CN116159116A - 土茯苓总黄酮在制备抗衰老药物中的应用 - Google Patents

土茯苓总黄酮在制备抗衰老药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药领域，涉及黄酮类化合物及其应用，具体的为土茯苓总黄酮在制备抗衰老药物中的应用。本发明的目的是提供土茯苓总黄酮(SGF)的抗衰老新用途。SGF应用于可显著增强衰老大鼠的心功能，改善衰老大鼠学习记忆能力和体力，显著升高衰老大鼠血清中SOD、CAT等抗氧化指标，改善衰老大鼠心肌组织和肾组织纤维化，抑制心肌细胞和肾脏衰老，显著降低衰老大鼠左心室和肾脏组织ROS的产生。

Description

土茯苓总黄酮在制备抗衰老药物中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及黄酮类化合物及其应用，具体的为土茯苓总黄酮在制备抗衰老药物中的应用。
背景技术
衰老是多种慢性疾病发生发展的诱因。衰老会导致心脏结构和功能的逐渐恶化，例如左心室肥大、心肌纤维化和心功能不全，被认为是心血管疾病发展中关键因素之一。衰老也会引起老年人的肾脏结构和功能发生改变，例如肾皮质、肾小球硬化，间质纤维化，肾小管萎缩和动脉硬化。由此导致老年人心血管疾病患病率和急性肾损伤、慢性肾病等的发生率较普通人群明显升高，严重影响老年人的生活质量。因此，寻找能延缓衰老的干预措施具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供土茯苓总黄酮(SGF)的抗衰老新用途。
土茯苓总黄酮在制备抗衰老药物中的用途。
土茯苓总黄酮用于制备保护D-半乳糖诱导心脏衰老的药物中应用。
土茯苓总黄酮在制备抑制心肌细胞衰老的药物中的应用。
土茯苓总黄酮在制备增强心功能，改善学习记忆能力和体力的药物中的应用。
土茯苓总黄酮在制备改善衰老大鼠心肌组织纤维化的药物中的应用。
土茯苓总黄酮用于制备保护D-半乳糖诱导肾脏衰老的药物中应用。
土茯苓总黄酮在制备抑制肾脏衰老的药物中的应用。
土茯苓总黄酮在制备改善衰老大鼠肾脏组织纤维化的药物中的应用。
土茯苓是百合科植物光叶菝葜(Smilax glabra Roxb)的干燥根茎，含有黄酮及黄酮苷类(赤土茯苓苷、土茯苓苷、落新妇苷、槲皮素等)多种活性天然化合物。本申请发明人研究发现土茯苓总黄酮(Smilax glabra flavonoids，SGF)不仅可以显著增加D-半乳糖诱导的衰老大鼠血清中的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的含量，还能够有效减少心肌细胞中β-半乳糖苷酶的表达。并且，SGF可以通过激活AMPK/PGC-1α信号通路增强线粒体功能。心脏是一个高能量需求和高线粒体含量的器官，90％以上的ATP由心脏线粒体产生，线粒体在心脏衰老中可能发挥着至关重要的作用。并且，CAT的过表达不仅能延长小鼠最大寿命而且明显延缓了心脏衰老。因此，我们推测SGF可能具有抗衰老的作用。
本发明通过D-半乳糖颈背部皮下注射诱导大鼠心脏衰老模型，研究SGF对大鼠心脏和肾脏衰老的影响。结果发现，SGF可显著增强衰老大鼠的心功能，改善衰老大鼠学习记忆能力和体力，显著升高衰老大鼠血清中SOD、CAT等抗氧化指标，改善衰老大鼠心肌组织和肾组织纤维化，抑制心肌细胞和肾脏衰老，显著降低衰老大鼠左心室和肾脏组织ROS的产生。
本申请发明人通过大孔树脂技术从土茯苓提取物中分离纯化得到土茯苓总黄酮(SGF)，对其研究发现，SGF对D-半乳糖诱导的大鼠衰老模型有保护作用，具有抗衰老的新用途。
本发明通过D-半乳糖颈背部皮下注射，建立大鼠衰老模型。观察造模期间SD大鼠体重和一般体征，实验期间通过Morris水迷宫实验、抓力实验、超声心动图，检测血清中SOD、CAT等抗氧化指标，取心脏组织和肾脏组织进行H&E染色、Masson染色、SA-β-Gal、DHE荧光染色等病理学分析，明确SD大鼠衰老模型的发病特征以及SGF的治疗作用。
本发明采用的技术方案是：
