CN113699178A - 一种以芦竹花穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种以芦竹花穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法，包括(1)外植体芦竹花穗的处理；(2)愈伤组织的增殖；(3)农杆菌的培养；(4)侵染与共培养；(5)筛选培养；(6)分化培养；(7)生根培养。本发明首次利用芦竹花穗诱导愈伤组织通过农杆菌介导法建立了芦竹的遗传转化体系,成功实现了以芦竹花穗愈伤组织为外植体的受体材料，通过农杆菌介导及后期筛选，成功获得含有GuS基因的转基因植株，为芦竹转基因工程提供研究基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养及遗传转化，具体涉及一种以芦竹花穗诱导愈伤组织为外 植体遗传转化方法。
背景技术
芦竹属禾本科,芦竹属,其为芦竹属惟一广泛分布的种，植株高大直立，根系发达，为多年生丛生草本植物。芦竹由于生物量大,适应性强,分布范围广,能够在边际土地生长，非常有潜力成为缓解我国能源紧张的重要能源牧草之一。自然状态下的能源植物并 不是最理想的生产物种，虽然通过引进良种与当地植物杂交后筛选培育能够培育一些品 种，但这些技术手段已不能满足当今社会对能源植物的需求。随着转基因技术的不断进 步，利用转基因技术培育高产、优质、高效新型能源植物新品种也取得了相应的成果。 转基因技术在玉米、大豆和棉花等主要农作物上都得到了较好的应用。通过转基因技术 能够提高植物的生物量、降低植物中木质纤维素的含量、培育抗性品种等。转基因技术 的成功依赖于一个良好的转化系统，能有效地将外源基因导入受体细胞，并得以表达。 目前，关于能源植物芦竹的转基因技术还尚未报道，但其他能源牧草植物，如柳枝蓟、 芒等均在基因改良方面均有研究，故加快芦竹的转基因技术，势不可挡。在外源基因的 介导转化过程中，农杆菌转化法在单子叶植物中应用最为广泛，其主要优点有：培育周 期短、技术成熟、能够转化较大的外源基因片段，外源基因重排少，且以单拷贝或低拷 贝插入受体细胞，稳定性好等。在目前关于芦竹的遗传转化体系还未曾报道，但关于其 同属的植物有相关报道，以芦竹属的菌草绿洲3号的愈伤组织为受体材料，通过预培养 三天，于农杆菌OD600值为0.1侵染10min，共培养基中添加300μmol·L－1AS的 条件下，共培养1d的GuS表达率最高为1.5％,初步建立了农杆菌介导的绿洲3号愈伤组 织转化体系，但其转化效率低，且也没有得到转基因植株。故建立一种稳定、高效的芦 竹遗传转化体系，是研究芦竹抗性遗传机理的重要的方法手段。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种以芦竹花穗诱导愈伤组织为外植 体遗传转化方法，以用于芦竹转基因的研究。
本发明是通过下述技术方案实现的：
一种芦竹花穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法，其包括如下步骤：
(1)外植体芦竹花穗的处理：将芦竹花穗用无菌水冲洗，再用含水乙醇浸泡，用无菌水冲洗后再用氯化汞(又称升汞)溶液浸泡，用无菌水冲洗，将花穗放置于接种盘中， 待其水分晾干，将花穗放置于愈伤组织诱导培养基中，培养得到初代愈伤组织；
(2)愈伤组织的增殖：将步骤1中得到的初代愈伤组织转入到愈伤组织增殖培养基中，培养获得具有同质性的愈伤组织；
(3)农杆菌的培养：将含有携带卡那霉素抗性基因的双元载体的农杆菌单菌，放入LB培养液中，培养，待OD600至0.6～0.8时，降温，离心，弃上清液，得到农杆菌悬 浮液，将所述农杆菌悬浮液与重悬液混合，配制成农杆菌侵染液，培养,得农杆菌侵染 液；所述重悬液培养基中含有水解酪蛋白和抗坏血酸；
(4)侵染与共培养：将步骤2获得的愈伤组织放入步骤3得到的农杆菌侵染液中，培养后将侵染液倒掉，将侵染后的愈伤组织放入滤纸上静置后，放入共培养培养基中， 培养，得共培养好的愈伤组织；所述共培养培养基中含有水解酪蛋白和抗坏血酸；
(5)筛选培养：将步骤4中共培养好的愈伤组织放在筛选培养基上，进行抗性愈伤组织的筛选，得到抗性愈伤组织；
(6)分化培养：将步骤5中得到的抗性愈伤组织放到分化培养基上，进行分化培养得抗性芽；(7)生根培养：将步骤6中的到的抗性芽放到生根培养基上，进行生根成 苗，最终得到芦竹转基因植株。
本发明步骤(1)中所述的无菌水冲洗10-60s，优选30s。所述含水乙醇为50-95％乙醇，优选75％乙醇。所述氯化汞溶液俗称升汞溶液，其浓度为0.5-0.2％。其配置方法： 称取0.1g氯化汞，加纯水溶解并定容至100ml。
本发明所述步骤(1)中芦竹愈伤组织诱导的培养基成分包括：MS基本培养基、2，4-D 1-3mg/L、KT 0.05-0.15mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH 5-6.5。 优选，培养基成分包括MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT 0.1mg/L、蔗糖30.0g/L、 植物凝胶3g/L，pH 6.0。步骤(1)中所述培养条件为20-30℃下暗培养20-30天。优 选，25℃下暗培养24天。
