CN113730582A

CN113730582A - Slc12a5及其抑制剂的应用

Info

Publication number: CN113730582A
Application number: CN202110891154.4A
Authority: CN
Inventors: 徐迅迪; 秦伟
Original assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2021-08-04
Filing date: 2021-08-04
Publication date: 2021-12-03
Anticipated expiration: 2041-08-04
Also published as: CN113730582B

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，公开了SLC12A5及其抑制剂的应用。本发明通过特异性抑制剂抑制SLC12A5的生物学功能，与对照相比，SLC12A5抑制剂可以显著抑制胆管癌细胞增殖以及克隆形成率，此外还能够显著抑制皮下瘤生长，从而提示了以SLC12A5为靶点可以提供一种制备治疗或改善肝内胆管癌的药物和治疗肝内胆管癌的新途径。

Description

SLC12A5及其抑制剂的应用

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及SLC12A5及其抑制剂的应用。

背景技术

肝内胆管细胞癌(ICC)通常被认为起源于肝内胆管上皮细胞，其发病率在全世界范围内呈明显上升趋势，是肝脏第二大原发恶性肿瘤，约占全部肝脏原发恶性肿瘤的5％-30％。ICC发病隐匿，侵袭性高，易侵犯肝脏周围组织，发生淋巴结和远处转移，因此大部分患者在初诊时已处于晚期。即使在有条件接受根治性手术的患者中，术后复发率仍有40％-80％，5年生存率仅为 20％-40％。ICC目前缺乏有效的治疗方案，其中肿瘤多发、淋巴结转移、远处转移是影响术后肿瘤复发的关键因素。近年来，随着对ICC相关肿瘤微环境、基因、蛋白、表观遗传修饰、信号通路及其与HBV关系的研究不断深入，潜在治疗靶点不断被发掘，基于这些靶点的临床试验将会层出不穷，为这种高度恶性、预后不佳的肿瘤的治疗带来新曙光。新胆管癌治疗药物的发现有望为胆管细胞癌的治疗提供新的途径和手段。

溶质转运蛋白(Solute Carrier,SLC)超家族是一类重要的细胞膜蛋白家族，介导细胞与外界以及细胞内各类溶质的跨膜运输，参与了细胞间的能量传递、营养代谢、信号传导等重要的生理病理过程。SLC12A5是溶质转运蛋白家族的成员，是Na⁺/K⁺、Cl^-在细胞膜上的共转运蛋白，在健康的人体中多表达于大脑组织。SLC12A5存在两种亚型，由不同的启动子启动产生，研究发现，缺乏这两种亚型的小鼠会在出生后不久因为呼吸衰竭以及运动缺陷而死亡。SLC12A5在中枢神经系统神经元中高表达。很多神经系统疾病的研究表明，SLC12A5的异常表达与癫痫发作有关，也与应激障碍、慢性疼痛以及精神问题相关。近年来也有研究发现SLC12A5在膀胱移行细胞癌、结直肠癌和肺腺癌等肿瘤疾病中高表达。该基因能显著增强细胞增殖和促进G1－S期转化，抑制肿瘤细胞凋亡，但是其在其他癌症中的作用仍未有相关研究和报道。

目前国内外关于SLC12A5在神经系统之外的研究很少，特别是在肝脏中的研究寥寥无几。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member5)作为治疗或改善肝内胆管癌的靶点中的应用，即任何形式的对其抑制、沉默、敲除、降低表达的方式或物质都可以应用于治疗或改善肝内胆管癌或其相关药物制备中；

本发明的另外一个目的在于提供SLC12A5抑制剂在制备治疗或改善肝内胆管癌的药物中的应用。

本发明应用SLC12A5的小分子特异性抑制剂VU0240551进行SLC12A5 的抑制，并验证相关实验效果；VU0240551的CAS号：893990-34-6，分子式：C₁₆H₁₄N₄OS₂，分子量：342.44，是SLC12A5通道的抑制剂，结构式如下：

MTT实验结果表明，分别对人胆管癌细胞系RBE细胞和HUCCT1细胞给予SLC12A5特异性抑制剂VU0240551干预后细胞增殖能力明显减弱；平板克隆实验同样表明，给予胆管癌细胞VU0240551治疗后明显降低其增殖能力。同时，PDX实验表明，相对于对照组而言，VU0240551干预可以显著抑制皮下瘤生长。这些数据表明，SLC12A5的靶向抑制剂VU0240551可以通过抑制SLC12A5的生物学功能起到抑制肝内胆管癌增殖能力的作用。

