CN113713062A - 土茯苓总黄酮的新用途 - Google Patents

土茯苓总黄酮的新用途 Download PDF

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CN113713062A CN202111160880.5A CN202111160880A CN113713062A CN 113713062 A CN113713062 A CN 113713062A CN 202111160880 A CN202111160880 A CN 202111160880A CN 113713062 A CN113713062 A CN 113713062A
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Abstract

本发明属于医药领域，涉及黄酮类化合物及其应用，具体的为土茯苓总黄酮的新用途。本申请发明人通过大孔树脂技术从土茯苓提取物中分离纯化得到土茯苓总黄酮(SGF)，对其研究发现，SGF对离体血管具有β肾上腺素受体(β‑AR)阻滞样作用，并且能抵抗异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌细胞肥大。具有作为β‑AR抑制剂的新用途。

Description

土茯苓总黄酮的新用途
技术领域
本发明属于医药领域，涉及黄酮类化合物及其应用，具体的为土茯苓总黄酮的新用途。
背景技术
β-AR是介导儿茶酚胺作用的一类组织受体，属于G蛋白偶联受体(GPCRs)家族成员。目前发现并克隆了3种亚型：β1、β2、β3。，其中β1和β2-AR主要在心肌细胞表面表达，它们在人类心脏中所占比例分别为70％～80％及20％～30％，而β3-AR主要存在于脂肪组织中，在心肌组织中表达比较少。β-AR均可被交感神经系统或儿茶酚胺类物质激活。研究发现，持续地激活β-AR，能通过诱导G蛋白偶联状态的改变、激活ERK信号通路、刺激局部肾素-血管紧张素系统(RAAS)、引起细胞内钙超载、氧化应激等机制参与心肌肥大(cardiachypertrophy，CH)的发生发展。而心肌肥大作为众多心血管疾病共同的病理基础，有效抑制心肌肥大可大大降低心血管疾病的死亡率。目前临床上用于治疗心力衰竭的β-AR阻滞剂有选择性和非选择性两大类，主要通过阻断心脏β-AR、拮抗过量儿茶酚胺对心脏的毒性作用，避免心肌细胞坏死、改善重构，抑制RAAS，防止高浓度AngII对心脏的损害，上调心肌β-AR的数量，改善其对儿茶酚胺的敏感性等机制发挥作用。但是已有的β-AR抑制剂未能显著降低死亡率，并且这些药物逆转心肌肥大的效果欠佳，且副作用多。这也促使人们寻求新的有效β-AR抑制剂。
土茯苓是百合科植物光叶菝葜(Smilax glabra Roxb)的干燥根茎，为一常用中药。临床上有大剂量土茯苓治疗心悸的经验，并且认为土茯苓有较强的宁心定悸、安神通络之作用，现代药理也证实土茯苓具有抗动脉粥样硬化、抗血栓和抗心肌缺血的作用。我们前期研究发现土茯苓粗提物能显著降低肾性高血压大鼠血清心房钠尿肽(atrialnatriuretic peptid,ANP)水平。随后我们采用大孔树脂技术从土茯苓提取物中分离纯化得到土茯苓总黄酮(Smilax glabra flavonoids,SGF)。已有研究表明，SGF在抗炎、抗氧化、治疗痛风及调节脂质代谢等方面有显著活性。
发明内容
本发明的目的是提供土茯苓总黄酮(SGF)的新用途。
土茯苓总黄酮用于制备β肾上腺素受体抑制剂的应用。
土茯苓总黄酮用于制备治疗心肌肥大药物的应用。
土茯苓总黄酮用于抵抗异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌细胞肥大的应用。