SD大鼠随机分为正常组、模型组、SGF低剂量组、SGF高剂量组、维生素E组。除正常组外，其余组均颈背部皮下注射D-半乳糖，每周记录两次体重，同时观察大鼠的一般体征情况，连续8周。灌胃给药8周观察SGF对衰老大鼠心动超声影像、行为学、血清中SOD、CAT等抗氧化指标、心肌组织病理、肾脏组织病理等方面的影响。结果显示，SGF可显著增强衰老大鼠的心功能，改善衰老大鼠学习记忆能力和体力，显著升高衰老大鼠血清中SOD、CAT含量，改善衰老大鼠心肌组织和肾组织纤维化，抑制心肌细胞和肾组织衰老，显著降低衰老大鼠左心室ROS的产生。具有抗衰老作用。
附图说明
图1是实施例1中土茯苓总黄酮(SGF)对衰老大鼠心功能指标的影响。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图2是实施例2中SGF对衰老大鼠学习记忆能力的影响。图A为水迷宫测试时大鼠运动轨迹；图B分别为水迷宫测试时各组大鼠经过目标平台象限的次数，第一次到达目标平台象限的距离和逃避潜伏期(第一次到达目标平台所在象限的时间)；图C为大鼠四肢抓力统计图。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图3是实施例3中SGF对衰老大鼠血清中抗氧化指标的影响。注：与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图4是实施例4正常组大鼠心肌组织HE染色照片(×80)；
图5是实施例4模型组大鼠心肌组织HE染色照片(×80)；
图6是实施例4SGF低剂量组大鼠心肌组织HE染色照片(×80)；
图7是实施例4SGF高剂量组大鼠心肌组织HE染色照片(×80)；
图8是实施例4维生素E组大鼠心肌组织HE染色照片(×80)；
图9是实施例4正常组大鼠心肌组织Masson染色照片(×80)；
图10是实施例4模型组大鼠心肌组织Masson染色照片(×80)；
图11是实施例4SGF低剂量组大鼠心肌组织Masson染色照片(×80)；
图12是实施例4SGF高剂量组大鼠心肌组织Masson染色照片(×80)；
图13是实施例4维生素E组大鼠心肌组织Masson染色照片(×80)；
图14是实施例4各组大鼠心肌组织Masson染色定量结果。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图15是实施例4正常组大鼠心肌组织β-半乳糖苷酶染色照片(×20)
图16是实施例4模型组大鼠心肌组织β-半乳糖苷酶染色照片(×20)
图17是实施例4SGF低剂量组大鼠心肌组织β-半乳糖苷酶染色照片(×20)
图18是实施例4SGF高剂量组大鼠心肌组织β-半乳糖苷酶染色照片(×20)
图19是实施例4维生素E组大鼠心肌组织β-半乳糖苷酶染色照片(×20)
图20是实施例4各组大鼠心肌组织β-半乳糖苷酶阳性细胞定量结果。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图21是实施例4SGF对衰老大鼠心肌组织产生ROS的影响。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图22是实施例5正常组大鼠肾脏组织HE染色照片(×80)；
图23是实施例4模型组大鼠肾脏组织HE染色照片(×80)；
图24是实施例4SGF低剂量组大鼠肾脏组织HE染色照片(×80)；
图25是实施例4SGF高剂量组大鼠肾脏组织HE染色照片(×80)；
图26是实施例4维生素E组大鼠肾脏组织HE染色照片(×80)；
图27是实施例5正常组大鼠肾脏组织Masson染色照片(×80)；
图28是实施例5模型组大鼠肾脏组织Masson染色照片(×80)；
图29是实施例5SGF低剂量组大鼠肾脏组织Masson染色照片(×80)；
图30是实施例5SGF高剂量组大鼠肾脏组织Masson染色照片(×80)；
图31是实施例5维生素E组大鼠肾脏组织Masson染色照片(×80)；
图32是实施例5正常组大鼠肾脏组织β-半乳糖苷酶染色照片(×20)
图33是实施例5模型组大鼠肾脏组织β-半乳糖苷酶染色照片(×20)
图34是实施例5SGF低剂量组大鼠肾脏组织β-半乳糖苷酶染色照片(×20)