本发明所述步骤(2)中芦竹愈伤组织增殖的培养基成分包括：MS基本培养基、2,4-D 4-6.0mg/L、KT 0.05-0.15mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH5.0-6.5。 优选培养基成分包括：MS基本培养基、2,4-D 4.0mg/L、KT 0.1mg/L、蔗糖30.0g/L、 植物凝胶3g/L，pH 6.0。步骤(2)中所述培养条件为20-28℃下暗培养28-35天。优 选，25℃下暗培养30天，每4周更新一次培养基。花穗属于外植体的一种，在进行第 一次诱导愈伤组织时，4周后，其形成的愈伤组织团较小，且状态较差，不适合作为转 化的材料，故进行第二次的增殖培养，经过增殖培养的愈伤组织整体状态较好，有助于 提高转化率。
进一步优选，步骤(1)外植体芦竹花穗的处理：将芦竹花穗剪成大约5cm长度，用无菌水冲洗30s，倒掉废水，再用75％乙醇浸泡30s，倒掉废液，用无菌水冲洗30s，倒 掉废水后再用0.1％升汞浸泡10min，后将其捞出，用无菌水冲洗数遍，将花穗放置于接 种盘中，放置2min，待其水分晾干，将花穗放置于愈伤组织诱导培养基中，于25℃下 暗培养24d，得到初代愈伤组织。
本发明步骤(3)中LB培养液包含：5-15g/L蛋白胨、4-6g/L酵母、5-15g/L氯化 钠、80-120mg/L卡那霉素；150-250μl农杆菌菌液；优选，LB培养液包含：10g/L蛋 白胨、5g/L酵母、10g/L氯化钠、100mg/L卡那霉素；200μl农杆菌菌液。培养条件为 20-28℃、200-400rmp下震荡12-14h；优选，25℃，280rmp下震荡12-14h。
本发明步骤(3)中所述重悬液中包含MS基本培养基、2，4-D 1.0-3.0mg/L、KT0.05-0.15mg/L、水解酪蛋白400-600mg/L、抗坏血酸5-15mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、 乙酰丁香酮150-250μmol/L，优选所述重悬液中包含MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、 KT 0.1mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、蔗糖30.0g/L、乙酰丁香酮200 μmol/L；培养条件为20-28℃、200-400rmp下震荡1-3h；优选25℃，280rmp下震荡 2h。
所述步骤(3)中含有携带卡那霉素抗性基因的双元载体的农杆菌，所述农杆菌菌株 为EHA105或AGLI,所述双元载体含有卡那霉素抗性基因(npt II)基因，还含有一个或一个以上的不同目的基因。
进一步优选，步骤(3)农杆菌的培养：将农杆菌单菌(含有携带卡那霉素抗性基因npt II的双元载体)抽取200μl放入LB培养液中，于25℃、280rmp下震荡培养12-14h， 待OD600至0.6～0.8时，于4℃、10000rmp弃上清液，得到农杆菌悬浮液，将所述农 杆菌悬浮液与重悬液混合，配制成农杆菌侵染液，在25℃、280rmp下震荡培养2h；
本发明步骤(3)通过在重悬液培养基中加入水解酪蛋白、抗坏血酸等物质，调整培养温度和培养时间，提高了芦竹的遗传转化效率，并成功获得芦竹转基因植株。解决了 目前芦竹遗传转化效率低的问题。由于水解酪蛋白为一种添加物，能够促进愈伤组织或 细胞的生长，抗坏血酸常作为抗氧化剂，可以降低组织或细胞引起的褐变，从而提高愈 伤组织转化效率。
本发明所述步骤(4)中共培养培养基成分包含：MS基本培养基、2，4-D 1.0-3.0mg/L、 KT0.05-0.15mg/L、水解酪蛋白400-600mg/L、抗坏血酸5-15mg/L、乙酰丁香酮150-250 μmol/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH5.0-6.5。优选，共培养培养基成 分包含：MS基本培养基、2，4-D2.0mg/L、KT0.1mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸 10mg/L、乙酰丁香酮200μmol/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0。
本发明所述共培养条件对遗传转化成功的影响极为关键，28℃是农杆菌生长的最适 温度，但温度降低会促使农杆菌的侵染活力更高，故选择25℃作为最佳培养温度(例如步骤3中农杆菌培养温度)，共培养时间过长会导致植物材料坏死，共培养时间过短， 会使农杆菌还没来得及附着就会被抗生素杀死，故需要适宜的培养温度与培养时间来促 使转化成功。因此，在25℃、250-300rmp下震荡培养5-15min，于25℃、黑暗中共培 养2-4天。优选，25℃、280rmp下震荡培养10min，于25℃、黑暗中共培养3天。