本申请发明人通过大孔树脂技术从土茯苓提取物中分离纯化得到土茯苓总黄酮(SGF)，对其研究发现，SGF对离体血管具有β肾上腺素受体(β-AR)阻滞样作用，并且能抵抗异丙肾上腺素(ISO)诱导的心肌细胞肥大。具有作为β-AR抑制剂的新用途。
本发明通过TAC建立大鼠心肌肥大模型模拟左心室肥大疾病，通过心动超声影像、血流动力学、分子生物学和病理组织学等检测，观察SGF对心肌肥大的影响。结果发现，SGF可显著降低大鼠血清中心肌肥大标志物氨基末端脑钠尿肽(NT-proBNP)的含量，抵抗TAC大鼠左心室肥大，维持TAC大鼠左心室功能，明显改善TAC大鼠心肌组织肥大、炎症及纤维化。同时用β-AR激动剂ISO诱导大鼠心肌细胞H9C2肥大，观察SGF对H9C2心肌细胞肥大的影响，结果发现，SGF可显著降低ISO诱导的H9C2细胞肥大基因表达水平。此外，通过离体血管实验发现，SGF对离体血管具有β-AR阻滞样作用。
本发明采用的技术方案是：
通过主动脉弓缩窄术(TAC)建立大鼠心肌肥大模型，随机分为模型对照组、SGF高剂量组、SGF中剂量组、SGF低剂量组及阳性药组，行假手术后存活的大鼠为假手术组。灌胃给药8周观察SGF对TAC大鼠心动超声影像、血流动力学、心肌组织病理等方面的影响。结果显示，SGF可显著降低TAC大鼠血清中心肌肥大标志物NT-proBNP含量，抵抗TAC引起的大鼠左心室肥大，维持TAC大鼠左心室功能，明显改善TAC大鼠心肌组织肥大、炎症及纤维化，具有抗心肌肥大作用。
本发明所述方法通过β-AR激动剂ISO诱导大鼠心肌细胞H9C2建立心肌肥大细胞模型。以10μM ISO诱导H9C2细胞，加入不同浓度SGF(终浓度为31.25、62.5、125μg/mL)处理48小时，观察SGF对H9C2心肌细胞肥大的影响，结果发现，SGF可显著降低ISO诱导的H9C2细胞肥大基因ANP、BNP和β-MHCmRNA水平。
本发明所述方法通过离体血管实验，分别观察SGF对氧肾上腺素(PE)、去甲肾上腺素(NE)收缩血管的影响，观察SGF联合ISO对NE收缩血管的影响，分别观察β1受体阻滞剂美托洛尔和Ca2+通道阻滞剂维拉帕米对SGF舒血管作用的影响。结果发现，SGF的作用与美托洛尔类似，具有β-受体阻滞样的作用。
附图说明
图1是实施例4假手术组大鼠心肌组织HE染色照片(×400)；
图2是实施例4模型组大鼠心肌组织HE染色照片(×400)；
图3是实施例4土茯苓总黄酮(SGF)低剂量组大鼠心肌组织HE染色照片(×400)；
图4是实施例4SGF中剂量组大鼠心肌组织HE染色照片(×400)；
图5是实施例4SGF高剂量组大鼠心肌组织HE染色照片(×400)；
图6是实施例4假手术组大鼠心肌组织血管部位HE染色照片(×400)；
图7是实施例4模型组大鼠心肌组织血管部位HE染色照片(×400)；
图8是实施例4SGF低剂量组大鼠心肌组织血管部位HE染色照片(×400)；
图9是实施例4SGF中剂量组大鼠心肌组织血管部位HE染色照片(×400)；
图10是实施例4SGF高剂量组大鼠心肌组织血管部位HE染色照片(×400)；
图11是实施例4假手术组大鼠心肌组织Masson染色照片(×80)；
图12是实施例4模型组大鼠心肌组织Masson染色照片(×80)；
图13是实施例4SGF低剂量组大鼠心肌组织Masson染色照片(×80)；
图14是实施例4SGF中剂量组大鼠心肌组织Masson染色照片(×80)；
图15是实施例4SGF高剂量组大鼠心肌组织Masson染色照片(×80)；
图16是实施例5SGF对ISO诱导的大鼠心肌细胞H9C2肥大基因mRNA水平的影响。与空白组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
图17是实施例6SGF对离体血管的β-AR阻滞样作用。与Control组比，*P<0.05,**P<0.01；与SGF 50mg/L组比，aP<0.05；与ISO组比较，bP<0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：SGF对TAC大鼠血清中NT-proBNP含量的影响