作为优选，所述SLC12A5抑制剂包括抑制SLC12A5的化学药物、多肽 /蛋白类药物和基因药物中的一种或多种。其中，所述基因药物选自：能降低 SLC12A5表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、SLC12A5反义核苷酸或它们任意的组合；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、 miRNA、SLC12A5反义核苷酸的构建物或它们任意的组合。其中，所述多肽 /蛋白类药物中多肽是α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物，不具备空间结构(即蛋白质的一级结构)；蛋白质是N 条多肽链按一定的空间结构缠绕构成的高分子物质，具有一定空间结构(即蛋白质的二级、三级、四级结构)；所述构建物指基因工程领域中能够承载并表达核苷酸的载体，包括但不限于细菌质粒、噬菌体、重组病毒载体和真核重组表达载体中的至少一种。

在本发明具体实施方式中，所述化学药物为SLC12A5特异性抑制剂 VU0240551。

此外，所述药物中还包括药学上可接受的载体，包括但不限于溶剂、聚合物、脂质体、重组病毒载体和真核重组表达载体中的至少一种。

作为优选，所述药物为口服药物或注射药物，剂型包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂或溶液剂。

由以上技术方案可知，本发明通过特异性抑制剂抑制SLC12A5的生物学功能，与对照相比，SLC12A5抑制剂可以显著抑制胆管癌细胞增殖以及克隆形成率，此外还能够显著抑制皮下瘤生长，从而提示了以SLC12A5为靶点可以提供一种制备治疗或改善肝内胆管癌的药物和治疗肝内胆管癌的新途径。

附图说明

图1所示胆管癌细胞RBE及HUCCT1的MTT实验结果；A、B为RBE 和HUCCT1分别给予不同浓度VU0240551干预后MTT结果；

图2所示胆管癌细胞RBE及HUCCT1的平板克隆结果；A为RBE细胞平板克隆形成比率结果；B为HUCCT1细胞平板克隆形成比率结果；

图3所示建立人胆管癌PDX模型，给予VU0240551干预后NOD-SCID 鼠皮下成瘤结果。

具体实施方式

本发明公开了SLC12A5及其抑制剂的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明所涉及的实验的材料和方法参照如下：

1、实验动物和细胞

本研究使用的小鼠为雄性NOD-SCID小鼠，饲养于本院实验动物研究中心，每笼8只小鼠，每天12h光照，自由饮食饮水，独立供气系统，环境温度恒定在22℃-26℃。购得4周龄小鼠在适应环境一周后开始实验。所有动物实验均获中南大学实验动物伦理委员会批准，并严格遵守管理规范条例。

本实验使用的人胆管癌细胞系RBE使用含有0.5％的青霉素和链霉素、 5％胎牛血清的RPMI1640完全培养基培养，HUCCT1细胞使用含有0.5％的青霉素和链霉素、5％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基培养，每隔2-3天用含Tris-EDTA的胰酶干预消化并传代。细胞培养在37℃、5％CO₂细胞培养箱中。

2、实验试剂

表1

3、实验方法

3.1、MTT实验

RBE和HUCCT1细胞以1.5×10³细胞/孔种板于96孔板,用不同浓度的 VU0240551干预0、24、48、72、96h。接下来,20μL MTT(5mg/ml)溶液添加到每个孔,继续孵育4h后置换成150μLDMSO，振荡10分钟。以490nm 波长进行吸光度测量。如图1所示，分别以1μM，5μM、10μM，20μM、 50μM干预RBE和HUCCT1细胞，RBE和HUCCT1的增殖能力与对照组比较明显降低，差异有统计学意义(*代表P＜0.05,***P＜0.0001)。

3.2、平板克隆

细胞克隆形成实验的目的是检测细胞的增殖能力。详细实验步骤如下：

(1)观察细胞生长状态，选择对数生长时期的细胞，倒净培养瓶中的培养基，胰酶消化细胞。

(2)1000rpm，5min后弃上清，加入培养液制备单细胞重悬液，细胞计数板计数800个单悬细胞，分别接种至6孔板中，恒温细胞培育箱中培养 (5％CO₂，37℃)。