本发明所述步骤(5)中筛选培养基成分包含：MS基本培养基、2，4-D 1.0-3.0mg/L、KT 0.5-0.15mg/L、水解酪蛋白400-600mg/L、抗坏血酸5-15mg/L、卡那霉素 80-120mg/L、头孢霉素180-220mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH 5.0- 6.5。优选，筛选培养基成分包含：MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT 0.1mg/L、水 解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、卡那霉素100mg/L、头孢霉素200mg/L、蔗糖 30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0。由于筛选培养基中含有抗生素，故侵染成功的愈伤 组织会继续生长，而未侵染成功的愈伤组织则会褐化死亡，此步骤尤为关键，此培养条 件为25℃，12h光/12h暗，四周换一次培养基，此阶段培养周期为2个月。
所述步骤(6)分化培养基成分包含：MS基本培养基、IBA 0.1-0.3mg/L、6-BA 1.0-3.0mg/L、水解酪蛋白400-600mg/L、抗坏血酸5-15mg/L、卡那霉素40-60mg/L、头 孢霉素180-220mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH 5.0-6.5。优选，分 化培养基成分包含：MS基本培养基、IBA 0.2mg/L、6-BA 2.0mg/L、水解酪蛋白500mg/L、 抗坏血酸10mg/L、卡那霉素50mg/L、头孢霉素200mg/L、蔗糖20g/L、植物凝胶3g/L， pH 6.0。
本发明所述步骤7中生根培养基成分包含：1/2MS基本培养基、NAA 0.1-0.3mg/L、6-BA 1.0-3.0mg/L、卡那霉素20-40mg/L、头孢霉素180-220mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、 植物凝胶2-4g/L，pH 5.0-6.5。优选，生根培养基成分包含：1/2MS基本培养基、NAA 0.2mg/L、6-BA 2.0mg/L、卡那霉素30mg/L、头孢霉素200mg/L、蔗糖20g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0。
技术术语
所述的2，4-D是2，4-二氯苯氧乙酸
KT是激动素
Kan是卡那霉素(Kanamycin)；
Cef是头孢霉素(Cefotaxime)；
AS是乙酰丁香酮；
NAA是萘乙酸；
IBA是吲哚丁酸；
6-BA是6-苄基腺嘌呤。
有益效果
1.本发明首次利用芦竹花穗诱导愈伤组织通过农杆菌介导法建立了芦竹的遗传转化 体系,成功实现了以芦竹花穗愈伤组织为外植体的受体材料，通过农杆菌介导及后期筛 选，成功获得含有GuS基因的转基因植株，为芦竹转基因工程提供研究基础。
2.转化效率高：本发明通过在培养基中加入水解酪蛋白和抗坏血酸，能够降低愈伤 组织的褐化，提高了转化效率,并成功获得芦竹转基因植株。研究表明，水解酪蛋白可以提高植物愈伤组织的诱导率、改善愈伤组织的质量以及提高再生率；抗坏血酸属于抗 氧化剂，能够起到保护细胞不被氧化的作用，减少愈伤组织的褐化，促进农杆菌的侵染， 提高转化率.通过添加水解酪蛋白和抗坏血酸的实验结果显示，单加水解酪蛋白和单加 抗坏血酸都能够起到促进愈伤组织分化和抑制褐变的作用，但同时加入水解酪蛋白为 500mg/L和抗坏血酸10mg/L时，芦竹愈伤组织的分化率最高，褐变率最低。具体数据件 表6与表7。
3.成本低廉：本发明首次利用价格低廉的卡那霉素作为转基因芦竹植物的抗性筛选 试剂，从而极大降低了转基因芦竹的成本。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得 明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。
下面为本发明的实施案例，对本发明的具体实施方式作进一步的描述。以下实施案例用 于说明本发明，但不限制本发明的范围。
实施例1
(1)外植物芦竹花穗的处理：在七月份采摘刚冒头的芦竹花穗，将其叶鞘剥开，将其 花穗剥下，放入组培瓶中，带至无菌操作台上。在带有花穗的组培瓶中加入无菌水清洗30s， 后将废液倒至废瓶中。再将75％的酒精倒入组培瓶中，冲洗一遍30s，倒掉废水后再用0.1％ 升汞浸泡10min，其后将其捞出，用无菌水冲洗数遍30s，将花穗放置于接种盘中，放置2min， 待其水分晾干，将花穗放置于含有MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT 0.1mg/L、蔗糖30.0g/L、 植物凝胶3g/L，pH 6.0中，于25℃黑暗培养24天，得到初步愈伤组织。先用清水洗，是 将花穗表面的泥土及肉眼可见的脏物清洗干净；酒精清洗是进一步消毒；由于花穗长时间暴 露在外面，故其沾染菌类较多，用升汞消毒的更彻底。
(2)愈伤组织的增值：经过24天后，将步骤(1)中得到的初愈伤组织转入到含有MS基本培养基、2，4-D 4.0mg/L、KT 0.1mg/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0的增 殖培养基中，使其愈伤组织团不断增大。25℃下暗培养30天，每4周更新一次培养基。第 一次愈伤组织诱导培养，得到的愈伤组织状态差，不适合进行转化；经过第二次的愈伤组织 增殖培养，能够得到状态好的愈伤组织，能够提高转化率。
