CN113729227A - 基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于益生菌微胶囊制剂领域，更具体地，涉及基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂及其制备方法。该方法将分散有颗粒稳定剂的水相连续相和含有益生菌的水相分散相通过剪切乳化，制备得到负载益生菌的、稳定的水包水Pickering乳液，该负载益生菌的乳液经干燥后即可得到益生菌微胶囊制剂。该方法构建的水包水乳液体系打破了传统油水乳液体系存在的油‑水界面屏障，突破了包埋益生菌后在干燥过程中水分能自由迁移，实现了通过水包水Pickering乳液包埋与干燥相结合，尤其是能够直接通过喷雾干燥制备益生菌固体制剂。本发明制备的益生菌制剂提高了益生菌的耐受性，其在常温条件下保存六个月后，存活率仍可高达97％以上。

Description

基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于益生菌微胶囊制剂领域，更具体地，涉及基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂及其制备方法。
背景技术
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥对肠道有益作用的活性有益微生物的总称。人体、动物体内有益的细菌或真菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、放线菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最强大的产品主要是以上各类微生物组成的复合活性益生菌，其广泛应用于生物工程、工农业、食品安全以及生命健康领域。
益生菌的乳化包埋技术多为发酵后包埋，即先收获大量的益生菌细胞，再将益生菌细胞液与油相混合乳化，得到包含益生菌细胞的油包水乳液，包被的益生菌分散在水相中。如Wang等人制备了W1/O/W2乳液包埋嗜酸乳杆菌，包囊化后的嗜酸乳杆菌在酸性和碱性条件存活率显著提高，抵御胃肠道消化能力增强。也有研究报道将植物乳杆菌冷冻干燥粉末封装在以乳清分离蛋白微凝胶稳定的高内相乳剂中，通过相对降低的湿度限制植物乳杆菌与水的接触，在巴氏杀菌条件下植物乳杆菌细胞活力显著提高。或是通过复合凝聚法包埋益生菌制备微胶囊，如Zhao等人采用异蛋白复合凝聚法(A型明胶/酪蛋白酸钠，GE/Cas)和蛋白质-多糖复合凝聚法(A型明胶/阿拉伯胶，GE/GA)得到罗伊氏乳杆菌微胶囊，喷雾干燥后罗伊氏乳杆菌活性未下降，抵抗环境能力显著提高。但本质上加入菌体的浓度决定了最终产品的菌体密度，这些方法在制备高密度、高活性的益生菌固体制剂一直存在挑战，制约了该行业的发展。
发酵前包被益生菌是指先对益生菌包埋负载，然后再进行发酵培养，益生菌在载体内继续增殖，最终得到发酵前包被的益生菌微胶囊。通过发酵前包被益生菌制得的制剂具有更强的耐药性、耐热性和抗冷冻干燥能力，如Cheow等人通过发酵前包埋技术得到的高密度鼠李糖乳杆菌微胶囊，其抗冷冻干燥能力提升了40倍，耐热性能也显著提高(Biomacromolecules,2013,14,3214-3222)。因此，结合乳化法和发酵前包被技术包埋益生菌实现其微囊化具有广阔的前景。但传统的油包水乳液包埋益生菌制备微胶囊技术存在油-水界面(比如专利文献CN108853021A)，阻止了营养物质的迁入和代谢产物的扩散迁出，抑制了益生菌的生长，不利于益生菌的发酵培养。此外，油水界面的存在也阻止了水分的传输，无法直接通过喷雾干燥制备益生菌微胶囊固体制剂。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂及其制备方法，旨在解决现有技术油包水乳液包埋益生菌制备微胶囊技术阻止营养物质和代谢产物扩散、不利于益生菌生存，阻止水分传输，无法直接干燥等的技术问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将第一聚合物体系的水溶液和第二聚合物体系的水溶液混合后，所述第一聚合物体系中的聚合物和所述第二聚合物体系中的聚合物对水的持水能力不同，导致水在两种聚合物体系中的分配比不同，即持水性弱的聚合物体系中的水分会向持水性强的聚合物体系中迁移；静置后发生相分离，进而得到不同体积的两相，体积小的相作为分散相，体积较大的相作为连续相；所述第一聚合物体系中包含的水溶性聚合物相对于水的溶度参数与第二聚合物体系中包含的水溶性聚合物相对于水的溶度参数的差的绝对值大于0.5；
(2)将颗粒稳定剂分散于所述连续相中，将拟包埋的益生菌分散于所述分散相中，然后将含有所述益生菌的分散相与分散有所述固体颗粒稳定剂的连续相混合后进行剪切乳化，制备得到包载益生菌的水包水Pickering乳液，该水包水Pickering乳液的内部分散相中含有所述益生菌；
(3)将所述包载益生菌的水包水Pickering乳液进行干燥；或发酵培养后干燥，得到益生菌微胶囊制剂粉末。
优选地，所述第一聚合物体系中包含一种或多种水溶性聚合物，所述第二聚合物体系中包含一种或多种水溶性聚合物，所述第一聚合物体系中的水溶性聚合物和所述第二聚合物体系中的水溶性聚合物各自独立地选自合成大分子聚合物、水溶性天然多糖和水溶性蛋白质；
优选地，所述合成大分子聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯醇或聚氧化乙烯等；所述水溶性天然多糖包括但不限于淀粉、普鲁兰多糖、葡聚糖、壳聚糖、魔芋葡甘聚糖、羟丙甲纤维素、甲基纤维素、糊精、卡拉胶或瓜尔胶等；所述水溶性蛋白质包括但不限于明胶、胶原或酪蛋白等；
所述颗粒稳定剂为水不溶性微纳米颗粒，其为无机纳米粒子、有机纳米粒子和灭活微生物中的一种或多种；其中所述有机纳米粒子为水不溶性多糖纳米粒子、蛋白质纳米粒子和脂质纳米粒子中的一种或多种；所述无机纳米粒子为碳酸钙、二氧化硅、累托石和石墨烯中的一种或多种；所述微生物为灭活的酵母菌。
优选地，所述第一聚合物体系的水溶液中聚合物的质量百分浓度为3％～20％，所述第二聚合物体系的水溶液中聚合物的质量百分浓度为3％～20％；所述第一聚合物体系的水溶液和第二聚合物体系的水溶液的质量比为1:1～1:10；所述固体颗粒稳定剂的质量占所述连续相和所述分散相总质量的0.1％～1.5％。
优选地，步骤(2)所述剪切乳化为机械搅拌剪切乳化、撞击流剪切乳化或微流控剪切乳化；乳化的温度为5～50℃。
优选地，步骤(2)采用的乳化方式为撞击流乳化，将分散有所述颗粒稳定剂的水相连续相通过撞击流导流作用形成两股相向撞击的流体，将分散有所述益生菌的水相分散相加入至所述两股相向撞击的连续相流体在撞击区域产生的湍流区中，利用所述两股相向撞击的流体的剪切作用，在湍流区中发生剪切乳化，制备得到负载益生菌的水包水Pickering乳液。
优选地，步骤(2)所述乳化的方式为微流控乳化，其微流控芯片通道可以为二通道或三通道，通道尺寸为10微米-80微米，流量为100μL/h～12000μL/h。
优选地，步骤(2)中所述分散有所述益生菌的分散相中益生菌的浓度为1×103～1×105个/克。
优选地，所述负载益生菌的水包水Pickering乳液体系的离子强度不大于100mM。
优选地，所述固体颗粒稳定剂表面Zeta电势不大于+10mV，优选其表面Zeta电势为+10mV～-40mV。
优选地，步骤(3)将所述包载益生菌的水包水Pickering乳液发酵培养后干燥，得到益生菌微胶囊制剂粉末；其中，步骤(1)所述水相分散相中还分散有有利于益生菌繁殖的营养物质，具体包括如下步骤：
步骤(2)将颗粒稳定剂分散于所述连续相中，将拟包埋的益生菌和有利于益生菌繁殖的营养物质分散于所述分散相中，然后将分散有益生菌和营养物质的所述分散相与所述分散有固体颗粒稳定剂的连续相混合并进行剪切乳化，制备得到负载益生菌的水包水Pickering乳液，且所述益生菌被包埋于该水包水Pickering乳液的内部分散相中；步骤(3)将含有益生菌和营养物质的水包水Pickering乳液于5～50℃，优选25～37℃发酵培养5h～72h，以进一步提高该乳液中益生菌的负载量。
优选地，步骤(3)所述干燥处理为冷冻干燥或喷雾干燥；得到的益生菌微胶囊制剂粉末中益生菌的含量为1×104-1×1012个/克。
按照本发明的另一个方面，提供了一种基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂，包括壁材和芯材，其中所述芯材包括益生菌和分散相聚合物体系，所述壁材包括连续相聚合物体系和固体颗粒稳定剂；该微胶囊制剂呈球状或近球状；
所述分散相聚合物体系包含一种或多种水溶性聚合物，所述连续相聚合物体系包含一种或多种水溶性聚合物；且所述分散相聚合物体系中水溶性聚合物的水溶液和所述连续相聚合物体系中水溶性聚合物的水溶液互不相容，且所述分散相聚合物体系中包含的水溶性聚合物相对于水的溶度参数与连续相聚合物体系中包含的水溶性聚合物相对于水的溶度参数的差的绝对值大于0.5。
优选地，所述固体颗粒稳定剂在该微胶囊制剂中的质量分数为2％～20％；所述芯材中益生菌的含量为1×104～1×1012个/克；所述芯材中还包括有利于所述益生菌生长繁殖的营养物质，所述营养物质选自包埋益生菌生长所需的营养组分。
优选地，所述分散相聚合物体系中的水溶性聚合物和所述连续相聚合物体系中的水溶性聚合物各自独立地选自合成大分子聚合物、水溶性天然多糖和水溶性蛋白质；
其中所述水溶性合成大分子聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯醇或聚氧化乙烯等；所述水溶性天然多糖包括但不限于淀粉、普鲁兰多糖、葡聚糖、壳聚糖、魔芋葡甘聚糖、羟丙甲纤维素、甲基纤维素、糊精、卡拉胶或瓜尔胶等；所述水溶性蛋白质包括但不限于明胶、胶原或酪蛋白等；