(3)、细胞完全贴壁后根据实验设计用含10％胎牛血清的DMEM/RPMI 1640完全培养基配制所需不同浓度梯度的药物，每组浓度3个复孔，抑制剂 VU0240551浓度为50μM。轻柔地将6孔板上层培养基吸出，加入相应浓度药物，置于37℃，5％CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中培养12-14天；

(3)待观察到肉眼可见的细胞集团后停止培养，PBS洗涤2次，使用多聚甲醛固定25min，然后PBS洗3次，加入1％结晶紫染料15min后使用清水轻洗，干燥后拍照计数。

(4)细胞＞50可计为克隆团，克隆形成比率＝(团数/接种细胞数)×100％。

3.3、PDX皮下成瘤实验

(1)选取临床确诊为胆管细胞癌的患者，手术标本离体后尽快切取200-500mm³的新鲜肿瘤组织(选取肿瘤边缘活性较好的肿瘤组织)，4℃ RPMl-1640培养液中保存(DMEM+10％FBS+100U/ml青/链霉素),立即转运至实验室。

(3)含有青霉素/链霉素的冰生理盐水清洗，无菌的眼科剪将坏死的肿瘤组织、瘤周和瘤内的脂肪组织及纤维组织剔除，尽量留取具有肿瘤活性组织块，无菌剪将肿瘤组织剪成2×1×1mm小块。

(4)取2-4只NOD-SCID免疫缺陷小鼠，将每只动物的前肢背侧备皮并用70％酒精进行皮肤消毒，将选好的肿瘤块在Matrigel基质胶中浸润包被后，用镊子从针头处塞入20号套管针植入皮下，初代每只小鼠接种1-2处。

(5)记录观察肿瘤出现生长的时间、长短径、宿主的全身情况V＝(L× W²)/2。

(6)肿瘤达到800-1000mm³时需要传代至下一代小鼠，需要对肿瘤进行再次移植，待传至第三代时，肿瘤生长周期稳定，将肿瘤传至24只4周龄雄性NOD-SCID鼠右前背侧，观察其生长。

(7)肿瘤长至长径约0.5cm时，随机分组分别给予药物干预：

对照组：

于腹腔内注射溶有同等量DMSO溶剂的PBS，1次/天；

治疗干预组：

将VU0240551溶解于DMSO中制备100mM的母液,以玉米油或PBS稀释后形成注射药物，对小鼠进行腹腔内注射，剂量为0.04mg/(kg体重)，1次 /天。

(8)肿瘤大小以体积＝1/2×长度×宽度²检测。在给药21天后将小鼠处死，比较生存率和肿瘤体积大小。

实验中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下就本发明所提供的SLC12A5及其抑制剂的应用做进一步说明。

实施例1：VU0240551能够显著抑制胆管癌细胞的增殖能力

MTT实验结果表明，分别对RBE和HUCCT1细胞给予VU0240551干预后细胞增殖能力明显减弱，如图1A、1B所示，分别以相应浓度的 VU0240551干预胆管癌细胞RBE和HUCCT1，胆管癌细胞的增殖能力与对照组比较明显降低，差异有统计学意义(*代表P＜0.05，***代表P＜0.0001)。

平板克隆实验同样表明，给予胆管癌细胞VU0240551治疗后明显降低其增殖能力。图2中A显示，相比于对照组，VU0240551可以显著抑制胆管癌细胞RBE的克隆形成率，其中P＜0.01。图2中B，VU0240551可以显著抑制HUCCT1胆管癌细胞的克隆形成率，其中**代表P＜0.01。

实施例2：VU0240551在小鼠体内显著抑制皮下瘤的生长

PDX实验表明，结果如图3，相对于对照组而言，VU0240551干预可以显著抑制皮下瘤生长，P＜0.0001。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.以SLC12A5作为治疗或改善肝内胆管癌的靶点制备药物中的应用。

2.SLC12A5抑制剂在制备治疗或改善肝内胆管癌的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述SLC12A5抑制剂包括抑制SLC12A5的化学药物、多肽/蛋白类药物和基因药物中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述基因药物选自：能降低SLC12A5表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、SLC12A5反义核苷酸或它们任意的组合；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、SLC12A5反义核苷酸的构建物或它们任意的组合。

5.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述化学药物为SLC12A5特异性抑制剂VU0240551。

6.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述药物中还包括药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括溶剂、聚合物、脂质体、重组病毒载体和真核重组表达载体中的至少一种。

8.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述药物为口服药物或注射药物，剂型包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂或溶液剂。