图35是实施例5SGF高剂量组大鼠肾脏组织β-半乳糖苷酶染色照片(×20)
图36是实施例5维生素E组大鼠肾脏组织β-半乳糖苷酶染色照片(×20)
图37是实施例5各组大鼠肾脏组织β-半乳糖苷酶阳性细胞定量结果。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
图38是实施例5SGF对衰老大鼠肾脏组织产生ROS的影响。与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.05，##P＜0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：SGF对衰老大鼠心功能指标的影响
材料：D-半乳糖、SGF、异氟烷、维生素E
实验动物：SPF级雄性SD大鼠，8-10周龄，体重250-300g
(1)实验方法
1.模型建立和分组给药
1.1模型建立
雄性SD大鼠适应性饲养1周后称量体重，按体重用随机数字法分为正常组、模型组、SGF低剂量组、SGF高剂量组、维生素E组。除正常组外，其余组均颈背部皮下注射D-半乳糖，每周记录两次体重，同时观察大鼠的一般体征情况，连续8周。
1.2分组及处理
SGF粉末通过生理盐水配制经口灌服；维生素E通过少量玉米油助溶，生理盐水配制经口灌服；正常组和模型组经口灌服等量生理盐水。SGF高剂量组和低剂量组分别灌服108mg/Kg.d、54mg/Kg.d，维生素E组灌服13.5mg/Kg.d，连续给药8周。
2.超声心动图的测定
用高分辨率小动物超声影像系统，在二尖瓣腱索水平记录M型超声心动图，分别测量左室舒张末期室间隔厚度(IVSd)、左室舒张末期内径(LVIDd)、左室后壁舒张末期厚度(LVPWd)、左室收缩末期室间隔厚度(IVSs)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室后壁收缩末期厚度(LVPWs)，计算射血分数(EF)、短轴率(FS)、左心室舒张末期容积(LVEDV)、左心室收缩末期容积(LVESV)，在连续3个心动周期上测量各指标并取其平均值。
(2)实验结果
与正常组大鼠相比，模型组大鼠心脏射血分数(EF)和缩短分数(FS)显著下降，且左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期内径(LVIDd)显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，左室收缩末期室间隔厚度(IVSs)、左室舒张末期室间隔厚度(IVSd)和左室后壁收缩末期厚度(LVPWs)、左室后壁舒张末期厚度(LVPWd)显著增加(P＜0.05，P＜0.01)。SGF与VE处理大鼠可缓解EF和FS的降低(P＜0.05，P＜0.01)，逆转LVIDs和LVIDd的降低以及IVSs、IVSd、LVPWs、LVPWd的增加(P＜0.05，P＜0.01)。结果详见附图1。
实施例2：SGF对衰老大鼠行为学的影响
材料：D-半乳糖、SGF、维生素E、Morris水迷宫
实验动物：SPF级雄性SD大鼠，8-10周龄，体重250-300g
(1)实验方法
1.模型建立和分组给药
1.1模型建立
雄性SD大鼠适应性饲养1周后称量体重，按体重用随机数字法分为正常组、模型组、SGF低剂量组、SGF高剂量组、维生素E组。除正常组外，其余组均颈背部皮下注射D-半乳糖，每周记录两次体重，同时观察大鼠的一般体征情况，连续8周。
1.2分组及处理
SGF粉末通过生理盐水配制经口灌服；维生素E通过少量玉米油助溶，生理盐水配制经口灌服；正常组和模型组经口灌服等量生理盐水。SGF高剂量组和低剂量组分别灌服108mg/Kg.d、54mg/Kg.d，维生素E组灌服13.5mg/Kg.d，连续给药8周。
2.Morris水迷宫实验和抓力的测定