所述颗粒稳定剂为水不溶性微纳米颗粒，其为无机纳米粒子、有机纳米粒子和灭活微生物中的一种或多种；其中所述有机纳米粒子为水不溶性多糖纳米粒子、蛋白质纳米粒子和脂质纳米粒子中的一种或多种；所述无机纳米粒子为碳酸钙、二氧化硅、累托石和石墨烯中的一种或多种；所述微生物为灭活的酵母菌。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明提供的一种基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂的制备方法，将分散有颗粒稳定剂的水相连续相与含有益生菌的水相分散相乳化，制备得到负载益生菌的、稳定的水包水Pickering乳液，此时益生菌在水包水乳液内部，实现对益生菌的包埋。相较于传统的油包水包埋益生菌的乳液，本发明水包水乳液结构有利于营养物质和代谢产物的扩散，也不会阻止水分传输，能够直接对乳液进行干燥，获得益生菌微胶囊制剂。
(2)本发明提供的一种利用水包水Pickering乳液法制备益生菌微胶囊制剂的方法，该方法通过控制机械搅拌速度、撞击流、微流控等乳化方式以及颗粒稳定剂的乳化作用，一步法制备含益生菌的水包水Pickering乳液，由此解决了通过乳液法制备益生菌困难的技术问题。
(3)本发明提供的一种利用水包水Pickering乳液法制备益生菌微胶囊制剂的方法，还可以通过包埋益生菌后进行培养发酵，实现益生菌在乳液内部培养增殖，可以进一步提高益生菌的负载量。
(4)本发明优选实施例中借助于撞击流装置，仅设计两种不同的水相以及颗粒稳定剂，无需其他复杂的添加剂的引入来实现乳液的制备，而且制备过程中对乳化时体系的pH无限制和要求，乳化温度范围较宽，室温即可，该制备方法简单易实现，无需复杂的装置，制备条件温和。其中，撞击流装置中安装在同一个轴上面的两个导流筒内螺旋桨的方向相反，在环状液相膜撞击面提供各方向强劲的剪切力，其力度随射流口直径的减小和流速的增大而增强，能够起到分散乳化功效。通过调控射流口直径和流速，制备得到稳定的水包水Pickering乳液。
(5)本发明利用撞击流、微流控乳化制备水包水Pickering乳液能实现对益生菌的包埋或包埋与发酵培养。通过撞击流、微流控乳化的方式直接生成水包水型乳液，与其它制备水包水乳液的方法相比更为简便快捷。制备得到的乳液粒径范围为5～100微米，且乳液粒径大小可以通过调控两种聚合物水溶液的起始体积比来控制，也可以通过调节流速来控制，因此其乳液大小可调。
(6)本发明制备的含有益生菌的水包水Pickering乳液是由固体颗粒稳定的乳液，不是由传统的乳化剂稳定的乳液，是一种全新的乳液体系。由于颗粒稳定剂的引入，使得传统采用小分子乳化剂制备水包水乳液不能制备或不能稳定制备的问题得以解决。此外，水包水Pickering乳液突破了传统乳液存在油-水界面屏障，有利于乳液在干燥过程中水分的传输，能够直接通过干燥制备益生菌微胶囊固体制剂，更有利于提高益生菌的抗逆性。本发明提供的基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂，其芯材含有益生菌和第一水溶性高分子材料，壁材含有第二水溶性高分子材料，水溶性高分子材料作为壁材，提供了一个全水相的生物相容界面，突破了传统油水乳液体系的界面障碍，在食品、化妆品、医药、生物微反应器和分析测试领域将具有广泛应用前景。
(7)本发明制备的益生菌制剂提高了益生菌的耐受性，其在常温条件下保存六个月后，存活率仍可高达97％以上。
附图说明
图1是本发明基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂的制备方法流程图；
图2本发明实施例中水包水Pickering乳液的典型相图；
图3为实施例14通过微流控法、撞击流法和机械搅拌法制备的水包水Pickering乳液图；
图4为实施例15含乳酸菌和植物乳杆菌的水包水Pickering乳液；
图5为实施例16包埋乳酸菌的水包水Pickering乳液发酵前后的照片；
图6为实施例17包埋乳酸菌的水包水Pickering乳液发酵过程中pH与乳酸菌数量变化与时间的关系图；
图7为本发明实施例中采用的微射流装置示意图；
图8为本发实施例中采用的撞击流装置示意图；
图9为实施例18植物乳杆菌包埋于连续相和分散相的水包水Pickering乳液。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
由于水包水Pickering乳液体系具有生物相容好、隔室化和大分子拥挤效应，水-水界面可以允许乳液内外的物质传输，对于研究益生菌细胞与微胶囊壁材的相互作用以及在囊内细胞的生理特征具有显著优势。构建稳定的水包水乳液体系是益生菌稳定化的前提。使用稳定的水包水Pickering乳液体系包埋益生菌，益生菌是一类具有生命的微生物，在稳定的水-水乳液体系中引入其他物质会打破已建立的能量平衡，影响乳液相行为和稳定性。如何调控其进入乳液液滴内部被包埋是关键。
本发明针对现有乳液技术在益生菌包埋与微胶囊制剂制备困难的技术问题，特别是针对传统油水乳液体系在包埋益生菌时存在油水界面，在乳液干燥过程中油水界面的存在阻碍了水分的迁移，不能通过干燥法制备益生菌微胶囊制剂，提出了一种基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂的制备方法。
发明人在申请号为202011066403.8的发明专利的基础上，对水包水Pickering乳液的制备方法进行重新设计，将分散有颗粒稳定剂的水相连续相与含有益生菌的水相分散相乳化，制备得到负载益生菌的、稳定的水包水Pickering乳液，此时益生菌在水包水乳液内部，实现对益生菌的包埋。
本发明提出的一种基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
(1)将第一聚合物体系的水溶液和第二聚合物体系的水溶液混合后，所述第一聚合物体系中的聚合物和所述第二聚合物体系中的聚合物对水的持水能力不同，导致水在两种聚合物体系中的分配比不同，即持水性弱的聚合物体系中的水分会向持水性强的聚合物体系中迁移；静置使其相分离，得到不同体积的两相，将其中体积大的相作为连续相，体积小的相作为分散相；所述第一聚合物体系包含一种或多种水溶性聚合物，所述第二聚合物体系包含一种或多种水溶性聚合物；所述第一聚合物体系中包含的水溶性聚合物相对于水的溶度参数与第二聚合物体系中包含的水溶性聚合物相对于水的溶度参数的差的绝对值大于0.5；
(2)将颗粒稳定剂分散于所述连续相中，将拟包埋的益生菌分散于所述分散相中，然后将分散有所述益生菌的分散相与分散有所述颗粒稳定剂的连续相混合并进行剪切乳化，制备得到负载益生菌的水包水Pickering乳液，且所述益生菌被包埋于该水包水Pickering乳液的内部分散相中；
(3)将所述负载益生菌的水包水Pickering乳液进行干燥或发酵培养后干燥，得到益生菌微胶囊制剂粉末。
本发明提供的水包水Pickering乳液的制备方法理论上适用于任意互不相容、能够用于制备水包水乳液的两种水相，即水相分散相和水相连续相。根据Flory-Huggins高分子溶液理论，Huggins常数χ1，又叫做高分子-溶剂相互作用参数，是表征溶剂分子与高分子相互作用程度大小的量(溶剂化程度)，数值在-1到1之间，χ1<1/2，是良溶剂；χ1>1/2是不良溶剂。溶度参数(solubility parameter)是表征聚合物-溶剂相互作用的参数，其中溶剂为水。物质的内聚性质可由内聚能予以定量表征，单位体积的内聚能称为内聚能密度，其平方根称为溶度参数。溶度参数可以作为衡量两种材料是否共容的一个较好的指标。当两种材料的溶度参数相近时，它们可以互相共混且具有良好的共容性。
将本发明水相连续相和水相分散相中的一种作为溶质高分子，将另一种作为溶剂，当二者的溶度参数愈接近，两者愈能相互溶解。而本发明的连续相和分散相分别为两种聚合物的水溶液，所以本发明采用的两水溶液体系中聚合物相对于水的溶度参数愈接近，两者愈能相互溶解。而本发明制备水包水乳液的基础是能够发生相分离的连续相和分散相，因此根据上述高分子溶液理论，本发明制备水包水Pickering乳液采用的两体系中的聚合物用溶度参数表示时，该两种体系中聚合物相对于水的溶度参数之差的绝对值要大于0.5。本发明采用的部分水溶性聚合物的溶度参数可以通过查表得到，有的可按照理论参数初步计算，或通过常规方法测量得到。
本发明制备水包水Pickering乳液时，选择聚合物种类使得第一聚合物体系中采用的水溶性聚合物相对于水的溶度参数与第二聚合物体系中采用的水溶性聚合物相对于水的溶度参数的差的绝对值大于0.5，获得能够发生相分离的水相分散相和水相连续相。
本发明一些实施例中，将第一聚合物体系的水溶液和第二聚合物体系的水溶液混合后，静置使其相分离，得到不同体积的两相。另一些实施例中，根据两两水溶性聚合物的种类，通过实验测试做出两种水溶性聚合物体系的相图，即两种聚合物体系水溶液中聚合物的浓度与其相分离状态(均一相或双水相)的关系图。根据相图获得相分离区域，确定能够出现分相行为的两种水溶性聚合物体系的浓度，根据混合后两相浓度的大小，结合测得的相图确定连续相和分散相。如图2所示，为本发明水包水乳液的典型相图。相图中的双节线DCE将其分成了两个区域：均一相和双水相。在双节线DCE上方，即两种聚合物高分子溶液混合后会形成互不相溶的两相，这种情况下才能得到水包水乳液。此时两种水溶性聚合物的浓度是形成乳液的分散相和连续相的关键。在混合体系中，依托两相混合后浓度的大小来决定谁作为分散相谁作为连续相。当分散相(D)的浓度等于连续相(C)的浓度时，如图C，C’，C”连线所示，此时乳液会形成双连续相乳液，无分散相和连续相存在。该相图的作用一是可以确定两种聚合物体系高分子能发生相分离和形成乳液的浓度区间；二是能确定形成乳液后，哪一种是分散相，哪一种是连续相。
