CN112826822B - Abt-263联合血管紧张素转换酶抑制剂的应用及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了ABT‑263联合血管紧张素转换酶抑制剂在制备治疗心肌梗死后心室重塑的产品中的应用，属于医药技术领域。本发明人研究发现，ABT‑263联合血管紧张素转换酶抑制剂可以显著改善心脏功能、减少心肌梗死区及周围区纤维化、降低心肌炎症及NLRP3信号通路分子活化，进而抑制心梗后心室重塑，为临床治疗心梗后心室重塑提供了一种新的治疗方案。

Description

ABT-263联合血管紧张素转换酶抑制剂的应用及其产品

技术领域

本发明涉及ABT-263联合血管紧张素转换酶抑制剂的应用及其产品，属于医药技术领域。

背景技术

心血管系统疾病导致的死亡人数长期占据全因死亡人数的第一位，其中心肌梗死(myocardial infarction,MI)在心血管系统疾病死亡原因中位居首位。近年来，MI的发病率逐年增高，为全社会造成巨大的健康和经济压力。研究显示，MI的发病率随着年龄的增加逐渐增加，提示MI可能是老龄化疾病之一。随着急性冠状动脉支架植入技术的推广，急性心肌梗死的死亡率已经明显降低，但是急性心肌梗死后所致的心室重塑进而导致心力衰竭成为了MI病人的又一重要死亡原因之一。

目前，临床上针对心室重塑的治疗药物仅有传统的血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、β受体阻滞剂(β-blocker)、安体舒通等药物，但是部分患者在规范化地使用上述传统药物治疗后仍无法控制疾病的进程，因此深入研究MI后心室重塑的发病机制以及寻找新的药物治疗靶点成为亟待解决的重要问题。

炎症性衰老(Inflamm-aging)决定了衰老过程的速度和寿命，与心血管疾病和其他疾病有着高度的相关性，它会显著增加发病率和死亡率，并导致患者生活质量下降。炎性衰老指机体在自然衰老过程中出现的低级、慢性系统性的促炎反应状态进行性增高的现象。炎性衰老由组织中衰老细胞不断产生衰老相关分泌表型(SASP)，从而引起循环中促炎症因子明显增加，主要包括IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12、IFN-α和IFN-β。其中，IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-6介导肝脏产生的C反应蛋白(CRP)随年龄增高而增加，已成为心血管风险的主要因子。机体在衰老的过程中所显现的累积性增加的促炎性反应状态，随着衰老的加剧而进行性增高，其发生机制具有可控、低度、慢性、系统性、无症状五大特点。这些SASP因子在调节局部微环境中的非心肌细胞(如成纤维细胞)中发挥重要作用，并参与心脏重塑和功能障碍近年来的研究显示炎症小体是介导炎性衰老的一种关键通路分子。其中，NLRP3炎症小体能够被多种病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)激活，进而活化Caspase-1，释放成熟形式的IL-1β和IL-18，引起机体的炎症反应。在多种病原相关分子模式和损伤相关分子模式(DAMPs)的作用下，NLRP3炎症小体激活Caspase-1，促进成熟的IL-1β和IL-18的释放，从而引起心脏成纤维细胞的促炎和促纤维化反应。作为炎症反应的核心，NLRP3炎症小体信号参与了炎性衰老发生发展的全过程。MI后的慢性炎症是导致心室重塑的关键原因之一，与炎性衰老机制密切相关。

ABT-263是一种抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-xL的特异性抑制剂，被用作衰老细胞清除剂。BCL-2和BCL-xL蛋白是BCL-2家族主要的抗凋亡蛋白，其通过与促凋亡BCL-2蛋白结合，抑制其活性，从而保持线粒体外膜的完整性。同时抑制BCL-2和BCL-xL蛋白活性，促凋亡效应物BAX、BAK，使线粒体外膜通透性增加，从而导致细胞色素c的释放，驱动衰程序性死亡，选择性的诱导衰老细胞凋亡。

目前尚无关于衰老清除剂ABT-263治疗心梗后心肌重塑的报道，也尚无关于ABT263和卡托普利联合治疗心梗后心肌重塑的报道。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种ABT-263联合血管紧张素转换酶抑制剂的应用及其产品。

技术方案

ABT-263联合血管紧张素转换酶抑制剂在制备治疗心肌梗死后心室重塑的产品中的应用。发明人研究发现，ABT-263联合血管紧张素转换酶抑制剂可以显著改善心脏功能、减少心肌梗死区及周围区纤维化、降低心肌炎症及NLRP3信号通路分子活化，进而抑制心梗后心室重塑。