(3)农杆菌的培养：提前制备好100mlLB培养液，LB培养液中包含10g/L蛋白胨、5g/L 酵母、10g/L氯化钠、100mg/L卡那霉素；提前制备好100ml重悬液，重悬液中包含MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT 0.1mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、蔗糖30.0g/L、乙酰丁香酮200μmol/L。挑取含携带卡那霉素抗性基因的双元载体的农杆菌单菌落200μl放入LB培养液中，于25℃、280rmp下震荡培养12-14h，待OD600至0.6～0.8时，LB菌 液呈现土黄色，停止震荡，转移至50ml离心管中，送至冷冻离心机，于4℃、10000rmp离 心，然后弃上清液得农杆菌悬浮液，将配制好的重悬液与弃上清液的农杆菌悬浮液混合，配 制成农杆菌侵染液，并进行重悬培养，即放置于25℃、280rmp下震荡培养2h得农杆菌浸染 液。
(4)浸染与共培养：挑取步骤2中得到的淡黄色、结构疏松且具有温润的光泽的愈伤 组织作为受体材料，将其放入步骤3得到的农杆菌侵染液中，在25℃、280rmp下震荡培养10min，后转移到无菌操作台上，倒掉侵染液，将侵染后的愈伤组织放入滤纸上静置2min，待愈伤组织表面略干，放入共培养培养基中，于25℃、黑暗下培养3d。共培养培养基成分 包含：MS基本培养基、2，4-D2.0mg/L、KT0.1mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、 乙酰丁香酮200μmol/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0。
(5)筛选培养：3天后，将步骤4中暗培养完毕的愈伤组织放入筛选培养基上，进行抗性愈伤组织筛选，由于筛选培养基中含有抗生素，故侵染成功的愈伤组织会继续生长，而未侵染成功的愈伤组织则会褐化死亡，此步骤尤为关键，此培养条件为25℃，12h光/12h暗，四周换一次培养基，此阶段培养周期为2个月。筛选培养基成分包含：MS基本培养基、 2，4-D 2.0mg/L、KT 0.1mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、卡那霉素100mg/L、 头孢霉素200mg/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0；(6)分化培养：在筛选培养基 上培养2两个月后，将筛选过后的、发育正常的愈伤组织转入到分化培养基上，进行分化培 养，此阶段为2个月，培养条件为25℃，12h光/12h暗，四周换一次培养基，愈伤组织由 淡黄色逐渐变为绿色，并长出数量芽体。分化培养基成分包含：MS基本培养基、IBA 0.2mg/L、 6-BA2.0mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、卡那霉素50mg/L、头孢霉素200mg/L、 蔗糖20g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0。
(7)生根培养：将长出的芽体放置于生根培养基上，进行生根壮苗，待小苗根系长至 5cm，移栽至花盆中进行炼苗，最终得到82株成活的植株。生根培养基成分包含：1/2MS基本 培养基NAA0.2mg/L、6-BA 2.0mg/L、卡那霉素30mg/L、头孢霉素200mg/L、蔗糖20g/L、植物 凝胶3g/L，pH 6.0。
通过GUS染色鉴定遗传转化效率。取步骤7中培养1个月的植株，在GUS染液中于25℃ 浸泡过夜，显示蓝色的植株具有GUS活性，为阳性植株。共得到12株阳性植株，转化效率为14.6％。
实施例2
(1)外植物芦竹花穗的处理：在七月份采摘刚冒头的芦竹花穗，将其叶鞘剥开，将其 花穗剥下，放入组培瓶中，带至无菌操作台上。在带有花穗的组培瓶中加入无菌水清洗60S， 后将废液倒至废瓶中。再将85％的酒精倒入组培瓶中，冲洗一遍，倒掉废水后再用0.2％升汞 浸泡10min，其后将其捞出，用无菌水冲洗数遍，将花穗放置于接种盘中，放置2min，待其 水分晾干，将花穗放置于含有MS基本培养基、2，4-D 3.0mg/L、KT 0.15mg/L、蔗糖40.0g/L、 植物凝胶4g/L，pH 6.0中，于25℃黑暗培养24天，得到初步愈伤组织。
(2)愈伤组织的增值：经过24天后，将步骤(1)中得到的初愈伤组织转入到含有MS基本培养基、2，4-D 6.0mg/L、KT 0.15mg/L、蔗糖40.0g/L、植物凝胶4g/L，pH 6.0的增殖 培养基中，使其愈伤组织团不断增大。25℃下暗培养30天，每4周更新一次培养基。
(3)农杆菌的培养：提前制备好100mlLB培养液，LB培养液中包含15g/L蛋白胨、6g/L 酵母、15g/L氯化钠、120mg/L卡那霉素；提前制备好100ml重悬液，重悬液中包含MS基本培养基、2，4-D 3.0mg/L、KT 0.15mg/L、水解酪蛋白600mg/L、抗坏血酸15mg/L、蔗糖40.0g/L、乙酰丁香酮250μmol/L。挑取含携带卡那霉素抗性基因的双元载体的农杆菌单菌落250μl放入LB培养液中，于25℃、280rmp下震荡培养12-14h，待OD600至0.6～0.8时，LB菌液呈现土黄色，停止震荡，转移至50ml离心管中，送至冷冻离心机，于4℃、10000rmp离心，然后 弃上清液得农杆菌悬浮液，将配制好的重悬液与弃上清液的农杆菌悬浮液混合，配制成农杆菌侵染液，并进行重悬培养，即放置于25℃、280rmp下震荡培养2h得农杆菌浸染液。
