CN113735951B - Cle肽抗蒸腾剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CLE肽抗蒸腾剂，包括十二肽PvCLE16p，十二肽PvCLE16p的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。较佳地，十二肽PvCLE16p的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。十二肽PvCLE16p的浓度为10μM。还包括农药学上可接受的载体。还提供了上述的CLE肽抗蒸腾剂的开发方法、应用和施用方法。本发明的CLE肽抗蒸腾剂环境友好，能够降低植物蒸腾，提高植株的耐旱能力及干旱下水分利用效率，适于大规模推广应用。

Description

CLE肽抗蒸腾剂的应用
技术领域
本发明涉及植物生物技术及生物信息学技术领域，更具体地，涉及抗旱技术领域，特别是指一种CLE肽抗蒸腾剂及其开发方法和应用。
背景技术
由于自然环境变化和人类活动的影响，全球异常气候发生的频率和程度不断加强。由非生物胁迫导致的作物产量损失和品质下降已成为农业可持续发展的严重障碍，其中尤以土壤干旱导致的水分胁迫发生较为普遍，是全球农业生产的最大威胁之一。
干旱胁迫是指降水不足导致土壤水分亏缺。土壤缺水会降低地下水位，这可能会阻碍植物的生长和生存。干旱胁迫可能通过破坏各种生命活动，如碳同化、气体交换、膨压和氧化损伤增加，对植物产生有害影响。干旱胁迫也可影响离子平衡、酶活性、茎伸展、叶片扩展和根增殖等。干旱胁迫最终会引起植物严重的产量降低和品质下降。
目前已有一些植物激素如ABA以及人工合成的降低植物蒸腾、提高植物抗旱性的小分子外源植物生长调节剂用于农业生产和试验。但ABA价格较为昂贵，而外源合成的小分子外源植物生长调节剂则存在环境友好性差的问题。基于植物内源抗旱调节机制，开发新型高效、安全的植物生长调节剂是当前农业领域的重大需求。
CLAVATA3/胚乳周围区域相关肽(CLE)是植物中最重要的信号小肽家族之一，在拟南芥中其成员数达40多个。这些肽信号在细胞间通讯中很常见，并控制着植物的各种生理和发育过程。研究表明CLE肽可介导植物对环境刺激的响应。例如，在拟南芥中发现CLE9以ABA依赖性方式刺激气孔关闭。拟南芥CLE25作为从根部运动到地上部的长距离信号，起到干旱胁迫下诱导叶片气孔关闭以减少蒸腾失水的重要作用。但CLE家族中的大量其它成员的功能，特别是除拟南芥外的农业植物中的大量CLE基因的功能尚不清楚。
因此，希望发明一种CLE肽抗蒸腾剂，其环境友好，能够降低植物蒸腾，提高植株的耐旱能力及干旱下水分利用效率。
发明内容
为了克服上述现有技术中的缺点，本发明的一个目的在于提供一种CLE肽抗蒸腾剂，其环境友好，能够降低植物蒸腾，提高植株的耐旱能力及干旱下水分利用效率，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种CLE肽抗蒸腾剂的开发方法，其操作简便快捷，可操作性强，节省人力物力，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种CLE肽抗蒸腾剂的应用，其可以降低植物气孔开合度，增强植物抗蒸腾能力，增强植物抗旱能力，适于大规模推广应用。
本发明的另一目的在于提供一种CLE肽抗蒸腾剂的施用方法，其施用简单方便，施用成本低，适于大规模推广应用。
为达到以上目的，在本发明的第一方面，提供了一种CLE肽抗蒸腾剂，其特点是，包括十二肽PvCLE16p，所述十二肽PvCLE16p的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
较佳地，所述十二肽PvCLE16p的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
较佳地，所述十二肽PvCLE16p的浓度为10μM。
较佳地，所述CLE肽抗蒸腾剂还包括农药学上可接受的载体。
在本发明的第二方面，提供了一种上述的CLE肽抗蒸腾剂的开发方法，其特点是，包括以下步骤：
(1)根据已知的拟南芥CLE基因，在菜豆基因组数据库中筛选菜豆CLE候选基因，根据所述菜豆CLE候选基因构建菜豆CLE基因进化树，通过多重序列比对剔除没有CLE结构域的假阳性候选基因，确定菜豆CLE基因家族；
(2)根据在正常生长和干旱胁迫下的菜豆转录组数据，得到干旱胁迫下所述菜豆CLE基因的表达情况，从中筛选出在干旱胁迫下表达特异性上调的所述菜豆CLE基因，作为干旱相关候选CLE基因；