进一步，所述血管紧张素转换酶抑制剂优选为卡托普利。

进一步，所述ABT-263和血管紧张素转换酶抑制剂的重量比为3:1。

一种治疗心肌梗死后心室重塑的产品，其以ABT-263和血管紧张素转换酶抑制剂为主要活性成分。

进一步，所述血管紧张素转换酶抑制剂为卡托普利。

进一步，所述治疗心肌梗死后心室重塑的产品中，ABT-263和血管紧张素转换酶抑制剂的重量比为3:1。

有益效果：本研究发现，ABT-263联合血管紧张素转换酶抑制剂可以显著改善心脏功能、减少心肌梗死区及周围区纤维化、降低心肌炎症及NLRP3信号通路分子活化，进而抑制心梗后心室重塑，为临床治疗心梗后心室重塑提供了一种新的治疗方案。

附图说明

图1为各处理组小鼠的左心室射血分数及左心室缩短分数的统计图；

图2为各处理组小鼠心肌组织的Masson染色图；

图3为各处理组小鼠心肌组织胶原面积统计图；

图4为各处理组小鼠心肌组织心肌梗死区纤维化蛋白胶原(Collagen)阳性面积的免疫组织化学检测结果；

图5为各处理组小鼠心肌组织心肌梗死区纤维化蛋白α-SMA阳性面积的免疫组织化学检测结果；

图6为各处理组小鼠外周血清脑钠尿肽水平的ELISA检测结果；

图7为各处理组小鼠心肌组织纤维化蛋白一型胶原(Collagen I)和α-SMA的表达水平的Western blot检测结果；

图8为心梗小鼠4周后心肌梗死区的炎症因子IL-1β阳性细胞数的免疫组化检测图；

图9为心梗小鼠4周后心肌梗死区的炎症因子IL-6阳性细胞数的免疫组化检测图；

图10为心梗小鼠4周后心肌梗死区的炎症因子TNF-α阳性细胞数的免疫组化检测图；

图11为心梗小鼠4周后心肌梗死区的炎症因子RANTES阳性细胞数的免疫组化检测图；

图12为心梗小鼠4周后心肌梗死区的NLRP3阳性细胞数的免疫组化检测图；

图13为心梗小鼠4周后心肌梗死区的ASC阳性细胞数的免疫组化检测图；

图14为心梗小鼠4周后梗死区的炎症因子IL-1β、pro-IL-1β、TNF-α蛋白表达水平的Western blot检测结果；

图15为心梗小鼠4周后梗死区NLRP3信号通路分子NLRP3、ASC、Caspase-1-p40、Caspase-1-p20和Caspase-1-p10的蛋白表达水平的Western blot检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中，ABT-263购买自美国MedChemExpress公司，货号HY-10087；卡托普利也购自美国MedChemExpress公司，货号HY-B0368。

实施例1

检测心梗以及给予药物处理4周后小鼠的心功能和梗死及周边区纤维化水平

(一)构建小鼠心肌梗死(MI)模型

使用12月龄野生型(WT)小鼠(购买自北京维通利华实验动物技术有限公司)进行心梗(MI)模型构建。禁食4-6小时后，用电子秤对每只小鼠称重并记录。根据体重，给与小鼠戊巴比妥钠进行麻醉，注射方式为腹腔注射剂量按照50mg/kg进行计算。固定小鼠四肢，手术区域皮毛消毒处理后，使用备皮刀刮去小鼠颈胸部毛发。分离皮肤、肌肉等组织以使气管暴露，打开并连接动物呼吸机，观察到胸廓随机器频率规律起伏后固定。外科手术剪剪开小鼠胸前皮肤，约1厘米长斜切口，钝性分离胸前肌肉，暴露肋骨、肋间肌，找到第三肋间隙，钝头弯镊刺破肋间肌及胸膜，伸入自制拉钩固定胸骨，弯头镊钝性分离肋间肌，撑开肋骨，暴露心脏，探查左心耳，直视下用无菌缝合线结扎小鼠的心肌和血管，外科结确认牢固，张力适宜，结扎后局部心肌组织明显由红润变苍白。拔去气管插管针，见小鼠恢复正常呼吸心跳，置于保温电热毯上保持体温待其苏醒，进行编号。假手术组仅对小鼠进行开胸及进针、出针处理，并不结扎血管，其余步骤均与心肌梗死建模相同。

