+C-1中的蔗糖脂肪酸酯的浓度相同时，该试样B+C-1中的RebA的浓度。
＜实验例29＞
相对于酶分解卵磷脂20.9mg添加540μL的PBS，并用旋涡混合器混合，进一步用DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)进行20倍稀释，获得RebA相当浓度2,000mM的储备液。向储备液中调配PBS和DMSO，制作20mM溶液(1％DMSO)。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对所得20mM溶液进行稀释，获得试样G-2-1mM～试样G-2-20mM。表4中记载RebA相当浓度。RebA相当浓度是指某试样G-2中的酶分解卵磷脂的浓度与实验例26中的某试样B+C-2中的酶分解卵磷脂的浓度相同时，该试样B+C-2中的RebA的浓度。
＜实验例30＞
将有机酸单甘油酯于60℃下进行溶解，相对于35.0mg添加905μL的DMSO，并用旋涡混合器混合，进一步用DMSO进行20倍稀释，获得RebA相当浓度2,000mM的储备液。向储备液中调配PBS获得20mM溶液。
根据需要用含有1％DMSO的PBS对所得20mM溶液进行稀释，获得试样G-3-1mM～试样G-3-20mM。表4中记载RebA相当浓度。RebA相当浓度，是指某试样G-3中的有机酸单甘油酯的浓度与实验例27的某试样B+C-3中的有机酸单甘油酯的浓度相同时，该试样B+C-3中的RebA的浓度。
＜实验例31＞
于60℃下溶解聚甘油脂肪酸酯，相对于50μL添加259μL的DMSO(富士胶片和光纯药公司制，型号：037-24053)后，加入984μL的PBS并用旋涡混合器进行混合，获得RebA相当浓度400mM的储备液。
用所得储备液和PBS制备20mM溶液。根据需要用含有1％DMSO的PBS对所得20mM溶液进行稀释，获得试样G-4-1mM～试样G-4-20mM。表4中记载RebA相当浓度。RebA相当浓度，是指某试样G-4中的聚甘油脂肪酸酯的浓度与实验例25～27的某试样B+C中的乳化剂的浓度相同时，该试样B+C中的RebA的浓度。
＜GLP-1分泌量＞
测定将上述实验例21～31中所得试样提供给细胞2小时后和24小时后的GLP-1分泌量。具体步骤如下所示。
用RPMI1640(Thermo Fisher Scientific公司制，型号：61870-036)(10％FBS(Gibco制，型号：SH102770)，1mM Sodium Pyruvate)在37℃、5％CO2下于恒温箱内对H716细胞进行培养。以2×105cells/90μL/well将H716细胞播种至96孔板。向板上播种时培养基中的FBS为0.5％。
细胞播种24小时后，如表4所示，将实验例21～31中所得试样以10μL/well的量添加至培养基。培养基中的最终浓度示于表4的“样本F.C.”一栏。
自试样的添加起2小时后及24小时后，以300×g对96孔板进行5分钟离心，回收培养上清液。
使用Human GLP-1(7-36amide)Immunoassay kit(PerkinElmer公司制，型号：AL359C)，对回收的培养上清液中的GLP-1进行定量。关于定量值，超过校正曲线的范围成为错误的值除外。此外，使用统计分析软件R制作Box plot，比第一四分位小或比第三四分位大的值在1.5四分位范围以上时作为偏离值除外。
结果示于图16。图16中还记载作为无刺激性对照的含有1％DMSO的溶液的GLP-1分泌量，和作为阳性对照的PMA(富士胶片和光纯药公司制，162-23591)的水系溶液的GLP-1分泌量。PMA的水系溶液通过以下步骤获得：向PMA1mg中添加16.21μL的DMSO制备储备液，向储备液中添加PBS制作1mM溶液，并用含有1％DMSO的PBS对其进行稀释。
以下示出表4。表4中的阳性对照也称作阳性Control。阴性对照也称作阴性Control。
[表4]
Figure BDA0003319206280000321