(3)对所述干旱相关候选CLE基因进行实时荧光定量PCR验证，获得干旱相关CLE基因；
(4)根据所述干旱相关CLE基因的DNA序列预测所述干旱相关CLE基因的成熟肽，采用所述成熟肽配制成所述CLE肽抗蒸腾剂。
较佳地，在所述步骤(1)中，采用CLAVATA3作为关键词在phytozome v13的拟南芥数据库以及TAIR数据库中进行搜索，从而获得所述的已知的拟南芥CLE基因；使用HMMsearch方法，以所述的已知的拟南芥CLE基因的多肽序列为电子探针，在phytozome v13的所述菜豆基因组数据库中鉴定菜豆CLE同源序列，将BLAST结果中E值≤10-5的所述菜豆CLE同源序列作为所述菜豆CLE候选基因；使用MEGA软件中的最大似然法构建所述菜豆CLE基因进化树，其中所述最大似然法的自展值为1000，所述菜豆CLE基因的数目为42个；
在所述步骤(2)中，所述菜豆转录组数据来自公共数据库GenBank SRR15910650、SRR15910649、SRR15910638、SRR15910627、SRR15910620、SRR15910619、SRR15910618、SRR15910617、SRR15910616、SRR15910615、SRR15910648、SRR15910647、SRR15910646、SRR15910645、SRR15910644、SRR15910643、SRR15910642、SRR15910641、SRR15910630、SRR15910629、SRR15910628、SRR15910626、SRR15910625、SRR15910624、SRR15910623、SRR15910622、SRR15910621，所述干旱相关候选CLE基因为PvCLE16基因；
在所述步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR采用的正向引物如SEQ ID NO：3所示，反向引物如SEQ ID NO：4所示，所述干旱相关CLE基因为所述PvCLE16基因；
在所述步骤(4)中，所述成熟肽为所述十二肽PvCLE16p。
在本发明的第三方面，提供了上述的CLE肽抗蒸腾剂在降低植物气孔开合度中的应用。
在本发明的第四方面，提供了上述的CLE肽抗蒸腾剂在增强植物抗蒸腾能力中的应用。
在本发明的第五方面，提供了上述的CLE肽抗蒸腾剂在增强植物抗旱能力中的应用。
在本发明的第六方面，提供了一种上述的CLE肽抗蒸腾剂的施用方法，其特点是，将所述CLE肽抗蒸腾剂喷施在植物的叶片上。
本发明的有益效果在于：
a.本发明的CLE肽抗蒸腾剂包括十二肽PvCLE16p，十二肽PvCLE16p的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其环境友好，能够降低植物蒸腾，提高植株的耐旱能力及干旱下水分利用效率，适于大规模推广应用。
b.本发明的上述的CLE肽抗蒸腾剂的开发方法包括：根据已知的拟南芥CLE基因，在菜豆基因组数据库中筛选菜豆CLE候选基因，构建菜豆CLE基因进化树，通过多重序列比对剔除没有CLE结构域的假阳性候选基因，确定菜豆CLE基因；根据在正常生长和干旱胁迫下的菜豆转录组数据，得到干旱胁迫下菜豆CLE基因的表达情况，从中筛选出在干旱胁迫下表达特异性上调的菜豆CLE基因，作为干旱相关候选CLE基因；进行实时荧光定量PCR验证，获得干旱相关CLE基因；根据其DNA序列预测其成熟肽，采用成熟肽配制成CLE肽抗蒸腾剂，因此，其操作简便快捷，可操作性强，节省人力物力，适于大规模推广应用。
c.本发明的上述的CLE肽抗蒸腾剂在降低植物气孔开合度、增强植物抗蒸腾能力、增强植物抗旱能力中的应用，因此，其可以降低植物气孔开合度，增强植物抗蒸腾能力，增强植物抗旱能力，适于大规模推广应用。
d.本发明的上述的CLE肽抗蒸腾剂的施用方法是将所述CLE肽抗蒸腾剂喷施在植物的叶片上，因此，其施用简单方便，施用成本低，适于大规模推广应用。
本发明的这些和其它目的、特点和优势，通过下述的详细说明和附图得以充分体现，并可通过说明书中特地指出的方法、手段和它们的组合得以实现。
附图说明
图1为菜豆CLE基因家族的完整系统树。
图2为不同物种间PvCLE蛋白全长序列比对。
图3为PvCLE16在干旱胁迫下的数据库表达谱和qRT-PCR验证结果，分别在正常供水、干旱胁迫、恢复供水三个阶段取样，每个阶段有3个时间点的取样结果，分别为6点、12点和20点，用FPKM(Fragments Per Kilobase per Million)衡量基因表达量。