一些实施例中，所述第一聚合物体系的水溶液中聚合物的质量百分浓度为3％～20％，所述第二聚合物体系水溶液中聚合物的质量百分浓度为3％～20％；所述第一聚合物体系的水溶液和第二聚合物体系的水溶液的质量比为1:1～1:10。
本发明所述第一聚合物体系包含一种或多种水溶性聚合物，所述第二聚合物体系包含一种或多种水溶性聚合物，所述水溶性聚合物，其水溶性为广义上水溶性的含义，水溶性聚合物包括在水中溶解较快的聚合物，也包括溶解速度较慢的水溶胀聚合物；且所述第一聚合物体系中采用的水溶性聚合物与所述第二聚合物体系中采用的水溶性聚合物相对于水的溶度参数的差的绝对值要大于0.5。当第一聚合物体系或第二聚合物体系包含多种聚合物时，两体系中水溶性聚合物相对于水的溶度参数可以按各聚合物在第一聚合物体系或第二聚合物体系中所占的摩尔百分数与相应的溶度参数的积的总和来确定。
本发明所述的水溶性聚合物，可以指相对分子质量在几千到几百万的水溶性高分子。一些实施例中，所述聚合物选自水溶性合成大分子聚合物、水溶性天然多糖和水溶性蛋白质。其中所述水溶性合成大分子聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯醇或聚氧化乙烯等；所述水溶性天然多糖包括但不限于淀粉、普鲁兰多糖、葡聚糖、壳聚糖、魔芋葡甘聚糖、羟丙甲纤维素、甲基纤维素、糊精、卡拉胶或瓜尔胶等；所述水溶性蛋白质包括但不限于明胶、胶原或酪蛋白等。
一些优选实施例中，第一聚合物体系中选取的聚合物为聚乙二醇、聚氧化乙烯、淀粉、魔芋葡甘聚糖、卡拉胶、瓜尔胶、壳聚糖中的一种或多种；第二聚合物体系中选取的聚合物为普鲁兰多糖、葡聚糖、明胶、胶原、羟丙甲纤维素、酪蛋白中的一种或多种。
本发明选择聚合物种类使得第一聚合物体系中采用的水溶性聚合物相对于水的溶度参数与第二聚合物体系中采用的水溶性聚合物相对于水的溶度参数的差的绝对值大于0.5，实验中也尝试采用相同方法对均来自第一聚合物体系的两种聚合物水溶液进行混合，或对均来自第二聚合物体系的两种聚合物水溶液进行混合(此时不满足溶度参数差绝对值大于0.5)，以进行水包水乳液的制备，但是发现并不能获得稳定的水包水Pickering乳液。
水包水乳液体系具有极低表面张力(10-6N/m)和较大界面厚度(几十纳米到几百纳米)，对合成类表面活性剂有很高的要求，但由于合成的表面活性剂都是小分子，其分子尺寸远远小于水-水界面厚度，不能横跨界面而起到稳定的作用。固体颗粒相比于表面活性剂，其尺寸远大于表面活性剂，能起到稳定的作用，所形成的乳液为Pickering乳液，不是传统的由表面活性剂稳定的乳液。本发明颗粒稳定剂的作用相当于传统乳液制备时采用的乳化剂。所述颗粒稳定剂的质量百分数为0.1％～1.5％，优选为0.5％～0.9％，其为颗粒稳定剂占连续相和分散相的总质量的质量百分数。
能够起到乳化稳定作用的水不溶性固体颗粒稳定剂理论上均可满足本发明的制备需求。该固体颗粒稳定剂可以为粒径范围在5纳米～20微米之间的固体颗粒稳定剂，也可以为直径在5纳米～5微米之间的纤维状的固体颗粒稳定剂。
一些实施例中，所述固体颗粒稳定剂为水不溶性微纳米颗粒，其为无机纳米粒子、有机纳米粒子和微生物中的一种或多种。所述有机纳米粒子包括但不限于水不溶性多糖纳米粒子、蛋白质纳米粒子和脂质纳米粒子中的一种或多种；比如纤维素固体颗粒、多糖/蛋白复合固体颗粒(比如纤维素/大豆分离蛋白固体颗粒复合物)，这里多糖/蛋白复合固体颗粒表示多糖和蛋白质通过物理或化学改性形成的水不溶性复合物。所述无机纳米粒子包括但不限于为碳酸钙、二氧化硅、累托石和石墨烯(比如石墨烯纳米片)中的一种或多种；所述微生物包括但不限于为灭活的酵母菌等微生物。
本发明益生菌微胶囊制剂的制备方法，适用于各种益生菌的包埋制备。比如一些实施例中，所述益生菌为双歧杆菌族：青春双歧杆菌(Bifidobacterium.youth)、长双歧杆菌(Bifidobacterium.longum)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium.infantis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium.bifidum)；乳酸杆菌族：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus.acidophilus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus.bulgaricus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus.casei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus.fermentum)、胚芽乳杆菌(Lactobacillus.embryo)、短乳杆菌(Lactobacillus.short)、纤维二糖乳杆菌(Lactobacillus cellobiose)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)；链球菌族：粪链球菌(Streptococcus.faecium)、嗜热唾液链球菌(Streptococcus.salivarius)、乳酸乳球菌(Lactococcus.Lactis)、乳链球菌(Streptococcus.lactis)；其他：大肠杆菌属Nissle 1917(E.coli spp.Nissle1917)、明串珠菌属(Leuconostocspp)、足球菌属(Bacillus spp)、丙酸杆菌属(Propionibacteriumspp)、芽孢杆菌属(Bacillus spp)等。
在包埋益生菌发酵过程中，会添加营养物质或矿物质盐组分，该类物质的加入会引起乳液体系的离子强度会变化。一些实施例中，为了提高制得的水包水Pickering乳液体系的稳定性，控制所述负载益生菌的水包水Pickering乳液的离子强度不大于100mM，优选控制在40mM～80mM以内，pH值控制在3.0-8.0，以使得乳液稳定效果更佳。
为了实现包埋的目的，将益生菌稳定于乳液内部分散相中是关键。当两种聚合物水溶液混合后发生相分离制备分散相和连续相时，分散相中聚合物溶液的浓度比初始浓度要高(两种高分子的持水能力的差异，会使分散相中的水会向连续相体系中迁移)，粘度变大，将益生菌分散于该分散相体系时，体系的高粘度会阻碍益生菌的运动。当将含益生菌的分散相加到连续相中乳化时，连续相中的固体颗粒会向水-水界面移动，促进水包水乳液的稳定形成。固体颗粒稳定剂在水-水或液-液界面上的吸附是非可逆的，稳定乳液的能力更强，使得水包水乳液的稳定成为可能。
本发明采用的固体颗粒稳定剂可以带正电荷，也可以带负电荷，益生菌表面一般带有一定的正电荷，优选实施例中，选择采用带负电荷的固体颗粒稳定剂或者带正电荷的固体颗粒稳定剂，且其Zeta电势不大于10mV。固体颗粒稳定剂在水-水界面与益生菌的静电相互作用会进一步提高水包水乳液的稳定性，此外，固体颗粒稳定剂的存在也阻止了益生菌从分散相迁移到连续相现象的发生。
一些实施例中，当所述水包水乳液体系由两种多糖水溶液(即水相连续相和水相分散相溶质均为多糖，所用到的多糖水溶液一般带负电荷)，固体颗粒稳定剂优选表面电势为负的颗粒稳定剂，以使固体颗粒稳定剂在水-水界面的排列分布更有利于水包水Pickering乳液的稳定性。当所述水包水乳液体系由蛋白质和多糖水溶液构成时(所用到的蛋白质一般带正电荷，所用到的多糖一般带负电荷)，并且蛋白质水溶液构成水包水乳液体系的连续相时，蛋白质水溶液带正电，固体颗粒稳定剂不宜带较强的负电荷(比如表面电势小于-40mV)，否则连续相中蛋白质与固体颗粒稳定剂之间存在的较强相互作用可能影响其在水-水界面的分布。本发明优选实施例中采用的固体颗粒稳定剂其表面电势小于等于+10mV，更佳为介于+10mV到-40mV之间。
采用本发明的制备方法制备益生菌微胶囊制剂时，将益生菌包埋负载于水包水乳液的内相分散相中，并实现益生菌在该内相分散相中的培养增殖是有必要的。
传统的水包水乳液通过借助于制备装置的改进促进二者的乳化，然而仍然属于使用小分子乳化剂的水包水乳液制备方法，制备得到的水包水乳液不稳定，而本发明提供了一种全新的水包水Pickering乳液，本发明实施例中可以制备得到粒径范围为5～100微米的水包水Pickering乳液。本发明提供的水包水Pickering乳液是一种全新的乳液体系，将传统的小分子乳化剂改进为固体颗粒稳定剂作为乳化剂，
本发明一些实施例中，步骤(2)所述剪切乳化可以为机械搅拌剪切乳化、撞击流剪切乳化或微流控剪切乳化等；乳化的温度为5～50℃，优选为25～37℃。
一些实施例中，步骤(2)采用的乳化方式为机械搅拌，其搅拌速率为200rpm～800rpm。
一些实施例中，步骤(2)采用的乳化方式为撞击流乳化，将分散有所述颗粒稳定剂的水相连续相通过撞击流导流作用形成两股相向撞击的流体，将分散有所述益生菌的水相分散相加入至所述两股相向撞击的连续相流体在撞击区域产生的湍流区中，利用所述两股相向撞击的流体的剪切作用，在湍流区中发生剪切乳化，制备得到负载益生菌的水包水Pickering乳液。
本发明将含有益生菌的水相分散相引入至两股相互撞击的含有颗粒稳定剂的连续相流体的撞击端面中发生剪切乳化形成水包水Pickering乳液，这里水相分散相的引入方式可以有多种。比如一些实施例中，所述含有益生菌的水相分散相通过导管滴加至所述两股相向撞击的流体在撞击区域产生的湍流区中。