(二)小鼠MI模型分组以及分别使用生理盐水、衰老细胞清除剂ABT263、卡托普利、ABT263联合卡托普利灌胃

将实验动物分为5个组：(1)12月龄WT+MI小鼠未结扎LAD的假手术组(WT+sham组，n＝8)；(2)建模成功后存活的WT+MI心肌梗死小鼠随机分为心肌梗死未治疗组(MI组，n＝10)；(3)心肌梗死卡托普利(Captopril)治疗组(MI+Captopril组，16.67mg/kg，n＝10)；(4)心肌梗死ABT263治疗组(MI+ABT263组，50mg/kg，n＝10)；(5)心肌梗死ABT263联合卡托普利和治疗组(MI+ABT263+Captopril组，ABT26350mg/kg，Captopril 16.67mg/kg，n＝10)；心肌梗死造模当天开始灌胃给与ABT263、卡托普利治疗，连续给药28天。假手术组和心梗MI未治疗组进行生理盐水灌胃。下述统计图中呈现平均值(Mean)±标准误(SEM)，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001与WT+sham组相比；#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001与WT+MI组相比；&P<0.05,&&P<0.01,&&&P<0.001与WT+MI+ABT263组相比；@P<0.05,@@P<0.01,@@@P<0.001与WT+MI+卡托普利(Captopril)组相比。

(三)评估心梗以及给予药物处理4周后小鼠的心功能和梗死区纤维化水平

分别在心肌梗死造模前以及造模和给予相应药物处理4周后进行心脏超声心动图检测。使用高分辨率成像系统检测小鼠心脏，于长轴和短轴方向测量左室收缩末期内径(LVESD)，左室舒张末期内径(LVEDD)，室厚壁厚度(LVPWT)，室间隔厚度(IVST)，并计算左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)，评估小鼠心功能；ELISA技术检测外周血清脑钠尿肽(BNP)水平。进一步将小鼠以1％戊巴比妥钠麻醉，眼球取血后脱颈椎处死，打开胸腔，冲洗心脏干净后剪下，滤纸上去除周围组织。心脏标本取心尖部于4％的多聚甲醛中固定24h以上，梯度乙醇脱水，二甲苯透明石蜡包埋。石蜡切片厚度为5μm，37℃烘箱内烤片24h。通过免疫组织化学染色检测纤维化相关蛋白α-SMA和Collagen I，炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和RANTES，NLRP3信号通路分子NLRP3和ASC。其余心脏组织用于提取心脏蛋白，通过Western Blot检测纤维化相关蛋白α-SMA和Collagen I，炎症因子IL-1β、pro-IL-1β和TNF-α，以及NLRP3信号通路分子NLRP3、ASC、Caspase-1-p40、Caspase-1-p20和Caspase-1-p10的蛋白表达水平。

结果见图1-7：

图1为各处理组小鼠的左心室射血分数(LVEF)及左心室缩短分数(LVFS)的统计图，其中图1A为左心室射血分数(LVEF)统计图，图1B为左心室缩短分数(LVFS)统计图，由图1可以看出，与假手术(sham)组小鼠相比，MI造模4周后小鼠的LVEF和LVFS水平明显下降；与MI+生理盐水组相比，给予衰老细胞清除剂ABT263处理，心梗后4周小鼠的LVEF明显增高，但是ABT263单药治疗效果仍然不如卡托普利单药治疗效果，联合使用ABT263和卡托普利明显增加MI小鼠的LVEF和LVFS水平。

图2为各处理组小鼠心肌组织的Masson染色图，显示梗死区胶原(collagen)面积，图3为各处理组小鼠心肌组织胶原面积统计图。由图2和3可以看出：与假手术(sham)组相比，心梗造模后小鼠心肌梗死区胶原面积明显增加；与MI+生理盐水组相比，ABT263给药组心肌梗死区胶原面积明显减少；ABT263单药效果与卡托普利单药效果无明显差异；联合使用ABT263和卡托普利较单独使用ABT263或卡托普利相比，心肌梗死区胶原面积减少。

图4为各处理组小鼠心肌组织心肌梗死区纤维化蛋白1型胶原(Collagen I)阳性面积的免疫组织化学检测结果，可以看出，与假手术(sham)组相比，心梗造模后小鼠心肌梗死区Collagen I阳性面积明显增加；与MI+生理盐水组相比，ABT263给药组心肌梗死区纤维化蛋白Collagen I阳性面积减少；ABT263单药治疗后的Collagen I阳性面积仍高于卡托普利单药治疗组；联合使用ABT263和卡托普利较单独使用ABT263或卡托普利相比，心肌梗死区Collagen I阳性面积明显减少。