(4)浸染与共培养：挑取步骤2中得到的淡黄色、结构疏松且具有温润的光泽的愈伤组 织作为受体材料，将其放入步骤3得到的农杆菌侵染液中，在25℃、280rmp下震荡培养10min， 后转移到无菌操作台上，倒掉侵染液，将侵染后的愈伤组织放入滤纸上静置2min，待愈伤组 织表面略干，放入共培养培养基中，于25℃、黑暗下培养3d。共培养培养基成分包含：MS 基本培养基、2，4-D3.0mg/L、KT0.15mg/L、水解酪蛋白600mg/L、抗坏血酸15mg/L、乙酰 丁香酮250μmol/L、蔗糖40.0g/L、植物凝胶4g/L，pH 6.0。
(5)筛选培养：3天后，将步骤4中暗培养完毕的愈伤组织放入筛选培养基上，进行抗 性愈伤组织筛选，由于筛选培养基中含有抗生素，故侵染成功的愈伤组织会继续生长，而未 侵染成功的愈伤组织则会褐化死亡，此步骤尤为关键，此培养条件为25℃，12h光/12h暗， 四周换一次培养基，此阶段培养周期为2个月。筛选培养基成分包含：MS基本培养基、2，4-D 3.0mg/L、KT 0.15mg/L、水解酪蛋白600mg/L、抗坏血酸15mg/L、卡那霉素120mg/L、头孢霉素220mg/L、蔗糖40.0g/L、植物凝胶4g/L，pH 6.0。
(6)分化培养：在筛选培养基上培养2两个月后，将筛选过后的、发育正常的愈伤组织 转入到分化培养基上，进行分化培养，此阶段为2个月，培养条件为25℃，12h光/12h暗，四 周换一次培养基，愈伤组织由淡黄色逐渐变为绿色，并长出数量芽体。分化培养基成分包含： MS基本培养基、IBA 0.3mg/L、6-BA 3.0mg/L、水解酪蛋白600mg/L、抗坏血酸15mg/L、卡 那霉素60mg/L、头孢霉素220mg/L、蔗糖40g/L、植物凝胶4g/L，pH 6.0。
(7)生根培养：将长出的芽体放置于生根培养基上，进行生根壮苗，待小苗根系长至 5cm，移栽至花盆中进行炼苗，最终得到61株成活的植株。生根培养基成分包含：1/2MS基本 培养基NAA0.3mg/L、6-BA 3.0mg/L、卡那霉素40mg/L、头孢霉素220mg/L、蔗糖40g/L、植物 凝胶4g/L，pH 6.0。
通过GUS染色鉴定遗传转化效率。取步骤7中培养1个月的植株，在GUS染液中于25℃ 浸泡过夜，显示蓝色的植株具有GUS活性，为阳性植株。共得到5株阳性植株，转化效率为8.2％。
实施例3
(1)外植物芦竹花穗的处理：在七月份采摘刚冒头的芦竹花穗，将其叶鞘剥开，将其 花穗剥下，放入组培瓶中，带至无菌操作台上。在带有花穗的组培瓶中加入无菌水清洗10s， 后将废液倒至废瓶中。再将70％的酒精倒入组培瓶中，冲洗一遍，倒掉废水后再用0.1％升汞 浸泡10min，其后将其捞出，用无菌水冲洗数遍，将花穗放置于接种盘中，放置2min，待其 水分晾干，将花穗放置于含有MS基本培养基、2，4-D 1.0mg/L、KT 0.05mg/L、蔗糖20.0g/L、 植物凝胶2g/L，pH 6.0中，于25℃黑暗培养24天，得到初步愈伤组织。
(2)愈伤组织的增值：经过24天后，将步骤(1)中得到的初愈伤组织转入到含有MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT 0.05mg/L、蔗糖20.0g/L、植物凝胶2g/L，pH 6.0的增殖 培养基中，使其愈伤组织团不断增大。25℃下暗培养30天，每4周更新一次培养基。
(3)农杆菌的培养：提前制备好100mlLB培养液，LB培养液中包含5g/L蛋白胨、4g/L酵母、5g/L氯化钠、80mg/L卡那霉素；提前制备好100ml重悬液，重悬液中包含MS基本培养基、2，4-D 1.0mg/L、KT 0.05mg/L、水解酪蛋白400mg/L、抗坏血酸5mg/L、蔗糖20.0g/L、 乙酰丁香酮150μmol/L。挑取含携带卡那霉素抗性基因的双元载体的农杆菌单菌150μl落 放入LB培养液中，于25℃、280rmp下震荡培养12-14h，待OD600至0.6～0.8时，LB菌液呈现 土黄色，停止震荡，转移至50ml离心管中，送至冷冻离心机，于4℃、10000rmp离心，然后 弃上清液得农杆菌悬浮液，将配制好的重悬液与弃上清液的农杆菌悬浮液混合，配制成农杆 菌侵染液，并进行重悬培养，即放置于25℃、280rmp下震荡培养2h得农杆菌浸染液。
(4)浸染与共培养：挑取步骤2中得到的淡黄色、结构疏松且具有温润的光泽的愈伤组 织作为受体材料，将其放入步骤3得到的农杆菌侵染液中，在25℃、280rmp下震荡培养10min， 后转移到无菌操作台上，倒掉侵染液，将侵染后的愈伤组织放入滤纸上静置2min，待愈伤组 织表面略干，放入共培养培养基中，于25℃、黑暗下培养3d。共培养培养基成分包含：MS 基本培养基、2，4-D1.0mg/L、KT0.05mg/L、水解酪蛋白400mg/L、抗坏血酸5mg/L、乙酰丁 香酮150μmol/L、蔗糖20.0g/L、植物凝胶2g/L，pH 6.0。
(5)筛选培养：3天后，将步骤4中暗培养完毕的愈伤组织放入筛选培养基上，进行抗 性愈伤组织筛选，由于筛选培养基中含有抗生素，故侵染成功的愈伤组织会继续生长，而未 侵染成功的愈伤组织则会褐化死亡，此步骤尤为关键，此培养条件为25℃，12h光/12h暗， 四周换一次培养基，此阶段培养周期为2个月。筛选培养基成分包含：MS基本培养基、2，4-D 1.0mg/L、KT 0.05mg/L、水解酪蛋白400mg/L、抗坏血酸5mg/L、卡那霉素80mg/L、头孢霉素220mg/L、蔗糖20.0g/L、植物凝胶2g/L，pH 6.0。