※关于#10～69以B加工浓度来记载
<实验例32>
测定甜菊苷、RebA、RebD、RebM的分配比率。为了参考，以下示出甜菊苷、RebA、RebD、RebM的结构式。
[化学式1]
Figure BDA0003319206280000331
Figure BDA0003319206280000332
具体而言，实施以下操作。
将约100mL的纯水和甲苯分别加入分液漏斗中后，添加各甜菊醇糖苷30mg。密封以使其不漏液，通过振荡机振荡搅拌约30分钟后静置分液漏斗。就分配比率而言，液层分离成2层时，从各层中实施采样，用LCMS实施测定。
测定结果和试验中的照片示于图17。试验后的含有RebA的液体的照片示于图18。
<实验例33>
1.样本制备
通过以下步骤准备样本SA-70A、SA-70B、SA-200A、SA-200B、SA-206A、SA-206B、SA-207A、SA-207B。另外，末尾为A的样本为使RebA溶解于水系中制备的样本。末尾为B的样本为使RebA分散于油系中制备的样本。
(SA-70A)将甘油487g、RebA103g及聚甘油脂肪酸酯10g(太阳化学株式会社制，HLB＝16.7)混合，于70℃下升温溶解获得水系混合溶液。作为油脂添加MCT300g至该水系混合溶液，通过高速搅拌机(特殊机化工业株式会社制)以旋转数8000rpm进行乳化。搅拌结束后冷却至40℃，加入水100g获得乳化组合物SA-70A。
(SA-70B)
将甘油487g及聚甘油脂肪酸酯10g(太阳化学株式会社制，HLB＝16.7)混合，于70℃下升温溶解获得水系混合溶液。此外，将MCT300g及RebA103g于室温下混合获得油系混合溶液。将油系混合溶液添加至水系混合溶液中，通过高速搅拌机(特殊机化工业株式会社制)以旋转数8000rpm进行乳化。搅拌结束后冷却至40℃，加入水100g获得乳化组合物SA-70B。
(SA-200A)
将甘油567g、RebA103g及聚甘油脂肪酸酯30g(太阳化学株式会社制，HLB＝16.7)混合，于70℃下升温溶解制成水系混合溶液。作为油脂添加MCT200g至该水系混合溶液，通过高速搅拌机(特殊机化工业株式会社制)以旋转数8000rpm进行乳化。搅拌结束后冷却至40℃，加入水100g获得乳化组合物SA-200A。
(SA-200B)
将甘油567g及聚甘油脂肪酸酯30g(太阳化学株式会社制，HLB＝16.7)混合，于70℃下升温溶解制成水系混合溶液。此外，将MCT200g及RebA103g于室温下混合获得油系混合溶液。将油系混合溶液添加至水系混合溶液中，通过高速搅拌机(特殊机化工业株式会社制)以旋转数8000rpm进行乳化。搅拌结束后冷却至40℃，加入水100g获得乳化组合物SA-200B。
(SA-206A)
将甘油537g、RebA103g及聚甘油脂肪酸酯60g(太阳化学株式会社制，HLB＝16.7)混合，于70℃下升温溶解制成水系混合溶液。作为油脂添加MCT200g至该水系混合溶液，通过高速搅拌机(特殊机化工业株式会社制)以旋转数8000rpm进行乳化。搅拌结束后冷却至40℃，加入水100g获得预备乳化组合物后，进一步通过湿式微粒化装置以压力150MPa施加微细乳化获得乳化组合物SA-206A。
(SA-206B)
将甘油578g及聚甘油脂肪酸酯55g(太阳化学株式会社制，HLB＝16.7)混合，于70℃下升温溶解制成水系混合溶液。此外，将MCT182g及RebA94g于室温下混合获得油系混合溶液。将油系混合溶液添加至水系混合溶液中，通过高速搅拌机(特殊机化工业株式会社制)以旋转数8000rpm进行乳化。搅拌结束后冷却至40℃，加入水91g获得预备乳化组合物后，进一步通过湿式微粒化装置以压力150MPa施加微细乳化获得乳化组合物SA-206B。
(SA-207A)
将甘油706g、RebA34g及聚甘油脂肪酸酯60g(太阳化学株式会社制，HLB＝16.7)混合，于70℃下升温溶解制成水系混合溶液。作为油脂添加MCT100g至该水系混合溶液，通过高速搅拌机(特殊机化工业株式会社制)以旋转数8000rpm进行乳化。搅拌结束后冷却至40℃，加入水100g获得预备乳化组合物后，进一步通过湿式微粒化装置以压力150MPa施加微细乳化获得乳化组合物SA-207A。