一些实施例中，为了增强乳化效果，所述撞击流装置中包含两个同轴且相对设置的导流筒，利用两个导流筒的导流作用产生两股相向撞击的流体，该两个导流筒内分别设置有用于控制流体运动方向的螺旋桨，两个导流筒内设置的螺旋桨其旋转方向相反。
一些实施例中，所述撞击流装置为双喷头撞击流装置，其射流口直径为0.1～5.0毫米，优选0.2～3.0毫米；撞击喷嘴也即射流口喷出液体的流速为0.5-20.0m/s，优选1.0～10.0m/s。
一些实施例中，步骤(2)所述乳化的方式为微流控乳化，其微流控芯片通道可以为二通道或三通道，通道尺寸为10微米～80微米，流量为100μL/h～12000μL/h。
不同的剪切乳化方式乳化得到的包载益生菌的水包水乳液的稳定性可能存在一定的差别，比如相同条件下，采用机械搅拌乳化方式制备含益生菌的水包水Pickering乳液时，搅拌速率控制为200rpm～800rpm，得到乳液液滴的粒径在10～15微米范围，所制备的乳液在10小时内较稳定；而采用上述撞击流剪切乳化方式时，得到乳液液滴粒径在3～5微米范围，所制备的乳液能够稳定一个月以上。
本发明制备益生菌微胶囊制剂粉末时，可以将制备得到的包载了益生菌的水包水Pickering乳液直接进行干燥获得微胶囊制剂粉末，也可以将包载了益生菌的水包水Pickering乳液先在合适的温度下进行发酵培养，提高益生菌的负载量后再进行干燥得到益生菌微胶囊制剂粉末。相比较而言，直接进行干燥对于乳液稳定性的要求要低于先对乳液进行发酵再进行干燥后的乳液稳定性，实际应用时可根据应用需求选择合适的剪切乳化方法。
一些实施例中，步骤(3)将所述包载益生菌的水包水Pickering乳液发酵培养后干燥，得到益生菌微胶囊制剂粉末；其中，步骤(1)所述水相分散相中还分散有有利于益生菌繁殖的营养物质，具体包括如下步骤：步骤(2)将颗粒稳定剂分散于所述连续相中，将拟包埋的益生菌和有利于益生菌繁殖的营养物质分散于所述分散相中，然后将分散有益生菌和营养物质的所述分散相加入到所述连续相中进行剪切乳化，制备得到负载益生菌的水包水Pickering乳液，且所述益生菌被包埋于该水包水Pickering乳液的内部分散相中；步骤(3)将含有益生菌和营养物质的水包水Pickering乳液于5～50℃，优选25～37℃发酵培养5h～72h，以进一步提高该乳液中益生菌的负载量。
采用撞击流剪切乳化方式制备得到的水包水Pickering乳液稳定性更佳，有利于乳液发酵后在干燥制备益生菌微胶囊制剂粉末。因此，一些优选实施例中，采用撞击流剪切乳化方式得到的负载益生菌的水包水Pickering乳液，先进行发酵培养，然后再干燥获得益生菌微胶囊制剂粉末。
本发明一些实施例中，制备得到的负载有益生菌的水包水Pickering乳液中菌落总数为1×102～1×106个/克，培养发酵后可达到1×104～1×1012个/克。
本发明水包水Pickering乳液的制备中采用的撞击流装置可以为现有技术通常采用的撞击流反应器、撞击流乳化装置等设备，比如可以采用常规的双喷头撞击流装置，只要是能够通过该装置内部构件的导流作用将本发明分散有颗粒稳定剂的连续相形成两股相向撞击的流体、并在撞击液面处形成湍流区的撞击流装置均可适用。
本发明采用机械搅拌剪切乳化方式时，可采用常规的搅拌反应釜。
本发明一些实施例中，利用微流控芯片实现对益生菌的包埋。该制备过程可以事先将两种水溶性高分子水溶液混合后，静置使其相分离得到不同体积的两相，体积多的作为连续相，体积少的作为分散相，也根据混合后两相浓度大小和相图确定连续相和分散相。将颗粒稳定剂分散于连续相中，将益生菌分散于水相分散相中。通过三通道微流控芯片设备中的内相入口注入分散有益生菌的分散相，外相入口注入分散有颗粒稳定剂的连续相，高精度注射器泵用于从1mL注射器中驱动液体进入微流控装置，在下游连接处形成粒径大小分布均一的乳状液滴，从而达到利用微流控芯片实现水包水Pickering乳液对益生菌包埋的目标。
本发明还提供了基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂，其过程是将上述制备的含益生菌的水包水Pickering乳液干燥后，可以得到含益生菌的微胶囊固体制剂。该微胶囊结构包括壁材和芯材，其中所述芯材包括益生菌和分散相聚合物体系；所述壁材包括连续相聚合物体系和固体颗粒稳定剂；该微胶囊制剂呈球状或近球状。所述分散相聚合物体系包含一种或多种水溶性聚合物，所述连续相聚合物体系包含一种或多种水溶性聚合物；且所述分散相聚合物体系中水溶性聚合物的水溶液和所述连续相聚合物体系中水溶性聚合物的水溶液互不相容。所述分散相聚合物体系中包含的水溶性聚合物相对于水的溶度参数与连续相聚合物体系中包含的水溶性聚合物相对于水的溶度参数的差的绝对值大于0.5。
所述水溶性聚合物可选自合成大分子聚合物、水溶性天然多糖和水溶性蛋白质。其中所述水溶性合成大分子聚合物包括但不限于聚乙二醇、聚乙烯醇或聚氧化乙烯等；所述水溶性天然多糖包括但不限于淀粉、普鲁兰多糖、葡聚糖、壳聚糖、魔芋葡甘聚糖、羟丙甲纤维素、甲基纤维素、糊精、卡拉胶或瓜尔胶等；所述水溶性蛋白质包括但不限于明胶、胶原或酪蛋白等。所述固体颗粒稳定剂为水不溶性微纳米颗粒，其为无机纳米粒子、有机纳米粒子和微生物中的一种或多种。
一些实施例中，所述连续相聚合物体系中水溶性聚合物的质量与所述分散相聚合物体系中水溶性聚合物的质量之比为0.01～70:1。所述固体颗粒稳定剂在该微胶囊制剂中的质量分数为2％～20％。所述芯材中益生菌的含量为1×104～1×1012个/克。所述芯材中还包括有利于所述益生菌生长繁殖的营养物质，所述营养物质选自包埋益生菌生长所需的营养组分。
本发明一些实施例中，采用的益生菌为植物乳杆菌或凝结芽孢杆菌。培养植物乳杆菌采用的营养物质为MRS培养基，其具体成分为：1％蛋白胨、0.5％牛肉浸粉、0.4％酵母浸粉、2％葡萄糖、0.2％磷酸氢二钾、0.2％柠檬酸三铵、0.5％醋酸钠、0.02％硫酸镁、0.005％硫酸锰、0.1％吐温80。培养凝结芽孢杆菌采用的营养物质为1％氯化钠、1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％葡萄糖。
以下为具体实施例：
实施例1
分别称取3克的葡聚糖(分子量为500000Da,溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)，和5克的聚乙二醇(分子量为88000Da，溶度参数为9.38(Cal/cm3)0.5)，分别溶解于100克纯水中配制质量分数分别为3％的葡聚糖水溶液A(Zeta电势为-11mV)和5％聚乙二醇水溶液B(Zeta电势为-17mV)。按照葡聚糖水溶液和聚乙二醇水溶液的质量比为1:1取上述溶液混合，静置后，使其分相。聚乙二醇体系中的水会迁移到葡聚糖体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为富聚乙二醇相，连续相为富葡聚糖相。添加质量分数为0.1％纤维素固体颗粒(以连续相和分散相构成的聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.1克纤维素固体颗粒，纤维素固体颗粒的Zeta电势为-30mV)分散于连续相中，将植物乳杆菌(典藏号CICC 6240)和1％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1.0克培养基)的水相分散相(植物乳杆菌含量为102个/克)在机械搅拌的条件下加入到连续相中，一步法生成稳定的含有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液(乳化条件：温度5℃、搅拌速率200rpm)。乳液的离子强度为25mM，乳液的pH为8.0。将制备的包埋有植物乳杆菌亚种CICC 6240的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养5h，动态培养5h后乳液的pH为5.6，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有植物乳杆菌、MRS培养基以及聚乙二醇，壁材含有葡聚糖和纤维素固体颗粒，益生菌的含量为1×104个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达95.6％。
实施例2
分别称取3克的葡聚糖(分子量为500000Da,溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)和10克聚乙二醇(分子量为88000Da，溶度参数为9.38(Cal/cm3)0.5)和，配制质量分数为3％的葡聚糖水溶液A(Zeta电势为-11mV)和质量分数为10％聚乙二醇水溶液B(Zeta电势为-18mV)，按照葡聚糖水溶液和聚乙二醇水溶液的质量比为1:4取上述溶液混合，静置后，使其分相。聚乙二醇体系中的水会迁移到葡聚糖体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为富聚乙二醇相，连续相为富葡聚糖相。添加质量分数为0.70％纤维素固体颗粒(以连续相和分散相构成的聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.7克纤维素固体颗粒，纤维素固体颗粒的Zeta电势为-32mV)分散于连续相中，将含有植物乳杆菌(典藏号CICC 6240)和1％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1.0克培养基)的水相分散相(植物乳杆菌含量为106个/克)在机械搅拌的条件下加入到连续相中，一步法生成稳定的含有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液(乳化条件：温度25℃、搅拌速率400rpm)。乳液的离子强度为45mM，乳液的pH为6.2。将得到的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养10h，动态培养10h后乳液的pH为3.9，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有植物乳杆菌、MRS培养基以及聚乙二醇，壁材含有葡聚糖和纤维素固体颗粒，益生菌的含量为1×1010个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达96.8％。
