CN113584172B - Slc12a5及其抑制剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域，公开了SLC12A5及其抑制剂的应用。本发明通过特异性抑制剂从分子水平和蛋白水平对SLC12A5进行抑制，与对照相比，无论在体内还是在体外，通过抑制SLC12A5的表达和活性均可以显著的抑制肝癌细胞的增殖，从而提示了以SLC12A5为靶点可以提供一种制备治疗或改善肝癌的药物和治疗肝癌的新途径。

Description

SLC12A5及其抑制剂的应用
技术领域
本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及SLC12A5及其抑制剂的应用。
背景技术
肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是一种恶性程度非常高的肿瘤，因其起病隐匿、进展迅速，病死率在全世界恶性肿瘤中居第二位。虽然手术切除、肿瘤血管栓塞和射频消融等治疗方式有效地提高了肝癌患者的生存率，但是多数患者终因肝癌侵袭进展，预后极差。从分子水平探索肝癌的发病机制，寻找影响其发生和进展的关键分子，评估其成为分子标记物和干预靶点的可能性，将为发现并鉴定新型治疗靶点，制定有效的治疗策略奠定理论基础。
溶质转运蛋白(Solute Carrier,SLC)超家族是一类重要的细胞膜蛋白家族，介导细胞与外界以及细胞内各类溶质的跨膜运输，参与了细胞间的能量传递、营养代谢、信号传导等重要的生理病理过程。SLC12A5是溶质转运蛋白家族的成员，是Na+/K+、Cl-在细胞膜上的共转运蛋白，在健康的人体中多表达于大脑组织。SLC12A5存在两种亚型，由不同的启动子启动产生，研究发现，缺乏这两种亚型的小鼠会在出生后不久因为呼吸衰竭以及运动缺陷而死亡。SLC12A5在中枢神经系统神经元中高表达。很多神经系统疾病的研究表明，SLC12A5的异常表达与癫痫发作有关，也与应激障碍、慢性疼痛以及精神问题相关。近年来也有研究发现SLC12A5在膀胱移行细胞癌、结直肠癌和肺腺癌等肿瘤疾病中高表达。该基因能显著增强细胞增殖和促进G1－S期转化，抑制肿瘤细胞凋亡，但是其在其他癌症中的作用仍未有相关研究和报道。
目前国内外关于SLC12A5在神经系统之外的研究很少，特别是在肝脏中的研究寥寥无几。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供SLC12A5(Solute Carrier Family 12 Member5)作为治疗或改善肝癌的靶点中的应用，即任何形式的对其抑制、沉默、敲除、降低表达的方式或物质都可以应用于治疗或改善肝癌或其相关药物制备中；
本发明的另外一个目的在于提供SLC12A5抑制剂在制备治疗或改善肝癌的药物中的应用。
本发明应用SLC12A5的小分子特异性抑制剂VU0240551在体内和体外检测抑制肝癌细胞的增殖能力；VU0240551的CAS号：893990-34-6，分子式：C16H14N4OS2，分子量：342.44，是SLC12A5通道的抑制剂，结构式如下：
Figure BDA0003196330030000021
结果显示，VU 0240551作用于Huh7和HepG2细胞，克隆形成实验表明VU 0240551治疗对肝癌细胞的生长具有明显的抑制作用，MTs检测发现VU 0240551能够有效抑制Huh7和HepG2细胞的增殖作用。
与体外结果一致，与对照肿瘤相比，VU 0240551治疗显著降低了裸鼠皮下移植瘤的生长。这些数据表明，SLC12A5的靶向抑制剂VU 0240551可以通过抑制SLC12A5的生物学功能起到抑制肝癌增殖能力的作用。
作为优选，所述SLC12A5抑制剂包括抑制SLC12A5的化学药物、多肽/蛋白类药物和基因药物中的一种或多种。其中，所述基因药物选自：能降低SLC12A5表达量的siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、SLC12A5反义核苷酸或它们任意的组合；或者能表达或形成所述siRNA、dsRNA、shRNA、miRNA、SLC12A5反义核苷酸的构建物或它们任意的组合。其中，所述多肽/蛋白类药物中多肽是α-氨基酸以肽链连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物，不具备空间结构(即蛋白质的一级结构)；蛋白质是N条多肽链按一定的空间结构缠绕构成的高分子物质，具有一定空间结构(即蛋白质的二级、三级、四级结构)；所述构建物指基因工程领域中能够承载并表达核苷酸的载体，包括但不限于细菌质粒、噬菌体、重组病毒载体和真核重组表达载体中的至少一种。
此外，所述药物中还包括药学上可接受的载体，包括但不限于溶剂、聚合物、脂质体、重组病毒载体和真核重组表达载体中的至少一种。
作为优选，所述药物为口服药物或注射药物，剂型包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂或溶液剂。
由以上技术方案可知，本发明通过特异性抑制剂分别从分子水平和蛋白水平对SLC12A5进行抑制，与对照相比，无论在体内还是在体外，通过抑制SLC12A5的表达和活性均可以显著的抑制肝癌细胞的增殖，从而提示了以SLC12A5为靶点可以提供一种制备治疗或改善肝癌的药物和治疗肝癌的新途径。