(SA-207B)
将甘油706g及聚甘油脂肪酸酯60g(太阳化学株式会社制，HLB＝16.7)混合，于70℃下升温溶解制成水系混合溶液。此外，将MCT100g及RebA34g于室温下混合获得油系混合溶液。将油系混合溶液添加至水系混合溶液中，通过高速搅拌机(特殊机化工业株式会社制)以旋转数8000rpm进行乳化。搅拌结束后冷却至40℃，加入水100g获得预备乳化组合物后，进一步通过湿式微粒化装置以压力150MPa施加微细乳化获得乳化组合物SA-207B。
2.乳化稳定性的评价
使用上述1.中制备的样本，实施稳定性的评价。具体步骤如下所示。
2.1制备后即刻的乳化粒径的测定
测定制备后即刻的各样本中的乳化粒子的平均粒径。具体而言，对于制备后即刻的各样本，以激光散射强度达到1％左右的方式用离子交换水进行适当稀释，然后用激光衍射散射式粒度分布测定仪(Spectris株式会社Malvern Panalytical事业部)进行测定。
2.2冷蔵保管后的乳化粒径的测定
将各样本在冷藏库(4℃)内静置2个月。然后，与2.1同样测定乳化粒径。
结果示于下表。
[表5]
Figure BDA0003319206280000361
3.香味特性的评价
使用上述1.中制备的样本，评价香味特性。具体而言，通过以下步骤进行评价。
将RebA溶解至纯水，制作RebA浓度为467ppm的水溶液，作为对照。接着，向1.中制备的各样本中添加纯水，制作RebA浓度为467ppm的水溶液。通过经良好训练的感官评审7人，将对照作为3分，以0.5分为刻度实施各水溶液的香味评价，计算平均值后进行排名。香味评价以甜味强度、甜味余味及苦味强度进行评价。分数相同的样本为相同名次。名次示于下表的各评价项目一栏。下表的合计一栏示出名次的和。
[表6]
Figure BDA0003319206280000362
4.保管后的各种特性的评价
使用1.中制备的样本，评价保管后的乳化稳定性、香味特性、振动稳定性。具体而言，通过以下步骤进行评价。
向16990.3mg的样本SA-70A中添加纯水3,483ml，获得评价用液70A。除了代替样本SA-70A使用样本SA-206A以外，以同样的方式，获得评价用液206A。各评价用液的组成如下所示。
[表7]
70A 206A
样本量(mg) 16,990.3 16,990.3
样本中的RebA率(％) 10.3 10.3
RebA换算(mg) 1,750.0 1,750.0
纯水添加量(ml) 3,483.0 3,483.0
总量(ml) 3,500 3,500
RebA浓度(ppm) 500.0 500.0
将所得评价用液70A和评价用液206A在库内温度5℃的冷藏库中静置4周。此外，将另外的评价用液70A和评价用液206A在55℃的恒温保管库中静置4周。
此外，使用无水柠檬酸，将评价用液70A和评价用液206A的pH调节至2.5，在库内温度5℃的冷藏库中静置4周。使用无水柠檬酸，将其他评价用液70A和评价用液206A的pH调节至2.5，在55℃的恒温保管库中静置4周。
4-1.保管后的乳化稳定性
观察静置4周后的评价用液的液面的外观。结果示于下表。
[表8]
Figure BDA0003319206280000371
4-2.保管温度对香味特性的影响
此外，确认静置温度对香味的影响。具体而言，通过以下步骤进行确认。
将无pH调节、静置温度5℃的评价用液70A作为对照。将对照的评价定为5分时，以0.5分刻度评价无pH调节、静置温度55℃的评价用液70A的香味。评审为经良好训练的感官评审4人。计算各评审的评价的平均值。
以同样的方式，将无pH调节、静置温度5℃的评价用液206A作为对照，以0.5分为刻度评价无pH调节、静置温度55℃的评价用液206A的香味。
以同样的方式，将pH2.5、静置温度5℃的评价用液70A作为对照，以0.5分为刻度评价pH2.5、静置温度55℃的评价用液70A的香味。