水迷宫主要由一圆柱形水池和一站台组成，水池上方通过一数字摄像机和计算机监视屏相连接，利用计算机软件对大鼠活动进行全程跟踪，并显示整个活动轨迹。8周末，将大鼠头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、南、西、北四个起始位置之一。记录大鼠找到水下平台的时间(s)。在前几次训练中，如果时间超过60s，则引导大鼠到平台，让大鼠在平台停留10s。当一只大鼠结束后，需将其转移并擦干，放回笼中。连续训练5天。最后一次获得性训练结束后的第二天，将平台撤除，开始60s的探查训练，将大鼠由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物第一次到达目标象限(原先放置平台的象限)所花时间、路程和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。
两天后进行抓力的测定，将大鼠放置抓力测定仪的抓板上，随后抓住大鼠约尾根部三分之一处匀速往后拉直至大鼠爪子完全离开抓力板。此时仪器能自动显示在此过程中大鼠抓力的最大值，每只大鼠重复进行三次，所得数据求取平均值。
(2)实验结果
在水迷宫测试中研究了SGF对大鼠学习记忆的影响。与对照组相比，模型组衰老大鼠搜索目标平台路径长度和逃避潜伏期显著延长，经过目标象限次数显著减少(P＜0.01)；而SGF与VE治疗的大鼠均能显著缩短搜索目标平台路径长度和逃避潜伏期(P＜0.05，P＜0.01)。通过测量大鼠抓力的大小来确定SGF对大鼠体力的影响。与对照组相比，模型组衰老大鼠的抓力明显减弱，而SGF与VE治疗的大鼠抓力显著增加(P＜0.05，P＜0.01)。结果详见附图2。
实施例3：SGF对衰老大鼠血清抗氧化指标的影响
材料：SGF、异氟烷、SOD生化检测试剂盒、CAT生化检测试剂盒
实验动物：SPF级雄性SD大鼠，8-10周龄，体重250-300g
(1)实验方法
1.模型建立和分组给药
1.1模型建立
雄性SD大鼠适应性饲养1周后称量体重，按体重用随机数字法分为正常组、模型组、SGF低剂量组、SGF高剂量组、维生素E组。除正常组外，其余组均颈背部皮下注射D-半乳糖，每周记录两次体重，同时观察大鼠的一般体征情况，连续8周。
1.2分组及处理
SGF粉末通过生理盐水配制经口灌服；维生素E通过少量玉米油助溶，生理盐水配制经口灌服；正常组和模型组经口灌服等量生理盐水。SGF高剂量组和低剂量组分别灌服108mg/Kg.d、54mg/Kg.d，维生素E组灌服13.5mg/Kg.d，连续给药8周。
2.生化检测
取大鼠血清，根据试剂盒说明书步骤分别进行超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化指标检测。
(2)实验结果
结果表明，与正常组相比，模型组大鼠血清中SOD和CAT的活性均显著降低(P＜0.05，P＜0.01)。而SGF与VE治疗的大鼠血清中SOD和CAT的活性显著高于模型组。表明SGF对D-半乳糖诱导的衰老大鼠有抗氧化作用。结果详见附图3。
实施例4：SGF对衰老大鼠心肌组织病理学的影响
材料：SGF、异氟烷、Masson三色染色液、苏木精、伊红、DHE染色液、SA-β-Gal染色试剂盒
实验动物：SPF级雄性SD大鼠，8-10周龄，体重250-300g
(1)实验方法
1.模型建立和分组给药
1.1模型建立
雄性SD大鼠适应性饲养1周后称量体重，按体重用随机数字法分为正常组、模型组、SGF低剂量组、SGF高剂量组、维生素E组。除正常组外，其余组均颈背部皮下注射D-半乳糖，每周记录两次体重，同时观察大鼠的一般体征情况，连续8周。
1.2分组及处理
SGF粉末通过生理盐水配制经口灌服；维生素E通过少量玉米油助溶，生理盐水配制经口灌服；正常组和模型组经口灌服等量生理盐水。SGF高剂量组和低剂量组分别灌服108mg/Kg.d、54mg/Kg.d，维生素E组灌服13.5mg/Kg.d，连续给药8周。
2.心肌组织病理学观察
取心脏中上部分放入4％多聚甲醛固定，经取材、脱水、浸蜡包埋以及切片后，制成4μm厚的石蜡切片，进行苏木素-伊红(HE)和Masson染色，用显微镜图像分析仪及ImageJ图像分析系统进行分析，观察心脏组织衰老情况。心脏中间段立即用锡箔纸包裹置于冰上，随后进行冰冻切片，进行DHE免疫荧光染色和SA-β-Gal染色。
(2)实验结果