图4为外源施用PvCLE16使菜豆叶片气孔关闭实验结果图。
图5为干旱胁迫下PvCLE16处理菜豆植株显示更强的抗旱性。
图6为干旱胁迫下PvCLE16处理菜豆植株对叶片气孔导度的影响。
图7为干旱胁迫下PvCLE16处理豇豆植株也能赋予更强的抗旱性。
具体实施方式
为了能够降低植物蒸腾，提高植株的耐旱能力及干旱下水分利用效率，且环保，本发明提供了一种CLE肽抗蒸腾剂，包括十二肽PvCLE16p，所述十二肽PvCLE16p的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
所述十二肽PvCLE16p的核苷酸序列可以基于所述氨基酸序列根据氨基酸密码子对照表确定，较佳地，所述十二肽PvCLE16p的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述十二肽PvCLE16p的浓度可以根据需要确定，较佳地，所述十二肽PvCLE16p的浓度为10μM。
所述CLE肽抗蒸腾剂可以只包括十二肽PvCLE16p，也可以除十二肽PvCLE16p外还包括其它任何合适的构成，较佳地，所述CLE肽抗蒸腾剂还包括农药学上可接受的载体。
所述的“农药学上可接受的载体”是将本发明的十二肽PvCLE16p传送给植物的农药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。适用于本发明的农药学上可接受的载体可以选自：水、缓冲液、1/2MS、表面活性剂如Tween-20、或其组合。
还提供了一种上述的CLE肽抗蒸腾剂的开发方法，包括以下步骤：
(1)根据已知的拟南芥CLE基因，在菜豆基因组数据库中筛选菜豆CLE候选基因，根据所述菜豆CLE候选基因构建菜豆CLE基因进化树，通过多重序列比对剔除没有CLE结构域的假阳性候选基因，确定菜豆CLE基因；
(2)根据在正常生长和干旱胁迫下的菜豆转录组数据，得到干旱胁迫下所述菜豆CLE基因的表达情况，从中筛选出在干旱胁迫下表达特异性上调的所述菜豆CLE基因，作为干旱相关候选CLE基因；
(3)对所述干旱相关候选CLE基因进行实时荧光定量PCR验证，获得干旱相关CLE基因；
(4)根据所述干旱相关CLE基因的DNA序列预测所述干旱相关CLE基因的成熟肽，采用所述成熟肽配制成所述CLE肽抗蒸腾剂。
实施上述步骤的具体方法可以根据需要确定，较佳地，在所述步骤(1)中，采用CLAVATA3作为关键词在phytozome v13的拟南芥数据库以及TAIR数据库中进行搜索，从而获得所述的已知的拟南芥CLE基因；使用HMM search方法，以所述的已知的拟南芥CLE基因的多肽序列为电子探针，在所述phytozome v13的所述菜豆基因组数据库中鉴定菜豆CLE同源序列，将BLAST结果中E值≤10-5的所述菜豆CLE同源序列作为所述菜豆CLE候选基因；使用MEGA软件中的最大似然法构建所述菜豆CLE基因进化树，其中所述最大似然法的自展值为1000，所述菜豆CLE基因的数目为42个；
在所述步骤(2)中，所述菜豆转录组数据来自发明人上传至公共数据库GenBank的信息，GenBank数据登录号分别为：SRR15910650、SRR15910649、SRR15910638、SRR15910627、SRR15910620、SRR15910619、SRR15910618、SRR15910617、SRR15910616、SRR15910615、SRR15910648、SRR15910647、SRR15910646、SRR15910645、SRR15910644、SRR15910643、SRR15910642、SRR15910641、SRR15910630、SRR15910629、SRR15910628、SRR15910626、SRR15910625、SRR15910624、SRR15910623、SRR15910622、SRR15910621，所述干旱相关候选CLE基因为PvCLE16基因；
在所述步骤(3)中，所述实时荧光定量PCR采用的正向引物如SEQ ID NO：3所示，反向引物如SEQ ID NO：4所示，所述干旱相关CLE基因为所述PvCLE16基因；
在所述步骤(4)中，所述成熟肽为所述十二肽PvCLE16p。
还提供了上述的CLE肽抗蒸腾剂在降低植物气孔开合度中的应用。