实施例3
分别称取3克的葡聚糖(分子量为500000Da,溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)和10克的聚乙二醇(分子量为88000Da，溶度参数为9.38(Cal/cm3)0.5)，配制质量分数为3％的葡聚糖水溶液A(Zeta电势为-11mV)和质量分数10％聚乙二醇水溶液B(Zeta电势为-18mV)，按照葡聚糖水溶液和聚乙二醇水溶液的质量比为1：4取上述溶液混合，静置后，使其分相。聚乙二醇体系中的水会迁移到葡聚糖体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为富聚乙二醇相，连续相为富葡聚糖相。添加质量分数为0.7％纤维素固体颗粒(以连续相和分散相构成的聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.7克纤维素固体颗粒，Zeta电势为-32mV)分散于连续相中，将含有植物乳杆菌(典藏号CICC 6240)和2％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入2.0克培养基)的水相分散相(植物乳杆菌含量为104个/克)在机械搅拌的条件下加入到分散相中，一步法生成稳定的含有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液(乳化条件：温度25℃、搅拌速率800rpm)。乳液的离子强度为70mM，乳液的pH为6.3。将得到的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养72h，动态培养72h后乳液的pH为3.0，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有植物乳杆菌、MRS培养基以及聚乙二醇，壁材含有葡聚糖和纤维素固体颗粒，益生菌的含量为1×109个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达96.6％。
实施例4
分别称取3克的葡聚糖(分子量为500000Da,溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)和20克的聚乙二醇(分子量为88000Da，溶度参数为9.38(Cal/cm3)0.5)，配制质量分数分别为3％的葡聚糖水溶液A(Zeta电势为-11mV)和20％聚乙二醇水溶液B(Zeta电势为-21mV)，按照葡聚糖水溶液和聚乙二醇水溶液的质量比为1：10取上述溶液混合，静置后，使其分相。葡聚糖体系中的水会迁移到聚乙二醇体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为富葡聚糖相，连续相为富聚乙二醇相。添加质量分数为1.5％纤维素固体颗粒(以连续相和分散相构成的聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入1.5克纤维素固体颗粒，Zeta电势为-35mV)分散于连续相中，将含有植物乳杆菌(典藏号CICC 6240)和1.3％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1.3克培养基)的水相分散相(植物乳杆菌含量为106个/克)在机械搅拌的条件下加入到连续相中，一步法生成稳定的含有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液(乳化条件：温度25℃、搅拌速率800rpm)。乳液的离子强度为64mM，乳液的pH为6.3。将得到的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养10h，动态培养10h后乳液的pH为3.8，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有植物乳杆菌、MRS培养基以及聚乙二醇，壁材含有葡聚糖和纤维素固体颗粒，益生菌的含量为1×1011个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达97.5％。
实施例5
分别称取质量为3克的葡聚糖(分子量为500000Da,溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)和20克的聚乙二醇(分子量为88000Da，溶度参数为9.38(Cal/cm3)0.5)，配制质量分数分别为3％的葡聚糖水溶液A(Zeta电势为-11mV)和20％聚乙二醇水溶液B(Zeta电势为-21mV)，按照葡聚糖水溶液和聚乙二醇水溶液的质量比为1：10取上述溶液混合，静置后，使其分相。葡聚糖体系中的水会迁移到聚乙二醇体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为富葡聚糖相，连续相为富聚乙二醇相。添加质量分数为0.70％纤维素固体颗粒(以连续相和分散相构成的聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.7克纤维素固体颗粒，Zeta电势为-32mV)分散于连续相中，将含有凝结芽孢杆菌(典藏号CGMCC 1.10823)和2％培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入2.0克培养基。)的水相分散相(凝结芽孢杆菌的含量为106个/克)在机械搅拌的条件下加入到连续相中，一步法生成稳定的含有凝结芽孢杆菌的水包水Pickering乳液(乳化条件：温度50℃、搅拌速率800rpm)。乳液的离子强度为100mM，乳液的pH为6.7。将得到的包埋有凝结芽孢杆菌的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养72h，动态培养72h后乳液的pH为3.2，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有凝结芽孢杆菌、培养基以及聚乙二醇，壁材含有葡聚糖和纤维素固体颗粒，益生菌的含量为1×1010个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达98.3％。
实施例6
分别称取3克的羟丙甲纤维素(分子量为80000Da，溶度参数为18.3(Cal/cm3)0.5)和5克的葡聚糖(分子量为500000Da，溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)，配制质量分数分别为3％羟丙甲纤维素水溶液A(Zeta电势为-5mV)和5％的葡聚糖水溶液B(Zeta电势为-12mV)，按照羟丙甲纤维素水溶液和葡聚糖水溶液的质量比为1:1取上述溶液混合，静置后，使其分相。葡聚糖体系中的水会迁移到羟丙甲纤维素体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为富葡聚糖相，连续相为富羟丙甲纤维素相。将连续相置于撞击流装置中，添加质量分数为0.1％纤维素/大豆分离蛋白固体颗粒(以连续相和分散相构成的聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.1克纤维素/大豆分离蛋白固体颗粒，Zeta电势为-23mV)复合物分散于连续相中，分散有上述颗粒稳定剂的水相连续相通过撞击流装置内部构件的导流作用形成两股相向撞击的流体，将含有植物乳杆菌(典藏号CICC 6240)和1％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1.0克培养基)的水相分散相(植物乳杆菌含量为104个/克)加入至两股相向撞击的流体在撞击区域产生的湍流区中，利用撞击流的剪切作用，控制撞击流装置的射流口直径为0.1mm，撞击喷嘴喷出液体的流速为0.5m/s，在5℃的温度下，一步法生成稳定的含有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液。所得到的水包水Pickering乳液的粒径为：87±9微米，乳化指数89％(常温放置40天后)。乳液的离子强度为81mM，乳液的pH为6.3。将得到的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养10h，动态培养10h后乳液的pH为3.9，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有植物乳杆菌、MRS培养基以及葡聚糖，壁材含有羟丙甲纤维素和纤维素/大豆分离蛋白固体颗粒复合物，益生菌的含量为1×108个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达97.4％。
实施例7