图5为各处理组小鼠心肌组织心肌梗死区纤维化蛋白α-SMA阳性面积的免疫组织化学检测结果，可以看出，与假手术(sham)组相比，心梗造模后小鼠心肌梗死区α-SMA阳性面积明显增加；与MI+生理盐水组相比，ABT263给药组心肌梗死区α-SMA阳性面积明显减少；ABT263单药治疗后梗死区α-SMA阳性面积与卡托普利单药处理相比无明显差异；联合使用ABT263和卡托普利较单独使用ABT263或卡托普利相比，心肌梗死区α-SMA阳性面积明显减少。

图6为各处理组小鼠外周血清脑钠尿肽(BNP)水平的ELISA检测结果，结果显示：与假手术(sham)组相比，心梗造模后小鼠外周血脑钠尿肽(BNP)水平明显升高；与MI+生理盐水组相比，ABT263单独给药组心梗后4周小鼠外周血BNP水平下降，卡托普利单独治疗较ABT263单独给药可进一步降低外周血BNP水平；联合使用ABT263和卡托普利较单独使用ABT263或卡托普利相比，小鼠外周血BNP水平明显下降。

图7为各处理组小鼠心肌组织纤维化蛋白Collagen I和α-SMA的表达水平的Western blot检测结果，其中图7A为Western blot检测图，图7B为统计图，可以看出，与假手术(sham)组相比，心梗造模后小鼠心肌组织纤维化蛋白Collagen I和α-SMA的表达水平明显增加；与MI+生理盐水组相比，ABT263治疗可明显降低心肌梗死区Collagen I和α-SMA蛋白的表达水平；与卡托普利单药处理相比，ABT263单药处理后Collagen I蛋白表达水平高，但是α-SMA蛋白表达水平已无明显差异；联合使用ABT263和卡托普利较单独使用ABT263或卡托普利相比，心肌梗死区Collagen I和α-SMA蛋白表达明显下降。

实施例2

检测心梗后ABT263和/或卡托普利治疗，心梗及周边区炎性水平和NLRP3信号通路分子组织学表达：

为了明确衰老细胞清除剂ABT263和/或卡托普利治疗是否纠正心梗后慢性炎症和NLRP3信号通路，使用12月龄WT小鼠进行心梗模型构建，再给予小鼠生理盐水、衰老细胞清除剂ABT263、卡托普利、ABT263联合卡托普利灌胃给药，心梗模型构建、动物模型分组以及小鼠生理盐水、衰老细胞清除剂ABT263、卡托普利和ABT263联合卡托普利灌胃等同实施例1。

通过免疫组化检测心梗小鼠4周后梗死区的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和RANTES水平，以及NLRP3信号通路相关蛋白NLRP3、ASC水平。

结果见8-13：

图8为心梗小鼠4周后心肌梗死区的炎症因子IL-1β阳性细胞数的免疫组化检测图，可以看出：与假手术组相比，心梗后4周小鼠梗死区炎症因子IL-1β阳性细胞数明显增加；与生理盐水组相比，衰老细胞清除剂ABT263治疗后梗死区IL-1β阳性细胞数明显减少；ABT263单药治疗比卡托普利更能减少IL-1β阳性细胞数；联合使用ABT263和卡托普利比单药使用ABT263或者卡托普利更能明显减少IL-1β阳性细胞数。

图9为心梗小鼠4周后心肌梗死区的炎症因子IL-6阳性细胞数的免疫组化检测图，可以看出，与假手术组相比，心梗造模后4周小鼠梗死区炎症因子IL-6阳性细胞数明显增加；与生理盐水组相比，衰老细胞清除剂ABT263或卡托普利单药治疗，梗死区IL-6阳性细胞数/面积明显减少，且ABT263或卡托普利单药治疗效果无差异；联合使用ABT263和卡托普利比单药使用ABT263或者卡托普利更能明显减少IL-6阳性细胞数。

图10为心梗小鼠4周后心肌梗死区的炎症因子TNF-α阳性细胞数的免疫组化检测图，可以看出，与假手术组相比，心梗造模后4周小鼠梗死区炎症因子TNF-α阳性细胞数明显增加；与生理盐水组相比，衰老细胞清除剂ABT263或卡托普利单药治疗，梗死区TNF-α阳性细胞数明显减少，且ABT263或卡托普利单药治疗效果无差异；联合使用ABT263和卡托普利比单药使用ABT263或者卡托普利更能明显减少TNF-α阳性细胞数。