还提供了上述的CLE肽抗蒸腾剂在增强植物抗蒸腾能力中的应用。
还提供了上述的CLE肽抗蒸腾剂在增强植物抗旱能力中的应用。
还提供了一种上述的CLE肽抗蒸腾剂的施用方法，将所述CLE肽抗蒸腾剂喷施在植物的叶片上。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
1材料和方法
1.1植物材料及生长环境
水培至长出三簇复叶的菜豆苗、豇豆苗作为外源多肽处理所用材料。
1.2主要试剂及仪器
主要化学试剂：MS培养基(购于北京索莱宝科技有限公司)，PEG6000(购于德国biofroxx公司)。
主要仪器：实时荧光定量PCR仪(qTOWER；德国耶拿分析仪器股份公司)、便携式光合仪(Li-6400)。
2干旱相关CLE基因的成熟肽的确定
2.1菜豆的CLE家族鉴定
(1)查找所有已知的拟南芥CLE基因：在phytozome v13(https://phytozome.jgi.doe.gov/)的拟南芥(Arabidopsis thaliana.)基因组数据库(Arabidopsis thaliana TAIR10：Phytozome genome ID:167·NCBI taxonomy ID:3702；Arabidopsis thaliana Araport11：Phytozome genome ID:447·NCBI taxonomy ID:3702)以及TAIR数据库(https://www.arabidopsis.org/)中，用CLE基因的相关注释“CLAVATA3”做关键词搜索，找出全部的拟南芥CLE基因(AtCLE)，并提取每个基因编码的多肽序列。
(2)菜豆CLE基因的查找：使用隐马尔可夫比对(HMM search，预期阈值(E)＝5)的方法，以上一步骤获取的AtCLE的多肽序列为电子探针，在Phytozome v13的菜豆(Phaseolus vulgaris Linn.)基因组数据库(版本为Phaseolus vulgaris v2.1)中鉴定菜豆CLE同源序列，将BLAST结果中E值(expect value)≤10-5的菜豆CLE同源序列作为菜豆CLE候选基因CLE候选基因。
(3)菜豆CLE基因的筛选和确定：考虑到仅以步骤(2)中的E值作为CLE候选基因的筛选标准并不足够严谨，因此根据菜豆CLE候选基因，进一步使用MEGA软件中的最大似然法(自展值1000)构建菜豆CLE基因进化树，并通过多重序列比对剔除没有CLE结构域的假阳性候选基因，最终确定菜豆CLE基因(PvCLE)。
2.2转录组学分析和qRT-PCR验证
(1)通过分析发明人上传至GenBank公共数据库中的在正常生长和干旱胁迫下的菜豆转录组数据(GenBank数据登录号：SRR15910650；SRR15910649；SRR15910638；SRR15910627；SRR15910620；SRR15910619；SRR15910618；SRR15910617；SRR15910616；SRR15910615；SRR15910648；SRR15910647；SRR15910646；SRR15910645；SRR15910644；SRR15910643；SRR15910642；SRR15910641；SRR15910630；SRR15910629；SRR15910628；SRR15910626；SRR15910625；SRR15910624；SRR15910623；SRR15910622；SRR15910621)，得到干旱胁迫下PvCLE的表达情况，从中筛选出在干旱胁迫下表达特异性上调的PvCLE，获得干旱相关候选CLE基因。
(2)进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证：采用的引物为PvCLE16-F和PvCLE16-R(杭州有康生物技术有限公司合成)，其正向引物PvCLE16-F如SEQ ID NO：3所示，其反向引物PvCLE16-R如SEQ ID NO：4所示。使用SYBR荧光染料。20μL反应体系由10μL SYBR、7.4μLddH2O、0.8μL正向引物、0.8μL反向引物和1μL cDNA模板组成。其中反转录cDNA所使用的RNA模板来自于正常灌溉、盆栽控水后3天以及恢复浇水后第一天的菜豆叶片。以菜豆UBI为内参基因，其正向引物如SEQ ID NO：5所示，其反向引物如SEQ ID NO：6所示。基因的相对表达量采用2-△△Ct法计算。
根据干旱相关CLE基因的DNA序列预测干旱相关CLE基因的成熟肽，即CLE保守结构域。