以同样的方式，将pH2.5、静置温度5℃的评价用液206A作为对照，以0.5分为刻度评价pH2.5、静置温度55℃的评价用液206A的香味。
结果示于图19。此外，评审的评语于以下进行记载。
70A、无pH调节；
苦味的棱角被去除而圆润、奶味、略清澈。变得圆润而苦味降低。奶味增加。变得容易饮用。清爽感略少，但临界未变差。
206A、无pH调节；
苦味的棱角被去除而圆润、奶味、略清澈。变得圆润而苦味降低。奶味增加。甜度未改变。无变化。清爽感略少，但临界未变差。
70A、pH2.5；
酸味得到抑制。酸味增加。有刺激。变成圆润的酸味。良好。变得稍微圆润，酸味的刺激降低。
206A、pH2.5；
酸味得到抑制。酸味增加。但是变得容易饮用。无变化。苦味稍微有所降低。良好。变得稍微圆润，酸味的刺激降低。
4-3.振动加速试验
针对5℃下静置4周后的评价用液，通过分光光度计(岛津公司制UV1800 UVspectrophotometer)测定波长680nm处的吸光度。
接着以3000rpm对评价用液进行30分钟离心。针对离心后的评价用液，测定波长680nm处的吸光度。计算离心前后的吸光度的差Δabs，Δabs为0.02以下的物质，视为振动时的乳化稳定性优异，评价为“良好”。
结果示于图20。
5.甜味强度的降低程度
使用上述1.中制备的样本SA-70A及SA-206A，评价因乳化而降低的甜味强度的程度。具体而言，通过以下步骤进行评价。
将RebA溶解于纯水制作467ppm的水溶液，作为对照。接着，将1.中制备的各样本添加至纯水，制作RebA浓度为467ppm的水溶液。使经良好训练的感官评审4人选择各水溶液与蔗糖水溶液的Brix2，5，8，11，14中的哪个甜味强度接近。计算各评审的评价结果的平均值。结果示于图21。
＜实验例34＞
以与实验例33的“4.保管后的各种特性的评价”同样的方式，获得评价用液70A及评价用液206A。
用含有DMSO的PBS对所得评价用液70A和评价用液206A进行稀释，制备下表的添加浓度一栏所示的RebA浓度的稀释液。
此外，将另外的评价用液70A和评价用液206A在55℃的恒温保管库中静置4周。用含有DMSO的PBS对静置后的评价用液70A和评价用液206A进行稀释，制备下表的添加浓度一栏所示的RebA浓度的稀释液。
另外，作为无刺激性对照(阴性对照)制备含有1％DMSO的溶液。此外，作为阳性对照，制备以达到下表的添加浓度一栏所示浓度的方式用1％DMSO对PMA(富士胶片和光纯药公司制，型号：162-23591)进行稀释而得的物质。
[表9]
各被测物质的添加量和最终浓度
Figure BDA0003319206280000401
在上表所示条件下，将稀释液No.1～27添加至培养基，以所得培养基培养细胞。具体步骤如下所示。
用RPMI1640(Thermo Fisher Scientific公司制，型号：61870-036)(10％FBS(Gibco制，型号：SH102770)，1mM Sodium Pyruvate)在37℃、5％CO2下于恒温箱内对H716细胞进行培养。以2×105cells/90μL/well将H716细胞播种至96孔板。向板上播种时培养基中的FBS为0.5％。从细胞播种起经过24小时后，以10μL/well的量将稀释液No.1～27加入孔中。稀释液添加后的培养基中的RebA最终浓度(No.2，3的情况为PMA浓度)示于上表的“最终浓度(mM)”一栏。
确认自添加稀释液起2小时后和24小时后的细胞生存率。任何样本均无问题。
自添加稀释液起2小时后及24小时后，以300×g对96孔板进行5分钟离心，回收培养上清液。
使用Human GLP-1(7-36amide)Immunoassay kit(PerkinElmer公司制，型号：AL359C)，对回收的培养上清液中的GLP-1进行定量。关于定量值，超过校正曲线的范围成为错误的值除外。此外，使用统计分析软件R制作Box plot，比第一四分位小或比第三四分位大的值在1.5四分位范围以上时作为偏离值除外。