分别称取3克的羟丙甲纤维素(分子量为80000Da，溶度参数为18.3(Cal/cm3)0.5)和10克的葡聚糖(分子量为500000Da，溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)，配制质量分数分别为3％羟丙甲纤维素水溶液A(Zeta电势为-5mV)和10％的葡聚糖水溶液B(Zeta电势为-15mV)，按照羟丙甲纤维素水溶液和葡聚糖水溶液的质量比为1:5取上述溶液混合，静置后，使其分相。羟丙甲纤维素体系中的水会迁移到葡聚糖体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为富羟丙甲纤维素相，连续相为富葡聚糖相。将连续相置于撞击流装置中，添加质量分数为0.70％纤维素固体颗粒(以连续相和分散相构成的聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.7克纤维素固体颗粒，Zeta电势为-32mV)分散于连续相中，分散有该颗粒稳定剂的水相连续相通过撞击流装置内部构件的导流作用形成两股相向撞击的流体，将含有植物乳杆菌(典藏号CICC6240)和1％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1.0克培养基)的水相分散相(植物乳杆菌含量为106个/克)加入至两股相向撞击的流体在撞击区域产生的湍流区中，利用撞击流的剪切作用，控制撞击流装置的射流口直径为0.2mm，撞击喷嘴喷出液体的流速为1.2m/s，在25℃的温度下，一步法生成稳定的含有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液。所得到的水包水Pickering乳液的粒径为：43±6微米，乳化指数93％(常温放置40天后)。乳液的离子强度为45mM，乳液的pH为6.3。将得到的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养10h，动态培养10h后乳液的pH为3.7，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有植物乳杆菌、MRS培养基以及葡聚糖，壁材含有羟丙甲纤维素和纤维素固体颗粒，益生菌的含量为1×1012个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达97.9％。
实施例8
分别称取3克的羟丙甲纤维素(分子量为80000Da，溶度参数为18.3(Cal/cm3)0.5)和20克的葡聚糖(分子量为500000Da，溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5，配制质量分数分别为3％羟丙甲纤维素水溶液A(Zeta电势为-5mV)，和20％的葡聚糖水溶液B(Zeta电势为-17mV)，按照羟丙甲纤维素水溶液和葡聚糖水溶液的质量比为1:10取上述溶液混合，静置后，使其分相。羟丙甲纤维素体系中的水会迁移到葡聚糖体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为富羟丙甲纤维素相，连续相为富葡聚糖相。将连续相置于撞击流装置中，添加质量分数为1.50％纤维素固体颗粒(以连续相和分散相构成的聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入1.5克纤维素固体颗粒，Zeta电势为-35mV)分散于连续相中，分散有该颗粒稳定剂的水相连续相通过撞击流装置内部构件的导流作用形成两股相向撞击的流体，将含有凝结芽孢杆菌(典藏号CGMCC 1.10823)和1％培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1.0克培养基。)的水相分散相(凝结芽孢杆菌的含量为106个/克)加入至两股相向撞击的流体在撞击区域产生的湍流区中，利用撞击流的剪切作用，控制撞击流装置的射流口直径为5.0毫米，撞击喷嘴喷出液体的流速为10m/s，在50℃的温度下，一步法生成稳定含有凝结芽孢杆菌的水包水Pickering乳液。乳液的离子强度为80mM，乳液的pH为6.8。所得到的水包水Pickering乳液乳液的粒径为：20±5微米，乳化指数96％(常温放置40天后)。将得到的包埋有凝结芽孢杆菌的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养72h，动态培养72h后乳液的pH为3.2，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有凝结芽孢杆菌、培养基以及葡聚糖，壁材含有羟丙甲纤维素和纤维素固体颗粒，益生菌的含量为1×1010个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达98.2％。
实施例9
分别称取3克羟丙甲纤维素(分子量为120000Da，溶度参数为20.3(Cal/cm3)0.5)和3克麦芽糊精(分子量为3000Da，溶度参数为25.1(Cal/cm3)0.5)，配制质量分数分别为3％羟丙甲纤维素水溶液A(Zeta电势为-5mV)，和3％的麦芽糊精水溶液B(Zeta电势为-9mV)，按照羟丙甲纤维素水溶液和葡聚糖水溶液的质量比为1:1取上述溶液混合，静置后，使其分相。麦芽糊精体系中的水会迁移到羟丙甲纤维素体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为富麦芽糊精相，连续相为富羟丙甲纤维素相。添加质量分数为0.10％纤维素固体颗粒(以连续相和分散相构成的聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.1克纤维素固体颗粒，Zeta电势为-30mV)分散于连续相中，将含有植物乳杆菌(典藏号CICC6240)和1％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1.0克培养基)分散于分散相(植物乳杆菌含量为106个/克)中，通过注射泵以流速100μL/h将含有纤维素固体颗粒的连续相和含有植物乳杆菌和培养基的分散相通过微流控注射通道分别缓慢注入微流控面板中。从液滴提取组件的连接管中收集乳液，即形成单分散的粒径均一的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液。乳液的离子强度为45mM，乳液的pH为6.3。将收集的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养5h，动态培养5h乳液的pH为5.8，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有植物乳杆菌、培养基以及麦芽糊精，壁材含有羟丙甲纤维素和纤维素固体颗粒，益生菌的含量为1×107个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达97.3％。
实施例10
分别称取3克羟丙基纤维素(分子量为120000Da，溶度参数为20.3(Cal/cm3)0.5)和20克麦芽糊精(分子量为3000Da，溶度参数为25.1(Cal/cm3)0.5)，配制质量分数分别为3％羟丙基纤维素水溶液A(Zeta电势为-5mV)，和20％的麦芽糊精水溶液B(Zeta电势为-13mV)，按照羟丙甲纤维素水溶液和麦芽糊精水溶液的质量比为1：10取上述溶液混合，静置后，使其分相。麦芽糊精体系中的水会迁移到羟丙甲纤维素体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为富麦芽糊精相，连续相为富羟丙甲纤维素相。添加质量分数为0.70％纤维素固体颗粒(以连续相和分散相构成的聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.7克纤维素固体颗粒，Zeta电势为-32mV)分散于连续相中，将植物乳杆菌(典藏号CICC6240)和1％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1.0克培养基)分散于分散相(植物乳杆菌含量为102个/克)分散于分散相中，通过注射泵以流速2000μL/h将含有纤维素固体颗粒的连续相和含有植物乳杆菌和培养基的分散相通过微流控注射通道分别缓慢注入微流控面板中，从液滴提取组件的连接管中收集乳液，即形成单分散的粒径均一的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液。乳液的离子强度为45mM，乳液的pH为6.4。将收集的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养72h，动态培养72h乳液的pH为3.2，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有植物乳杆菌、培养基以及麦芽糊精，壁材含有羟丙甲纤维素和纤维素固体颗粒，益生菌的含量为1×104个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达97.8％。
实施例11