3效果验证
3.1成熟肽合成及CLE肽抗蒸腾剂配制
在金斯瑞生物科技股份有限公司通过化学合成方法合成干旱相关CLE基因的成熟肽。
1/2MS溶液配制，所用1/2MS溶液的成分如表1所示。
表1 1/2MS溶液的成分表
CLE肽抗蒸腾剂配制：用1/2MS溶液将成熟肽稀释至浓度10μM，并加入0.05％Tween-20，配好的溶液于4℃保存，2d内使用。
对照空白溶液配制：仅含有0.05％ Tween-20的1/2MS溶液。
3.2植株处理
采用液培法(1/2MS溶液)将菜豆植株培养至长出三簇复叶，分为空白溶液处理组(1/2MS溶液)和PvCLE16p溶液处理组(含10μM PvCLE16p的1/2MS溶液)，每组各含8株菜豆，然后同时进行干旱胁迫(含15％PEG-6000的1/2MS溶液培养)。PvCLE16p溶液处理组内菜豆植株喷施CLE肽抗蒸腾剂，空白溶液处理组喷施对照空白溶液。喷施部位为植物前两片展开叶及幼芽的背面。喷施后每隔2h观察表型及用Li-6400光合仪测定净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率。
3.3叶片气体交换参数测定
使用便携式光合仪，设置参数光强1000μmol m-2s-1、流速500μm s-1、温度24±2℃、使用CO2小钢瓶，浓度为400μmol mol-1，测量菜豆三簇复叶的净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Cond)。
3.4PvCLE16p对气孔开合的影响测定
将菜豆植株叶片用蒸馏水洗净，用镊子撕取下表皮，去除叶肉细胞，置于表皮条缓冲液中(10mM MES/50mM KCl，pH 6.15)，充分光照2h。然后分别用10μM和100μM的成熟肽溶液(用表皮条缓冲液配制)以及对照空白缓冲液(即表皮条缓冲液)处理相应表皮条，于1h、2h后在40倍显微镜下观察气孔开度并拍照记录。测量气孔的长度和宽度，计算宽度和长度的比值，并进行统计。每个处理3重复，每个重复包含50个气孔。
3.5十二肽抗蒸腾剂对豇豆的效果验证
为探究该新型十二肽抗蒸腾剂在其他作物上的应用，选择豇豆进行效果验证。使用1/2MS培养液将豇豆植株培养至长出三簇复叶，然后分为正常生长组(1/2MS溶液培养培养)和干旱胁迫组(含15％PEG-6000的1/2MS溶液培养)。两组内一半豇豆植株喷施十二肽抗蒸腾剂(含10μM PvCLE16p的1/2MS溶液)，另一半喷施对照溶液(1/2MS溶液)。喷施部位为植物前两片展开叶及幼芽的背面。后观察表型。
3.6数据分析
至少3次生物学重复用于上述实验。数据以均值±标准差(SD)表示。使用Excel和SPSS-20软件进行数据统计分析。采用独立样本的t检验进行显著性分析。
4结果与分析
4.1成熟肽--十二肽PvCLE16p的确定
经过上述2.1菜豆的CLE家族鉴定，鉴定出了包含42个基因的菜豆CLE家族，如表2所示。菜豆CLE基因家族进化树见图1，多重序列比对的结果见图2。
表2菜豆CLE基因信息
经过转录组学分析和qRT-PCR验证(图3)，发现基因PvCLE16(Phvul.002G095900，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)在干旱胁迫下特异性表达提升2-3倍，提示其可能参与了植物对干旱胁迫的响应。
通常，CLE蛋白靠近C末端的12-13个氨基酸为该家族蛋白的成熟肽。根据DNA序列预测，PvCLE16基因编码的蛋白的成熟肽即十二肽PvCLE16p的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.2人工合成的PvCLE16的成熟肽对菜豆叶片气孔开合的影响
通过化学合成的方法获得了该十二肽PvCLE16p。
为了确定十二肽PvCLE16p对于菜豆叶片气孔的影响，用包含十二肽PvCLE16p的MES-KCl缓冲液(即表皮条缓冲液)处理离体的菜豆叶片下表皮。与对照相比，经十二肽PvCLE16p处理过的菜豆叶片下表皮，其气孔开合度明显下降，并且随着时间推移，下降的程度越来越大(图4)。
4.3十二肽PvCLE16p外源处理对干旱条件下菜豆生长指标的影响
在PEG模拟干旱胁迫条件(含15％PEG-6000的1/2MS溶液培养)下，将菜豆植株分为空白溶液处理组(1/2MS溶液)和PvCLE16p溶液处理组(含10μM PvCLE16p的1/2MS溶液)，在喷施后24h后，可以看到，空白溶液处理的菜豆植株生长受到明显抑制，而PvCLE16p溶液处理的菜豆植株受到的干旱胁迫生长抑制作用较轻(图5)。