(6)分化培养：在筛选培养基上培养2两个月后，将筛选过后的、发育正常的愈伤组织 转入到分化培养基上，进行分化培养，此阶段为2个月，培养条件为25℃，12h光/12h暗，四 周换一次培养基，愈伤组织由淡黄色逐渐变为绿色，并长出数量芽体。分化培养基成分包含： MS基本培养基、IBA 0.1mg/L、6-BA 1.0mg/L、水解酪蛋白400mg/L、抗坏血酸5mg/L、卡那 霉素40mg/L、头孢霉素180mg/L、蔗糖20g/L、植物凝胶2g/L，pH 6.0。
(7)生根培养：将长出的芽体放置于生根培养基上，进行生根壮苗，待小苗根系长至 5cm，移栽至花盆中进行炼苗，最终得到55株成活的植株。生根培养基成分包含：1/2MS基本 培养基NAA0.1mg/L、6-BA 1.0mg/L、卡那霉素20mg/L、头孢霉素220mg/L、蔗糖20g/L、植物 凝胶2g/L，pH 6.0。
通过GUS染色鉴定遗传转化效率。取步骤7中培养1个月的植株，在GUS染液中于25℃ 浸泡过夜，显示蓝色的植株具有GUS活性，为阳性植株。共得到3株阳性植株，转化效率为5.4％。
效果试验：
试验一：卡那霉素、头孢霉素配比的效果。
按照实施例1中的方法及试药，将卡那霉素、头孢霉素替换为下述表格中的数据即可， 结果见表1-3。
表1筛选培养基成中卡那霉素、头孢霉素配比筛选
| Kan度(mg/L) | Cef浓度(mg/L) | 阳性愈伤率/％ |
| 80 | 180 | 12％ |
| 100 | 200 | 26.60％ |
| 120 | 220 | 17.80％ |
表2分化培养基中卡那霉素、头孢霉素配比筛选
| Kan浓度(mg/L) | Cef浓度(mg/L) | 阳性芽率/％ |
| 40 | 180 | 39.60％ |
| 50 | 200 | 48.60％ |
| 60 | 220 | 40.10％ |
表3生根培养基中卡那霉素、头孢霉素配比筛选
试验二：外植物芦竹花穗的处理步骤的筛选
先用清水洗，是将花穗表面的泥土及肉眼可见的脏物清洗干净；酒精清洗是进一步消毒； 由于花穗长时间暴露在外面，故其沾染菌类较多，用升汞消毒的更彻底。具体数据见表4和 表5。
表4
表5
试验例三：协同效果实验
本发明通过在培养基中加入水解酪蛋白和抗坏血酸，能够降低愈伤组织的褐化，提高了 转化效率的协同效果，具体数据见表6和表7。
表6
表7
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本 发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的 范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种以芦竹花穗诱导愈伤组织为外植体遗传转化方法，其包括如下步骤：
(1)外植体芦竹花穗的处理：将芦竹花穗依次用无菌水冲洗，含水乙醇浸泡，无菌水冲洗，氯化汞溶液浸泡，用无菌水冲洗后，将花穗放置于接种盘中，待其水分晾干，将花穗放置于愈伤组织诱导培养基中，培养得到初代愈伤组织；
(2)愈伤组织的增殖：将步骤(1)中得到的初代愈伤组织转入到愈伤组织增殖培养基中，培养获得具有同质性的愈伤组织；
(3)农杆菌的培养：将含有携带卡那霉素抗性基因的双元载体的农杆菌单菌，放入LB培养液中，培养，待OD600至0.6～0.8时，降温，离心，弃上清液，得到农杆菌悬浮液，将所述农杆菌悬浮液与重悬液混合，配制成农杆菌侵染液，培养,得农杆菌侵染液；所述重悬液培养基中含有水解酪蛋白和抗坏血酸；
(4)侵染与共培养：将步骤(2)获得的愈伤组织放入步骤(3)得到的农杆菌侵染液中，培养后将侵染液倒掉，将侵染后的愈伤组织放入滤纸上静置后，放入共培养培养基中，培养，得共培养好的愈伤组织；所述共培养培养基中含有水解酪蛋白和抗坏血酸；
(5)筛选培养：将步骤(4)中共培养好的愈伤组织放在筛选培养基上，进行抗性愈伤组织的筛选，得到抗性愈伤组织；
(6)分化培养：将步骤(5)中得到的抗性愈伤组织放到分化培养基上，进行分化培养得抗性芽；
(7)生根培养：将步骤(6)中得到的抗性芽放到生根培养基上，进行生根成苗，最终得到芦竹转基因植株。
2.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于：所述步骤(1)无菌水冲洗10-60s，优选30s；所述含水乙醇为50-95％乙醇；所述氯化汞溶液浓度为0.05-0.2％。
3.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于：步骤(1)中芦竹愈伤组织诱导的培养基成分包括：MS基本培养基、2，4-D 1-3mg/L、KT 0.05-0.15mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH 5-6.5；优选，培养基成分包括MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT 0.1mg/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0；所述培养条件为20-30℃下暗培养20-30天；优选，25℃下暗培养24天。