分别称取3克羟丙甲纤维素(分子量为120000Da，溶度参数为20.3(Cal/cm3)0.5)和10克麦芽糊精(分子量为3000Da，溶度参数为25.1(Cal/cm3)0.5)，配制质量分数分别为3％羟丙甲纤维素水溶液A(Zeta电势为-5mV)，和10％的麦芽糊精水溶液B(Zeta电势为-11mV)，按照羟丙甲纤维素水溶液和麦芽糊精水溶液的质量比为1：5取上述溶液混合，静置后，使其分相。麦芽糊精体系中的水会迁移到羟丙甲纤维素体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为富麦芽糊精相，连续相为富羟丙甲纤维素相。添加质量分数为1.50％纤维素固体颗粒(以连续相和分散相构成的混合聚合物体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入1.5克纤维素固体颗粒，Zeta电势为-35mV)分散于连续相中，将植物乳杆菌(典藏号CICC6240)和1％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1克培养基)分散于分散相(植物乳杆菌含量为106个/克)中，通过注射泵以流速12000μL/h将含有纤维素固体颗粒的连续相和含有植物乳杆菌亚种和培养基的分散相通过微流控注射通道分别缓慢注入微流控面板中，从液滴提取组件的连接管中收集乳液，即形成单分散的粒径均一的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液。乳液的离子强度为40mM，乳液的pH为6.5。将收集的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养10h，动态培养10h后乳液的pH为3.8，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有植物乳杆菌、培养基以及麦芽糊精，壁材为羟丙甲纤维素和纤维素固体颗粒，益生菌的含量为1×1012个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达98.0％。
实施例12
分别称取3克明胶(分子量为300000Da，溶度参数为23.8(Cal/cm30)0.5)和5克葡聚糖(分子量为500000Da，溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)，配制质量分数分别为3％明胶水溶液A(Zeta电势为+20mV)，和5％的葡聚糖水溶液B(Zeta电势为-12mV)，按照羟丙甲纤维素水溶液和葡聚糖水溶液的质量比为1:1取上述溶液混合，静置后，使其分相。明胶体系中的水会迁移到葡聚糖体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为明胶相，连续相为葡聚糖相。将连续相置于撞击流装置中，添加质量分数为0.1％石墨烯纳米片(以聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.1克石墨烯纳米片，Zeta电势为-23mV)分散于连续相中，分散有石墨烯纳米片的水相连续相通过撞击流装置内部构件的导流作用形成两股相向撞击的流体，将分散有植物乳杆菌(典藏号CICC6240)和1％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1.0克培养基)的水相分散相(植物乳杆菌含量为106个/克)加入至两股相向撞击的流体在撞击区域产生的湍流区中，利用撞击流的剪切作用，控制撞击流装置的射流口直径为0.1mm，撞击喷嘴喷出液体的流速为0.5m/s，在15℃的温度下，一步法生成稳定的包埋有植物乳杆菌水包水Pickering乳液。乳液的离子强度为38mM，乳液的pH为6.3。所得到水包水Pickering乳液的粒径为：86±9微米，乳化指数92％(常温放置40天后)。将得到的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养10h，动态培养10h后乳液的pH为3.9，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有植物乳杆菌、培养基以及明胶，壁材含有葡聚糖和石墨烯纳米片，益生菌的含量为1×1010个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达97.0％。
实施例13
分别称取3克明胶(分子量为300000Da,溶度参数为23.8(Cal/cm3)0.5)和10克葡聚糖(分子量为500000Da,溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)，配制质量分数分别为3％明胶水溶液A(Zeta电势为+20mV)和10％的葡聚糖水溶液B(Zeta电势为-15mV)，按照明胶水溶液和葡聚糖水溶液的质量比为1：5取上述溶液混合，静置后，使其分相。明胶体系中的水会迁移到葡聚糖体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为明胶相，连续相为葡聚糖相。质量分数为1.5％石墨烯纳米片(以聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入1.5克石墨烯纳米片，Zeta电势为-25mV)分散于连续相中，将植物乳杆菌(典藏号CICC 6240)和1％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1.0克培养基)的水相分散相(植物乳杆菌含量为106个/克)中，通过注射泵以流速2000μL/h将含有石墨烯纳米片的连续相和含有植物乳杆菌和培养基的分散相通过微流控注射通道分别缓慢注入微流控面板中，从液滴提取组件的连接管中收集乳液，即形成单分散的粒径均一的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液。乳液的离子强度为27mM，乳液的pH为6.3。将收集的包埋有植物乳杆菌的水包水Pickering乳液在37℃下进行动态培养10h，动态培养10h后乳液的pH为3.8，干燥得到微胶囊固体制剂，该微胶囊制剂包括芯材和壁材，芯材含有植物乳杆菌、培养基以及明胶，壁材含有葡聚糖和石墨烯纳米片，益生菌的含量为1×1010个/克。制备的微胶囊在常温条件下保存六个月后，存活率仍高达97.3％。
实施例14
分别称取3克的葡聚糖(其分子量为500000Da,溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)，和5克的聚氧化乙烯((分子量为100000Da，溶度参数为18.3(Cal/cm3)0.5))，配制质量分数分别为3％的葡聚糖水溶液A(Zeta电势为-11mV)和5％聚氧化乙烯水溶液B(Zeat电势为-23mV)。按照葡聚糖水溶液和聚氧化乙烯水溶液的质量比为1:1取上述溶液混合，静置后，使其分相。通过微流控法、撞击流法和机械搅拌法制备得到水包水Pickering乳液。
通过注射泵以流速100μL/h将含有质量分数0.1％纤维素固体颗粒(以聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.1克纤维素固体颗粒，表面电势为-30mV)的连续相和分散相通过微流控注射通道分别缓慢注入微流控面板中，从液滴提取组件的连接管中收集稳定的水包水Pickering乳液。图7为该实施例采用的微流控通道示意图。
将含有质量分数0.1％纤维素固体颗粒(以聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.1克纤维素固体颗粒，表面电势为-30mV)的连续相和分散相加入至两股相向撞击的流体在撞击区域产生的湍流区中，利用撞击流的剪切作用，控制撞击流装置的射流口直径为0.1毫米，撞击喷嘴喷出液体的流速为0.5m/s，生成稳定的水包水Pickering乳液。图8为撞击流装置示意图。
将分散相加入到含有质量分数0.1％纤维素固体颗粒(以聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.1克纤维素固体颗粒，表面电势为-30mV)的连续相中，机械搅拌(温度25℃、搅拌速率600rpm)生成稳定的水包水Pickering乳液。
以上三种方法制备得到的乳液图片见图3。分析可知，微流控法制备的乳液粒径约为5微米，撞击流法制备的乳液粒径为5～7微米，机械搅拌法制备的乳液粒径为10～15微米。通过微流控法制备的水包水Pickering乳液具有较小的液滴粒径和较窄的粒径分布范围。而通过机械搅拌法制备的水包水Pickering乳液与微流控法和撞击流法制备的乳液液滴相比具有最大的液滴粒径和较宽的粒径分布范围。
实施例15
分别称取5克的葡聚糖(其分子量为500000Da,溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)，和5克的聚氧化乙烯((分子量为100000Da，溶度参数为18.3(Cal/cm3)0.5))，配制质量分数分别为5％的葡聚糖水溶液A(Zeta电势为-12mV)5％聚氧化乙烯水溶液B(Zeta电势为-23mV)。将上述溶液混合，静置后，使其分相。将乳酸菌(典藏号CICC 22536)和植物乳杆菌(典藏号CICC 6240)分别分散于分散相中，将分散相加入到含有质量分数0.1％纤维素固体颗粒(以聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.1克纤维素固体颗粒，表面电势为-30mV)的连续相中，机械搅拌(温度25℃、搅拌速率800rpm)分别生成稳定的含有乳酸菌和植物乳杆菌的水包水Pickering乳液。如图4所示，内容a和b为负载乳酸菌的水包水Pickering乳液，内容c和d为负载植物乳杆菌的水包水Pickering乳液。光学显微结果表明，乳酸菌和植物乳杆菌都倾向于分布在水包水Pickering乳液的分散相中。通过二醋酸羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)染料对乳酸菌和植物乳杆菌进行染色处理，荧光显微观察结果进一步证明了乳酸菌和植物乳杆菌倾向于分布于分散相中。而且，荧光显微结果还显示出植物乳杆菌在分散相内倾向于向内聚集的趋势，而乳酸菌分布在水-水界面的趋势。