在对植株进行干旱胁迫前，先用气孔导度仪分别测量菜豆植株三簇复叶的气孔导度，进行方差分析，正常供水组和干旱胁迫组的气孔导度无显著性差异(ns)。分别在处理后2h、4h、6h连续观测，结果显示，在受到上述干旱胁迫后，喷施PvCLE16p溶液的菜豆植株的气孔导度显著低于空白对照溶液处理的菜豆植株(图6)，也就是说，该抗蒸腾剂能使菜豆植株气孔关闭程度增加以降低叶片的水分散失，更好的对抗干旱胁迫对植株造成的不良影响。
4.4十二肽抗蒸腾剂对豇豆的效果验证结果
在无胁迫培养条件下(1/2MS)的情况下，PvCLE16p和空白溶液处理豇豆植株长势没有明显差异(图7C、D)。在PEG模拟干旱胁迫条件(含15％PEG-6000的1/2MS溶液培养)下，空白溶液处理的豇豆植株生长受到明显抑制(图7A)，而PvCLE16小肽溶液处理的豇豆植株受到的干旱胁迫生长抑制作用较轻(图7B)。这证明源自菜豆基因编码的PvCLE16p不仅可以应用于菜豆植株，在豇豆上也有减轻干旱对植株不良影响的效果，具有推广到其他作物上的可能性。
本发明所具有的优点为：
1、本发明的CLE肽抗蒸腾剂主要成分为人工合成的植物内源小肽且用量极微，因此具有无毒、无污染的特点。
2、本发明的CLE肽抗蒸腾剂用于调控蔬菜在干旱胁迫下的生长，提高蔬菜的抗旱性，其能够通过植物叶片的气孔进入到植物体内，调控植物叶片的蒸腾，从而改善植物对干旱胁迫的抗性。
3、本发明提供了一种CLE肽抗蒸腾剂研发的新方法，具体为：生物信息学分析—表达谱分析—获得候选基因—效果验证，该方法可操作性强，节省人力物力。
4、本发明的研究结果对于进一步了解CLE肽在植物发育和响应干旱胁迫中的作用，以及通过外源喷施人工十二肽PvCLE16p提高植物抗旱性具有重要意义。
因此，本发明提供了一种快速开发植物CLE肽抗蒸腾剂的方法并提供了一种具有实际效用的CLE肽抗蒸腾剂。通过基因家族鉴定和转录组分析的方法，鉴定出了菜豆中干旱胁迫下特异性表达上调的基因PvCLE16，并通过qRT-PCR的方法验证，然后通过人工合成的方法合成该基因的成熟肽，外源喷施植株叶片，能降低叶片气孔导度，从而提高植株的耐旱能力及干旱下水分利用效率。研究结果对于通过外源喷施人工合成肽提高植物抗旱性具有重要意义。
综上所述，本发明的CLE肽抗蒸腾剂环境友好，能够降低植物蒸腾，提高植株的耐旱能力及干旱下水分利用效率，适于大规模推广应用。本发明的CLE肽抗蒸腾剂的开发方法操作简便快捷，可操作性强，节省人力物力，适于大规模推广应用。本发明的CLE肽抗蒸腾剂的应用，可以降低植物气孔开合度，增强植物抗蒸腾能力，增强植物抗旱能力，适于大规模推广应用。本发明的CLE肽抗蒸腾剂的施用方法施用简单方便，施用成本低，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
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序列表
<110> 中国计量大学
<120> CLE肽抗蒸腾剂的应用
<160> 7
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 菜豆（Phaseolus vulgaris Linn.）
<220>
<221> peptide
<222> (1)...(12)
<223> 菜豆PvCLE16基因编码的蛋白的成熟肽
<400> 1
Arg Ile Ile His Thr Gly Pro Asn Pro Leu His Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 菜豆（Phaseolus vulgaris Linn.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(36)
<223> 菜豆PvCLE16基因编码的蛋白的成熟肽的核苷酸序列
<400> 2
agaataattc acactggtcc aaaccctctt cacaac 36
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(23)
<223> 扩增菜豆PvCLE16基因的正向引物
<400> 3