4.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于：步骤(2)中芦竹愈伤组织增殖的培养基成分包括：MS基本培养基、2,4-D 4-6.0mg/L、KT 0.05-0.15mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH5.0-6.5；优选培养基成分包括：MS基本培养基、2,4-D 4.0mg/L、KT 0.1mg/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0；所述培养条件为20-28℃下暗培养28-35天，每4周更新一次培养基；优选，25℃下暗培养30天，每4周更新一次培养基。
5.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于：所述步骤(3)中LB培养液包含：5-15g/L蛋白胨、4-6g/L酵母、5-15g/L氯化钠、80-120mg/L卡那霉素；农杆菌菌液150-250μl；优选，LB培养液包含：10g/L蛋白胨、5g/L酵母、10g/L氯化钠、100mg/L卡那霉素；农杆菌菌液200μl，培养条件为20-28℃、200-400rmp下震荡12-14h；优选，25℃，280rmp下震荡12-14h；所述重悬液中包含MS基本培养基、2，4-D 1.0-3.0mg/L、KT 0.05-0.15mg/L、水解酪蛋白400-600mg/L、抗坏血酸5-15mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、乙酰丁香酮150-250μmol/L，优选所述重悬液中包含MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT 0.1mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、蔗糖30.0g/L、乙酰丁香酮200μmol/L；培养条件为20-28℃、200-400rmp下震荡1-3h；优选25℃，280rmp下震荡2h。
6.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于：步骤(4)中共培养培养基成分包含：MS基本培养基、2，4-D 1.0-3.0mg/L、KT0.05-0.15mg/L、水解酪蛋白400-600mg/L、抗坏血酸5-15mg/L、乙酰丁香酮150-250μmol/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH5.0-6.5；优选，共培养培养基成分包含：MS基本培养基、2，4-D2.0mg/L、KT0.1mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、乙酰丁香酮200μmol/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0；所述共培养条件在25℃、250-300rmp下震荡培养5-15min，于25℃、黑暗中共培养2-4天。优选，25℃、280rmp下震荡培养10min，于25℃、黑暗中共培养3天。
7.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于：步骤(5)中筛选培养基成分包含：MS基本培养基、2，4-D 1.0-3.0mg/L、KT 0.05-0.15mg/L、水解酪蛋白400-600mg/L、抗坏血酸5-15mg/L、卡那霉素80-120mg/L、头孢霉素180-220mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH 5.0-6.5。优选，筛选培养基成分包含：MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT 0.1mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、卡那霉素100mg/L、头孢霉素200mg/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0；培养条件为25℃，12h光/12h暗，四周换一次培养基，此阶段培养周期为2个月。
8.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于：所述步骤(6)分化培养基成分包含：MS基本培养基、IBA 0.1-0.3mg/L、6-BA 1.0-3.0mg/L、水解酪蛋白400-600mg/L、抗坏血酸5-15mg/L、卡那霉素40-60mg/L、头孢霉素180-220mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH 5.0-6.5；优选，分化培养基成分包含：MS基本培养基、IBA 0.2mg/L、6-BA 2.0mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、卡那霉素50mg/L、头孢霉素200mg/L、蔗糖20g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0。