图11为心梗小鼠4周后心肌梗死区的炎症因子RANTES阳性细胞数的免疫组化检测图，可以看出，与假手术组相比，心梗后4周小鼠梗死区炎症因子RANTES阳性细胞数明显增加；与生理盐水组相比，衰老细胞清除剂ABT263或卡托普利单药治疗，梗死区RANTES阳性细胞数明显减少；ABT263单药处理比卡托普利更能减少梗死区RANTES阳性细胞数/面积；联合使用ABT263和卡托普利比单药使用ABT263或者卡托普利更能明显减少RANTES阳性细胞数。

图12为心梗小鼠4周后心肌梗死区的NLRP3阳性细胞数的免疫组化检测图，可以看出，与假手术组相比，心梗后4周小鼠梗死区炎症因子NLRP3阳性细胞数明显增加；与生理盐水组相比，衰老细胞清除剂ABT263或卡托普利单药治疗，梗死区NLRP3阳性细胞数明显减少，且ABT263或卡托普利单药治疗效果无差异；联合使用ABT263和卡托普利比单药使用ABT263或者卡托普利更能明显减少NLRP3阳性细胞数。

图13为心梗小鼠4周后心肌梗死区的ASC阳性细胞数的免疫组化检测图，可以看出，与假手术组相比，心梗后4周小鼠梗死区炎症因子ASC阳性细胞数明显增加；与生理盐水组相比，衰老细胞清除剂ABT263或卡托普利单药治疗，梗死区ASC阳性细胞数明显减少,且ABT263或卡托普利单药治疗效果无差异；联合使用ABT263和卡托普利比单药使用ABT263或者卡托普利更能明显减少ASC阳性细胞数。

实施例3

检测心梗后ABT263和/或卡托普利治疗，心梗及周边区炎性水平和NLRP3信号通路分子蛋白表达水平：

为了进一步明确衰老细胞清除剂ABT263和/或卡托普利治疗心梗后慢性炎症和NLRP3信号通路相关蛋白表达水平的变化，使用12月龄WT小鼠进行心梗模型构建，再给予小鼠生理盐水、衰老细胞清除剂ABT263、卡托普利和ABT263联合卡托普利灌胃给药，同实施例1。通过免疫印迹检测心梗小鼠4周后梗死区的炎症因子IL-1β、pro-IL-1β、TNF-α和NLRP3信号通路相关蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1-p40、Caspase-1-p20和Caspase-1-p10。

结果见图14-15：

图14为心梗小鼠4周后梗死区的炎症因子IL-1β、pro-IL-1β、TNF-α蛋白表达水平的Western blot检测结果，其中图14A为Western blot检测图，图14B为统计结果，可以看出：与假手术组相比，心梗后4周小鼠梗死区炎症因子IL-1β、pro-IL-1β、TNF-α蛋白表达水平明显增加；与生理盐水组相比，衰老细胞清除剂ABT263治疗后梗死区IL-1β、pro-IL-1β、TNF-α蛋白表达水平明显减少；卡托普利单药治疗比ABT263单药治疗更能减少IL-1β、pro-IL-1β、TNF-α蛋白表达水平；联合使用ABT263和卡托普利能明显减少IL-1β、pro-IL-1β、TNF-α蛋白表达水平。

图15为心梗小鼠4周后梗死区NLRP3信号通路分子NLRP3、ASC、Caspase-1-p40、Caspase-1-p20和Caspase-1-p10的蛋白表达水平的Western blot检测结果，可以看出：衰老细胞清除剂ABT263可以明显抑制NLRP3、ASC、Caspase-1-p40、Caspase-1-p20和Caspase-1-p10的蛋白表达；卡托普利单药治疗效果在上述部分分子表达优于ABT263；联合使用ABT263和卡托普利治疗，比单药使用ABT263或者卡托普利能更好地降低心梗4周后心梗区NLRP3、ASC、Caspase-1-p40、Caspase-1-p20和Caspase-1-p10的蛋白表达。

Claims (2)

1.ABT-263联合血管紧张素转换酶抑制剂在制备治疗心肌梗死后心室重塑的产品中的应用，所述血管紧张素转换酶抑制剂为卡托普利；所述ABT-263和血管紧张素转换酶抑制剂的重量比为3:1。

2.一种治疗心肌梗死后心室重塑的产品，其特征在于，其以ABT-263和血管紧张素转换酶抑制剂为主要活性成分，所述血管紧张素转换酶抑制剂为卡托普利；所述产品中，ABT-263和血管紧张素转换酶抑制剂的重量比为3:1。

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