材料：SGF、异氟烷、大鼠NT-proBNP ELISA检测试剂盒
实验动物：SPF级雄性SD大鼠，6-8周龄，体重220-250g
(1)实验方法
1.模型建立和分组给药
1.1模型建立
雄性SD大鼠适应性饲养1周后，行主动脉弓狭窄手术。术前禁食不禁水10-12h，将大鼠诱导麻醉后，剃掉胸部被毛，并固定于45°斜式固定台，进行气管插管，然后将动物固定于保温台，外接小动物麻醉呼吸机辅助呼吸。碘伏消毒胸部术区，剪断大鼠左侧第二根肋骨逐层开胸，并用撑开器撑开切口，充分暴露胸腺，依次分离胸腺、主动脉弓，用3-0号缝线包绕过主动脉弓后壁，从头臂干和左颈总动脉之间探出。将外径为0.9mm的自制“L”型针平行置于主动脉弓上方，结扎后将“L”型针缓慢取出，逐层关闭胸腔，消毒切口，将动物放入保温箱保暖护理待其苏醒。术后3d肌肉注射100000U青霉素，并每天观察动物状况。另取大鼠数只行假手术，其它步骤相同但不缩窄主动脉弓。
1.2分组及处理
术后4周，将造模成功的大鼠按NT-proBNP随机分成4组，分别为模型对照组、SGF高剂量组、SGF中剂量组和SGF低剂量组，每组6只，行假手术后的6只大鼠为假手术组。SGF高、中、低剂量组分别每天灌胃216mg/kg、108mg/kg和54mg/kg的SGF，假手术组和模型对照组分别每天灌胃生理盐水，连续给药8周。
2.血清NT-proBNP含量测定
大鼠禁食不禁水10-12h后，颌下取血约0.5mL，3000rpm离心分离血清，使用ELISA试剂盒检测NT-proBNP含量，操作步骤按照试剂盒说明进行。
(2)实验结果：连续给药4周、8周后，与假手术组相比，模型对照组血清中NT-proBNP含量显著升高(P＜0.01)，SGF各剂量组血清中NT-proBNP均显著下降(P＜0.01)。结果详见表1。
表1 SGF对TAC大鼠血清NT-proBNP的影响
Figure BDA0003290139360000041
Figure BDA0003290139360000042
Figure BDA0003290139360000051
注：与假手术组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05,**P＜0.01。
实施例2：SGF对TAC大鼠左心室超声指标的影响
材料：SGF、异氟烷
实验动物：SPF级雄性SD大鼠，6-8周龄，体重220-250g
(1)实验方法
1.模型建立和分组给药
1.1模型建立
雄性SD大鼠适应性饲养1周后，行主动脉弓狭窄手术。术前禁食不禁水10-12h，将大鼠诱导麻醉后，剃掉胸部被毛，并固定于45°斜式固定台，进行气管插管，然后将动物固定于保温台，外接小动物麻醉呼吸机辅助呼吸。碘伏消毒胸部术区，剪断大鼠左侧第二根肋骨逐层开胸，并用撑开器撑开切口，充分暴露胸腺，依次分离胸腺、主动脉弓，用3-0号缝线包绕过主动脉弓后壁，从头臂干和左颈总动脉之间探出。将外径为0.9mm的自制“L”型针平行置于主动脉弓上方，结扎后将“L”型针缓慢取出，逐层关闭胸腔，消毒切口，将动物放入保温箱保暖护理待其苏醒。术后3d肌肉注射100000U青霉素，并每天观察动物状况。另取大鼠数只行假手术，其它步骤相同但不缩窄主动脉弓。
1.2分组及处理
术后4周，将造模成功的大鼠按NT-proBNP随机分成4组，分别为模型对照组、SGF高剂量组、SGF中剂量组和SGF低剂量组，每组6只，行假手术后的6只大鼠为假手术组。SGF高、中、低剂量组分别每天灌胃216mg/kg、108mg/kg和54mg/kg的SGF，假手术组和模型对照组分别每天灌胃生理盐水，连续给药8周。
2.超声心动图的测定