9.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于：步骤(7)中生根培养基成分包含：1/2MS基本培养基、NAA 0.1-0.3mg/L、6-BA 1.0-3.0mg/L、卡那霉素20-40mg/L、头孢霉素180-220mg/L、蔗糖20.0-40.0g/L、植物凝胶2-4g/L，pH 5.0-6.5；优选，生根培养基成分包含：1/2MS基本培养基、NAA 0.2mg/L、6-BA 2.0mg/L、卡那霉素30mg/L、头孢霉素200mg/L、蔗糖20g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0。
10.如权利要求1所述的转化方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)外植物芦竹花穗的处理：在七月份采摘刚冒头的芦竹花穗，将其叶鞘剥开，将其花穗剥下，放入组培瓶中，带至无菌操作台上；在带有花穗的组培瓶中加入无菌水清洗30s，后将废液倒至废瓶中，再将75％的酒精倒入组培瓶中浸泡30s，倒掉废液，无菌水清洗30s，倒掉废水后再用0.1％升汞浸泡10min，其后将其捞出，用无菌水冲洗数遍，将花穗放置于接种盘中，放置2min，待其水分晾干，将花穗放置于含有MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT0.1mg/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0中，于25℃黑暗培养24天，得到初步愈伤组织；
(2)愈伤组织的增值：经过24天后，将步骤(1)中得到的初愈伤组织转入到含有MS基本培养基、2，4-D 4.0mg/L、KT 0.1mg/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0的增殖培养基中，使其愈伤组织团不断增大；
(3)农杆菌的培养：提前制备好100mlLB培养液，LB培养液中包含10g/L蛋白胨、5g/L酵母、10g/L氯化钠、100mg/L卡那霉素；制备好100ml重悬液，重悬液中包含MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT 0.1mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、蔗糖30.0g/L、乙酰丁香酮200μmol/L，挑取含携带卡那霉素抗性基因npt II的双元载体的农杆菌单菌落200μl放入LB培养液中，于25℃、280rmp下震荡培养12-14h，待OD600至0.6～0.8时，LB菌液呈现土黄色，停止震荡，转移至50ml离心管中，送至冷冻离心机，于4℃、10000rmp离心，然后弃上清液，将以前配制好的重悬液与弃上清液的农杆菌悬浮液混合，配制成农杆菌侵染液，并进行重悬培养，即放置于25℃、280rmp下震荡培养2h得农杆菌浸染液；
(4)浸染与共培养：挑取步骤2中得到的淡黄色、结构疏松且具有温润的光泽的愈伤组织作为受体材料，将其放入步骤(3)得到的农杆菌侵染液中，在25℃、280rmp下震荡培养10min，后转移到无菌操作台上，倒掉侵染液，将侵染后的愈伤组织放入滤纸上静置2min，待愈伤组织表面略干，放入共培养培养基中，于25℃、黑暗下培养3d；共培养培养基成分包含：MS基本培养基、2，4-D2.0mg/L、KT0.1mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、乙酰丁香酮200μmol/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0；
(5)筛选培养：3天后，将步骤(4)中暗培养完毕的愈伤组织放入筛选培养基上，进行抗性愈伤组织筛选，培养条件为25℃，12h光/12h暗，四周换一次培养基，此阶段培养周期为2个月。筛选培养基成分包含：MS基本培养基、2，4-D 2.0mg/L、KT 0.1mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、卡那霉素100mg/L、头孢霉素200mg/L、蔗糖30.0g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0。
(6)分化培养：在筛选培养基上培养2两个月后，将筛选过后的、发育正常的愈伤组织转入到分化培养基上，进行分化培养，此阶段为2个月，培养条件为25℃，12h光/12h暗，四周换一次培养基，愈伤组织由淡黄色逐渐变为绿色，并长出数量芽体。分化培养基成分包含：MS基本培养基、IBA 0.2mg/L、6-BA 2.0mg/L、水解酪蛋白500mg/L、抗坏血酸10mg/L、卡那霉素50mg/L、头孢霉素200mg/L、蔗糖20g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0；
(7)生根培养：将长出的芽体放置于生根培养基上，进行生根壮苗，待小苗根系长至5cm，移栽至花盆中进行炼苗，最终得到芦竹转基因的植株；生根培养基成分包含：1/2MS基本培养基、NAA0.2mg/L、6-BA 2.0mg/L、卡那霉素30mg/L、头孢霉素200mg/L、蔗糖20g/L、植物凝胶3g/L，pH 6.0。
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