结果示于图22。

Claims (18)

1.一种GLP-1分泌促进用组合物，其特征在于，含有乳化粒子，该乳化粒子含有GLP-1分泌促进成分和水中油型乳化剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述水中油型乳化剂的HLB值为7～18。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述水中油型乳化剂包含选自聚甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、酶处理卵磷脂、蔗糖脂肪酸酯及有机酸单甘油酯中的至少1种的乳化剂。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的组合物，其特征在于，所述水中油型乳化剂的亲水基包含磷酸基。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述GLP-1分泌促进成分包含糖苷甜味剂。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述糖苷甜味剂包含选自瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷B、瑞鲍迪苷C、罗汉果皂苷V及甜菊苷中的至少1种。
7.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述GLP-1分泌促进成分包含选自单糖、双糖、蔗糖衍生物、氨基酸、肽、蛋白质、糖蛋白质、脂质及脂肪酸中的至少1种。
8.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述GLP-1分泌促进成分包含乳蛋白质、卵黄蛋白质、卵白蛋白质、大豆蛋白质、小麦蛋白质、豌豆蛋白质、黏蛋白、蛋白多糖或它们的加工品。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳化粒子不在核中含有GLP-1分泌促进成分。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的组合物，其特征在于，所述GLP-1分泌促进成分通过平板法测定的表面张力为40～70mN/m。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的组合物，其特征在于，所述水中油型乳化剂相对于所述GLP-1分泌促进成分的比例为0.001～50质量％。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的组合物，其特征在于，以0.1～5质量％的比例含有所述水中油型乳化剂。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的组合物，其特征在于，以1～99.9质量％的比例含有所述GLP-1分泌促进成分。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的组合物，其特征在于，用于改善糖代谢、用于抑制食欲或用于预防或改善糖尿病或肥胖症。
15.一种GLP-1分泌促进用饮料，其特征在于，含有权利要求1～14中任一项所述的组合物。
16.一种GLP-1分泌促进用食品，其特征在于，含有权利要求1～14中任一项所述的组合物。
17.一种医药组合物，其特征在于，含有权利要求1～14中任一项所述的组合物。
18.一种GLP-1分泌促进用组合物的制造方法，其特征在于，包含将水中油型乳化剂、水性介质和油脂搅拌形成乳化粒子，制备含有乳化粒子的混合物的工序，及将所述含有乳化粒子的混合物和含有GLP-1分泌促进成分和水性介质的含有GLP-1分泌促进成分的混合物混合的工序。
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