附图说明
图1所示为VU 0240551对肝癌细胞的增殖能力的影响；A为VU 0240551结构式；B为克隆形成实验结果；C、D为MTs细胞增殖实验结果；E、F为裸鼠肝癌异种移植瘤模型实验结果，E中标尺为10mm；***表示p＜0.0001。
具体实施方式
本发明公开了SLC12A5及其抑制剂的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述应用盒已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明所涉及的实验的材料和方法参照如下：
1、细胞系
人HepG2和Huh7肝癌细胞来自中国科学院细胞库(中国上海)。所有无支原体细胞在DMEM-高葡萄糖培养基(美国马萨诸塞州海克隆)培养，补充10％胎儿牛血清。
2、实验动物
用于构建肝癌异种移植瘤模型的雄性BALB/c裸鼠(5周龄)购买于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。所有动物实验都按照中南大学动物护理和使用委员会批准的协议进行。
3、克隆形成实验
将HepG2和Huh7细胞以0.5×102细胞/mL种在6孔板中，肝癌细胞的密度接种于6孔板中，每孔加入2mL细胞悬液，置于含5％CO2的37℃培养箱中培养，待细胞贴壁24小时后向培养基中加入药物干预，再继续培养10-15天。待单细胞克隆长至适宜大小时，弃掉培养基，PBS洗3次。加入1mL甲醇，对细胞进行固定，室温静置15min。将甲醇弃掉，用PBS冲洗3次。应用1mL结晶紫加入孔内，对细胞进行染色，室温静置15分钟。吸掉结晶紫，用PBS冲洗3次。晾干，拍照，计数细胞数大于50的细胞克隆。
4、MTs细胞增殖实验
将对数期生长的HepG2和Huh7细胞，调整细胞悬液浓度至2×104/L，每孔加入100ul细胞悬液,铺板使待测细胞调密度至2×103孔。同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。接种细胞后继续在5％CO2，37℃培养箱中孵育，至细胞贴壁后,加入浓度梯度的药物，每组5个复孔。继续5％CO2，37℃培养箱培养。分别于0h、24h、48h、72h小时应用MTT进行检测细胞增殖。检测时每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h。终止培养，吸去培养液。孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm处测量各孔的吸光值。
5、裸鼠肝癌异种移植瘤模型
取8只BALB/c雄性裸鼠(5周龄)，将Huh7肝癌细胞(1×107细胞)在右侧背部皮下注射，构建裸鼠肝癌异种移植瘤模型。待肉眼可见的肿瘤形成后，开始腹腔注射药物，对照组给与腹腔注射溶有同等体积DMSO的PBS溶液。
在裸鼠肿瘤生长的过程中，每隔一天测量双侧肿瘤的长径(a)和短径(b),计算肿瘤的大小(肿瘤体积V＝4/3×3.14×(短直径)2×(长直径)。绘制肿瘤生长曲线，检测VU0240551对裸鼠肿瘤生长的影响。肉眼可见的肿瘤形成21天后，处死裸鼠后，分离瘤体，测量并计算瘤体的体积，称取瘤体的重量。统计分析药物干预组和对照组之间肿瘤体积和重量的差异。
实验中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下就本发明所提供的SLC12A5及其抑制剂的应用做进一步说明。
实施例1：VU 0240551在体内和体外均能显著抑制肝癌细胞的增殖能力
VU0240551是SLC12A5的小分子特异性抑制剂(结构式见图1A)。本实施例试图确定SLC12A5靶向抑制剂VU 0240551是否能阻止SLC12A5升高诱导肝癌细胞增殖。应用VU0240551作用于Huh7和HepG2细胞，克隆形成实验也表明VU 0240551治疗对肝癌细胞的生长具有明显的抑制作用(图1B)，MTs检测发现VU 0240551能够有效抑制Huh7和HepG2细胞的增殖作用(图1C-D)。
与体外结果一致，我们发现与对照肿瘤相比，VU 0240551治疗显著降低了裸鼠皮下移植瘤的生长(图1E-F)。这些数据表明，SLC12A5的靶向抑制剂VU 0240551可以通过抑制SLC12A5的生物学功能起到抑制肝癌增殖能力的作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.SLC12A5抑制剂在制备治疗或改善肝癌的药物中的应用，所述化学药物为SLC12A5特异性抑制剂VU0240551，结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物中还包括药学上可接受的载体。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括溶剂、聚合物、脂质体、重组病毒载体和真核重组表达载体中的至少一种。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物为口服药物或注射药物，剂型包括片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、丸剂或溶液剂。
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