HE染色结果显示，正常组心肌细胞排列整齐清晰，模型组心肌细胞增粗肥大、排列紊乱、炎细胞浸润，且出现明显的瘢痕。SGF与VE治疗组心肌细胞肥大程度明显减轻，瘢痕有效减少。结果详见附图4～8。
Masson染色结果显示，模型组可见大量蓝色纤维化阳性着色，与对照组相比，模型组心肌组织胶原纤维化面积显著增加(P＜0.01)；SGF与VE治疗组心肌组织胶原纤维化面积显著减少(P＜0.05)。结果详见附图9～14。
与对照组相比，模型组心脏中出现大量蓝色染色的衰老细胞(P＜0.01)。口服SGF与VE可有效抑制心脏中SA-β-gal阳性细胞百分比(P＜0.01)，进一步证实了SGF的抗心脏衰老作用。结果详见附图15～20。
我们使用DHE荧光染色确定了心脏中ROS的产生。发现D-gal诱导的衰老大鼠左心室心肌细胞DHE荧光强度显著增强，SGF与VE显著降低左心室心肌细胞DHE荧光强度。结果详见附图21。
实施例5：SGF对衰老大鼠肾脏组织病理学的影响
材料：SGF、异氟烷、Masson三色染色液、苏木精、伊红、DHE染色液、SA-β-Gal染色试剂盒
实验动物：SPF级雄性SD大鼠，8-10周龄，体重250-300g
(1)实验方法
1.模型建立和分组给药
1.1模型建立
雄性SD大鼠适应性饲养1周后称量体重，按体重用随机数字法分为正常组、模型组、SGF低剂量组、SGF高剂量组、维生素E组。除正常组外，其余组均颈背部皮下注射D-半乳糖，每周记录两次体重，同时观察大鼠的一般体征情况，连续8周。
1.2分组及处理
SGF粉末通过生理盐水配制经口灌服；维生素E通过少量玉米油助溶，生理盐水配制经口灌服；正常组和模型组经口灌服等量生理盐水。SGF高剂量组和低剂量组分别灌服108mg/Kg.d、54mg/Kg.d，维生素E组灌服13.5mg/Kg.d，连续给药8周。
2.肾脏组织病理学观察
取一侧肾脏的一半放入4％多聚甲醛固定，经取材、脱水、浸蜡包埋以及切片后，制成4μm厚的石蜡切片，进行苏木素-伊红(HE)和Masson染色，用显微镜图像分析仪及ImageJ图像分析系统进行分析，观察肾脏组织衰老情况。一侧肾脏另一半立即用锡箔纸包裹置于冰上，随后进行冰冻切片，进行DHE免疫荧光染色和SA-β-Gal染色。
(2)实验结果
H&E染色肾切片的组织形态学显示，正常组肾小球大小形态正常，边界清晰，肾小管内部刷状缘结构完整，无病理改变。模型组肾小球形状不规则，有一定程度的萎缩，部分肾小管扩张，管腔增大，内部刷状缘结构消失等病理特征。SGF与VE治疗后，肾小球萎缩得到一定程度的恢复，边界清晰，表明SGF对D-半乳糖诱导的肾衰老具有保护作用。结果详见附图22～26。
Masson染色结果显示，各组血管周围都有一定程度的纤维化，与正常组相比，模型组纤维化面积更大，且肾小管周围也出现纤维化。与模型组相比，给药组纤维化程度减轻。结果详见附图27～31。
为了确认SGF对肾脏衰老的保护作用，我们检测肾脏组织中SA-β-gal的活性。结果显示，与对照组相比，模型组肾脏中出现大量衰老细胞(P＜0.01)，图像中以蓝色染色表示。口服SGF与VE可有效抑制肾脏中SA-β-gal阳性细胞百分比(P＜0.01)，进一步证实了SGF的抗肾脏衰老作用。结果详见附图32～37。
我们使用DHE荧光染色观察肾脏中ROS的产生，结果显示，D-gal诱导的衰老大鼠肾脏DHE荧光强度显著增强，SGF与VE显著降低肾脏DHE荧光强度。结果详见附图38。

Claims (9)

1.土茯苓总黄酮在制备抗衰老药物中的应用。
2.土茯苓总黄酮用于制备保护D-半乳糖诱导心脏衰老的药物中应用。
3.土茯苓总黄酮在制备抑制心肌细胞衰老的药物中的应用。
4.土茯苓总黄酮在制备降低衰老大鼠左心室ROS的产生的药物中的应用。
5.土茯苓总黄酮在制备增强心功能，改善学习记忆能力和体力的药物中的应用。
6.土茯苓总黄酮在制备改善衰老大鼠心肌组织纤维化的药物中的应用。
7.土茯苓总黄酮用于制备保护D-半乳糖诱导肾脏衰老的药物中应用。
8.土茯苓总黄酮在制备抑制肾脏衰老的药物中的应用。
9.土茯苓总黄酮在制备改善衰老大鼠肾脏组织纤维化的药物中的应用。
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