将大鼠胸部涂上脱毛膏，待5min后用纸巾擦拭干净，放入麻醉装置进行异氟烷麻醉，麻醉后仰卧固定，用高分辨率小动物超声影像系统，在二尖瓣腱索水平记录M型超声心动图，分别测量左室舒张末期室间隔厚度(IVSd)、左室舒张末期内径(LVIDd)、左室后壁舒张末期厚度(LVPWd)、左室收缩末期室间隔厚度(IVSs)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室后壁收缩末期厚度(LVPWs)，在连续3个心动周期上测量各指标并取其平均值。计算左心室质量与体重的比值(LHW)。
(2)实验结果
与假手术组比较，给药4周和8周时，模型对照组的IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs均显著增加(P＜0.01,P＜0.05)，左心室质量LV Mass均显著增大(P＜0.01)，同时LHW也显著升高(P＜0.01)。与模型对照组比较，给药4周后，SGF低剂量组和SGF高剂量组LVPWd显著降低(P＜0.05)；SGF低剂量组LHW显著降低(P＜0.05)。给药8周后，SGF低剂量组和SGF中剂量组LHW显著降低(P＜0.01,P＜0.05)，结果详见表2-1和2-2。
表2-1 SGF对TAC大鼠左心室超声指标影响
Figure BDA0003290139360000061
Figure BDA0003290139360000062
注：与假手术组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照相比，*P＜0.05,**P＜0.01。
表2-2 SGF对TAC大鼠左心室质量及左心室质量系数超声影响
Figure BDA0003290139360000063
Figure BDA0003290139360000064
注：与假手术组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05,**P＜0.01。
实施例3：SGF对TAC大鼠左心室功能的影响
材料：SGF、异氟烷、乌拉坦
实验动物：SPF级雄性SD大鼠，6-8周龄，体重220-250g
(1)实验方法
1.模型建立和分组给药
1.1模型建立
雄性SD大鼠适应性饲养1周后，行主动脉弓狭窄手术。术前禁食不禁水10-12h，将大鼠诱导麻醉后，剃掉胸部被毛，并固定于45°斜式固定台，进行气管插管，然后将动物固定于保温台，外接小动物麻醉呼吸机辅助呼吸。碘伏消毒胸部术区，剪断大鼠左侧第二根肋骨逐层开胸，并用撑开器撑开切口，充分暴露胸腺，依次分离胸腺、主动脉弓，用3-0号缝线包绕过主动脉弓后壁，从头臂干和左颈总动脉之间探出。将外径为0.9mm的自制“L”型针平行置于主动脉弓上方，结扎后将“L”型针缓慢取出，逐层关闭胸腔，消毒切口，将动物放入保温箱保暖护理待其苏醒。术后3d肌肉注射100000U青霉素，并每天观察动物状况。另取大鼠数只行假手术，其它步骤相同但不缩窄主动脉弓。
1.2分组及处理
术后4周，将造模成功的大鼠按NT-proBNP随机分成4组，分别为模型对照组、SGF高剂量组、SGF中剂量组和SGF低剂量组，每组6只，行假手术后的6只大鼠为假手术组。SGF高、中、低剂量组分别每天灌胃216mg/kg、108mg/kg和54mg/kg的SGF，假手术组和模型对照组分别每天灌胃生理盐水，连续给药8周。
2.血流动力学测定
大鼠腹腔注射20％的乌拉坦麻醉大鼠(5mg/kg)，固定于鼠板上。将微型导管充满含肝素的生理盐水(500U/mL)，排除气泡后连接压力换能器和生理信号记录仪。插管时颈部被毛用剃毛器去除，碘伏消毒，自颈中线切开皮肤，使用镊子与止血钳钝性分离颈部肌肉，暴露右颈总动脉。使用缝线和动脉夹分别结扎颈动脉的远心端与近心端，动脉夹下方需结扎活结防止插管时大出血。用微型剪剪一“V”形开口，向近心端仔细轻柔插入微型导管，松开动脉夹使微型导管继续插入直至左心室，用生理信号记录仪测量左室收缩末压(LVESP)、左室舒张末压(LVEDP)、左心室最大收缩速率(﹢dp/dtmax)、左心室最大舒张速率(﹣dp/dtmax)等血流动力学指标。