ccacaaccac atcaagaaca aga 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(20)
<223> 扩增菜豆PvCLE16基因的反向引物
<400> 4
ggatcacgct caaccacctt 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(18)
<223> 扩增菜豆UBI基因的正向引物
<400> 5
cagctggagg atggaagg 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)...(21)
<223> 扩增菜豆UBI基因的反向引物
<400> 6
tccgaactct ccacctcaag a 21
<210> 7
<211> 378
<212> DNA
<213> 菜豆（Phaseolus vulgaris Linn.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(378)
<223> 菜豆PvCLE16基因的编码序列
<400> 7
atgataggtt tcagagaaag agaaaggaca agagaaagaa ggctttcttg ggccagactc 60
gcaattttct tcttgtgggt catcctagtt ttttctctaa taagcttgtt tttctccatg 120
gacaaggaaa gcaaaaccac cagaaccaca tccacaacca catcaagaac aagaaccaga 180
accaaccatc tacttaagcg acgtagcctc accaggacct tgtttcacac accctcaagc 240
agcaccagca tcagcagcag cagcagcagc taccctcaac aaaaaaccaa ggtggttgag 300
cgtgatccac accacactac cctttatggt gatgacaaaa gaataattca cactggtcca 360
aaccctcttc acaactag 378

Claims (3)

1.CLE肽抗蒸腾剂在降低植物气孔开合度中的应用，其中所述CLE肽抗蒸腾剂包括十二肽PvCLE16p，所述十二肽PvCLE16p的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述植物是菜豆。
2.CLE肽抗蒸腾剂在增强植物抗蒸腾能力中的应用，其中所述CLE肽抗蒸腾剂包括十二肽PvCLE16p，所述十二肽PvCLE16p的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述植物是菜豆。
3.CLE肽抗蒸腾剂在增强植物抗旱能力中的应用，所述CLE肽抗蒸腾剂包括十二肽PvCLE16p，所述十二肽PvCLE16p的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述植物是菜豆或豇豆。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1469931A (zh) * 2000-06-16 2004-01-21 植物研究国际公司 植物信号传导配体样蛋白质
CN103088054A (zh) * 2012-12-29 2013-05-08 中国科学院植物研究所 一种干扰植物内源cle家族多肽激素的方法及小分子多肽激素的拮抗多肽
CN111018959A (zh) * 2019-12-31 2020-04-17 中国农业大学 Bmdr蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1469931A (zh) * 2000-06-16 2004-01-21 植物研究国际公司 植物信号传导配体样蛋白质
CN103088054A (zh) * 2012-12-29 2013-05-08 中国科学院植物研究所 一种干扰植物内源cle家族多肽激素的方法及小分子多肽激素的拮抗多肽
CN111018959A (zh) * 2019-12-31 2020-04-17 中国农业大学 Bmdr蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用

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