实施例16
分别称取5克的葡聚糖(其分子量为500000Da,溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)，和5克的聚氧化乙烯((分子量为100000Da，溶度参数为18.3(Cal/cm3)0.5))，配制质量分数分别为5％的葡聚糖水溶液A(Zeta电势为-12mV)5％聚氧化乙烯水溶液B(Zeta电势为-23mV)。按照葡聚糖水溶液和聚氧化乙烯水溶液的质量比为1:1取上述溶液混合，静置后，使其分相。将乳酸菌(典藏号CICC 22536)和1％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1.0克培养基)分散于分散相中，将分散相加入到含有质量分数0.1％纤维素固体颗粒(以聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.1克纤维素固体颗粒，表面电势为-30mV)的连续相中，机械搅拌(温度25℃、搅拌速率800rpm)生成稳定的含有乳酸菌的水包水Pickering乳液，体系的pH为7.2。在37℃条件下进行动态发酵培养，如图5所示，发酵前(内容a)和发酵14小时后(内容b)的显微图。显微结果显示，乳酸菌在37℃条件下动态培养14h后实现了增殖。结果表明，水包水Pickering乳液可作为载体实现乳酸菌的发酵前包埋培养。
实施例17
分别称取5克的葡聚糖(其分子量为500000Da,溶度参数为23.1(Cal/cm3)0.5)，和5克的聚氧化乙烯((分子量为100000Da，溶度参数为18.3(Cal/cm3)0.5))，配制质量分数分别为5％的葡聚糖水溶液A(Zeta电势为-12mV)5％聚氧化乙烯水溶液B(Zeta电势为-23mV)。按照葡聚糖水溶液和聚氧化乙烯水溶液的质量比为1:1取上述溶液混合，静置后，使其分相。将乳酸菌(典藏号CICC 22536)和1％MRS培养基(以100克的含含菌乳液体系为参考，加入1.0克培养基)分散于分散相中，将分散相加入到含有质量分数0.1％纤维素固体颗粒(以聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.1克纤维素固体颗粒，Zeta电势为-30mV)的连续相中，机械搅拌(温度25℃、搅拌速率800rpm)生成稳定的含有乳酸菌的水包水Pickering乳液。在37℃条件下进行动态发酵培养30h，对培养过程中的pH值和乳酸菌数量进行监测，得到水包水Pickering乳液pH与乳酸菌数量变化与时间的关系图，如图6所示。结果表明，乳酸菌在水包水Pickering乳液中实现了增殖并产乳酸导致pH下降。说明该乳液体系能用来发酵培养益生菌。
实施例18
分别称取5克葡聚糖(分子量为120000Da，溶度参数为20.3(Cal/cm3)0.5)和25克麦芽糊精(分子量为3000Da，溶度参数为25.1(Cal/cm3)0.5)，配制质量分数分别为5％葡聚糖水溶液A(Zeta电势为-12mV)和25％的麦芽糊精水溶液B(Zeta电势为-14mV)，按照葡聚糖水溶液和麦芽糊精水溶液的质量比为1:10取上述溶液混合，静置后，使其分相。麦芽糊精体系中的水会迁移到葡聚糖体系中，两者浓度会发生变化。此时，根据混合后两相浓度和相图确定分散相为富麦芽糊精相，连续相为富葡聚糖相。添加质量分数为0.80％纤维素/明胶蛋白复合固体颗粒(以聚合物混合体系的总质量为参考，即100克混合聚合物水溶液为单位，加入0.8克纤维素/明胶蛋白复合固体颗粒，Zeta电势为+15mV)分散于连续相中，将植物乳杆菌(典藏号CICC 6240)分散于分散相中，通过机械搅拌，搅拌速度800rpm，形成水包水Pickering乳液，体系pH为6.8，通过二醋酸羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)染料对植物乳杆菌进行染色处理，如图9所示，荧光显微镜观察结果表明植物乳杆菌包埋于该乳液的分散相和连续相中，可能原因是纤维素/明胶蛋白固体颗粒稳定剂Zeta电势为正，且正电性太强，导致固体颗粒稳定剂不能稳定排布于水-水界面，而导致益生菌部分迁移至连续相中。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将第一聚合物体系的水溶液和第二聚合物体系的水溶液混合后，水在两种聚合物体系中的分配比不同，即持水性弱的聚合物体系中的水分会向持水性强的聚合物体系中迁移；静置后发生相分离，进而得到不同体积的两相，其中体积小的相作为分散相，体积较大的相作为连续相；所述第一聚合物体系中包含的水溶性聚合物相对于水的溶度参数与第二聚合物体系中包含的水溶性聚合物相对于水的溶度参数的差的绝对值大于0.5；
(2)将颗粒稳定剂分散于所述连续相中，将拟包埋的益生菌分散于所述分散相中，然后将含有所述益生菌的分散相与分散有所述固体颗粒稳定剂的连续相混合后进行剪切乳化，制备得到包载益生菌的水包水Pickering乳液，该水包水Pickering乳液的内部分散相中含有所述益生菌；
(3)将所述包载益生菌的水包水Pickering乳液进行干燥；或发酵培养后干燥，得到益生菌微胶囊固体制剂。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一聚合物体系中包含一种或多种水溶性聚合物，所述第二聚合物体系中包含一种或多种水溶性聚合物，所述第一聚合物体系中的水溶性聚合物和所述第二聚合物体系中的水溶性聚合物各自独立地选自合成大分子聚合物、水溶性天然多糖和水溶性蛋白质；所述颗粒稳定剂为水不溶性微纳米颗粒，其为无机纳米粒子、有机纳米粒子和灭活微生物中的一种或多种；
所述第一聚合物体系的水溶液中聚合物的质量百分浓度为3％～20％，所述第二聚合物体系的水溶液中聚合物的质量百分浓度为3％～20％；
所述第一聚合物体系的水溶液和第二聚合物体系的水溶液的质量比为1:1～1:10；
所述固体颗粒稳定剂的质量占所述连续相和所述分散相总质量的0.1％～1.5％。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述剪切乳化为机械搅拌剪切乳化、撞击流剪切乳化或微流控剪切乳化；乳化的温度为5～50℃。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)采用的乳化方式为撞击流乳化，将分散有所述颗粒稳定剂的水相连续相通过撞击流导流作用形成两股相向撞击的流体，将分散有所述益生菌的水相分散相加入至所述两股相向撞击的流体在撞击区域产生的湍流区中，利用所述两股相向撞击的流体的剪切作用，在湍流区中发生剪切乳化，制备得到负载益生菌的水包水Pickering乳液。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述含有所述益生菌的分散相中益生菌的浓度为1×102～1×106个/克。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述固体颗粒稳定剂表面Zeta电势不大于+10mV，优选其表面Zeta电势为+10mV～-40mV。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)将所述包载益生菌的水包水Pickering乳液发酵培养后干燥，得到益生菌微胶囊制剂粉末；其中，步骤(1)所述水相分散相中还分散有有利于益生菌繁殖的营养物质，具体包括如下步骤：
步骤(2)将颗粒稳定剂分散于所述连续相中，将拟包埋的益生菌和有利于益生菌繁殖的营养物质分散于所述分散相中，然后将分散有益生菌和营养物质的所述分散相与所述分散有固体颗粒稳定剂的连续相混合并进行剪切乳化，制备得到负载益生菌的水包水Pickering乳液，且所述益生菌被包埋于该水包水Pickering乳液的内部分散相中；步骤(3)将含有益生菌和营养物质的水包水Pickering乳液于5～50℃，优选25～37℃发酵培养5h～72h，以进一步提高该乳液中益生菌的负载量。
8.基于水包水乳液结构的益生菌微胶囊制剂，其特征在于，包括壁材和芯材，其中所述芯材包括益生菌和分散相聚合物体系，所述壁材包括连续相聚合物体系和固体颗粒稳定剂；该微胶囊制剂呈球状或近球状；
所述分散相聚合物体系包含一种或多种水溶性聚合物，所述连续相聚合物体系包含一种或多种水溶性聚合物；且所述分散相聚合物体系中水溶性聚合物的水溶液和所述连续相聚合物体系中水溶性聚合物的水溶液互不相容，且所述分散相聚合物体系中包含的水溶性聚合物相对于水的溶度参数与连续相聚合物体系中包含的水溶性聚合物相对于水的溶度参数的差的绝对值大于0.5。
9.如权利要求1所述的微胶囊制剂，其特征在于，所述固体颗粒稳定剂在该微胶囊制剂中的质量分数为2％～20％；
所述芯材中益生菌的含量为1×104～1×1012个/克；
所述芯材中还包括有利于所述益生菌生长繁殖的营养物质，所述营养物质选自包埋益生菌生长所需的营养组分。
10.如权利要求8或9所述的微胶囊制剂，其特征在于，所述分散相聚合物体系中的水溶性聚合物和所述连续相聚合物体系中的水溶性聚合物各自独立地选自合成大分子聚合物、水溶性天然多糖和水溶性蛋白质；
所述颗粒稳定剂为水不溶性微纳米颗粒，其为无机纳米粒子、有机纳米粒子和灭活微生物中的一种或多种。
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