(2)实验结果
与假手术组相比，模型组大鼠的心率、+dp/dtmax显著下降(P＜0.01)。而给药8周后，SGF低剂量组心率显著高于模型组(P＜0.01)，SGF中剂量组和SGF高剂量组无显著性差异(P>0.05)。各给药组+dp/dtmax和-dp/dtmax均有不同程度的增加。其中，SGF低剂量组+dp/dtmax显著高于模型组(P＜0.01)，SGF各组-dp/dtmax均显著高于模型组(P＜0.01,P＜0.05)。结果详见表3。
表3 SGF对TAC大鼠左心室功能的影响
Figure BDA0003290139360000081
Figure BDA0003290139360000082
注：与假手术组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组相比，*P＜0.05,**P＜0.01。实施例4：SGF对TAC大鼠心肌组织形态学的影响
材料：SGF、异氟烷、Masson三色染色液、苏木精
实验动物：SPF级雄性SD大鼠，6-8周龄，体重220-250g
(1)实验方法
1.模型建立和分组给药
1.1模型建立
雄性SD大鼠适应性饲养1周后，行主动脉弓狭窄手术。术前禁食不禁水10-12h，将大鼠诱导麻醉后，剃掉胸部被毛，并固定于45°斜式固定台，进行气管插管，然后将动物固定于保温台，外接小动物麻醉呼吸机辅助呼吸。碘伏消毒胸部术区，剪断大鼠左侧第二根肋骨逐层开胸，并用撑开器撑开切口，充分暴露胸腺，依次分离胸腺、主动脉弓，用3-0号缝线包绕过主动脉弓后壁，从头臂干和左颈总动脉之间探出。将外径为0.9mm的自制“L”型针平行置于主动脉弓上方，结扎后将“L”型针缓慢取出，逐层关闭胸腔，消毒切口，将动物放入保温箱保暖护理待其苏醒。术后3d肌肉注射100000U青霉素，并每天观察动物状况。另取大鼠数只行假手术，其它步骤相同但不缩窄主动脉弓。
1.2分组及处理
术后4周，将造模成功的大鼠按NT-proBNP随机分成4组，分别为模型对照组、SGF高剂量组、SGF中剂量组和SGF低剂量组，每组6只，行假手术后的6只大鼠为假手术组。SGF高、中、低剂量组分别每天灌胃216mg/kg、108mg/kg和54mg/kg的SGF，假手术组和模型对照组分别每天灌胃生理盐水，连续给药8周。
2.心肌组织病理学观察
打开胸腔摘取心脏，去除心耳、升主动脉等其他组织，用生理盐水冲洗干净，取心肌组织浸泡于10％中性甲醛中固定两天，脱水、透明、浸蜡、包埋后制成蜡块，后切片，每个样品制片两份，一份行HE染色，另一份行Masson染色，光学显微镜下观察心肌组织病理变化。
(2)实验结果
大鼠心肌组织HE染色结果显示，假手术组心肌细胞排列整齐，细胞间隙清晰，细胞核呈椭圆形，位于细胞中央，闰盘呈深红色线状，形如阶梯，横贯心肌细胞，心肌细胞之间有薄层结缔组织。模型对照组的心肌纤维增厚，心肌细胞肥大，细胞核增大，排列紊乱，血管外膜结缔组织增生，炎症细胞浸润。连续给药8周后，SGF低剂量组心肌组织的病理状况有不同程度的改善，主要表现为炎症细胞和血管外膜结缔组织得以控制，心肌细胞横截面积减小；SGF中剂量组和SGF高剂量组改善不显著，仍能看出一定程度的心肌细胞肥大、细胞核排列紊乱和血管外膜结缔组织增生的现象。结果详见图1～图10。
大鼠心肌组织Masson染色可见，假手术组的心肌组织中几乎未见胶原纤维着色，模型对照组细胞间隙大量胶原纤维沉积。连续给药8周后，各组胶原纤维的分泌情况有不同程度的改善，SGF低剂量组可见少量胶原纤维沉积于细胞间隙，而SGF中剂量组和SGF高剂量组仍细胞间隙大量胶原纤维沉积。结果详见附图11～15。
实施例5：SGF对ISO诱导的大鼠心肌细胞H9C2肥大基因mRNA水平的影响
材料：SGF、ISO、大鼠心肌细胞H9C2(购于中国科学院上海细胞库)、总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒
(1)实验方法
1.细胞培养与处理
将处于对数生长期的H9C2细胞以1.5×105个/mL密度，每孔2mL接种于六孔板中，于37℃、5％CO2培养箱中培养过夜。待细胞贴壁后，更换成无血清的DMEM高糖培养基饥饿16h。实验孔中加入不同体积的SGF母液，使得终浓度为31.25，62.5，125μg/mL，每组设3个复孔，并置于培养箱中预孵育30min。之后再加入终浓度为10μM的ISO，孵育48h。
2.荧光定量PCR
用组织/细胞RNA快速提取试剂盒提取细胞总RNA，按产品说明书进行操作。按逆转录试剂盒操作说明书操作步骤合成cDNA，选取GAPDH为内参基因，大鼠GAPDH和肥大基因ANP、BNP和β-MHC mRNA引物序列如下表。按照荧光定量试剂盒操作步骤，将cDNA用实时荧光定量PCR仪进行扩增，反应操作在冰上进行。
表4 实时荧光定量PCR引物序列
Figure BDA0003290139360000101
(2)实验结果
与空白组比较，模型对照组的肥大基因ANP、BNP和β-MHC mRNA水平显著增加(P<0.01)。而SGF能显著降低肥大基因ANP、BNP和β-MHC mRNA水平(P<0.01)。结果详见附图16。
实施例6：SGF对离体血管的β-AR阻滞样作用
材料：SGF、去氧肾上腺素(PE)、去甲肾上腺素(NE)、ISO、美托洛尔、维拉帕米。
(1)实验方法
血管环在Krebs液中平衡2h后，分别以10-6mol/L PE和10-6mol/L NE预收缩内皮完整的血管环20min后，每5min 1次累积加入终浓度分别为62.5、125、250mg/L的SGF，观察其对预收缩血管环张力的作用；对照组以生理盐水代替药物等容加入。以10-6mol/L PE和10- 6mol/L NE诱发最大收缩幅度为100％，以加入不同浓度的药物后的血管张力幅度与PE或NE诱发最大收缩幅度之间的比率反映血管张力的变化，并作血管舒张反应的量－效曲线。同样的离体血管实验观察10-6mol/L ISO和50mg/L的SGF共同孵浴10min对10-6mol/L NE收缩血管的影响；1×10-6mol/Lβ1受体阻滞剂美托洛尔孵浴10min对10-6mol/L NE收缩血管后50mg/L SGF舒血管作用的影响；1×10-5mol/L Ca2+通道阻滞剂维拉帕米孵浴10min对10- 6mol/L NE收缩血管后50mg/L SGF舒血管作用的影响。
(2)实验结果
本结果显示，62.5mg/L～250mg/L SGF对α受体激动剂去氧肾上腺素(PE)诱导的血管预收缩无明显舒张作用(P>0.05)，但对α、β1受体激动剂去甲肾上腺素(NE)诱导的血管预收缩有明显的舒张作用(P<0.05，P<0.01)。并且，β受体激动剂ISO预孵育20min后能明显舒张NE所致血管收缩，同时在ISO和50mg/L SGF共同孵育20min后能显著减弱NE所致血管收缩的舒张作用(P<0.05)；另外，经β1受体阻滞剂美托洛尔(Metoprolol)预孵育20min后，50mg/L SGF对NE所致血管收缩的舒张作用被显著阻断(P<0.05)。表明SGF的作用与美托洛尔类似，具有β-受体阻滞样的作用。结果详见附图17。

Claims (4)

1.土茯苓总黄酮用于制备β肾上腺素受体抑制剂的应用。
2.土茯苓总黄酮用于制备治疗心肌肥大药物的应用。
3.土茯苓总黄酮用于制备治疗心肌组织纤维化药物的应用。
4.土茯苓总黄酮用于制备抵抗异丙肾上腺素诱导的心肌细胞肥大药物的应用。
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