CN113694050B - 米托蒽醌和/或其可药用衍生物在制备抗疱疹病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了米托蒽醌和/或其可药用衍生物在制备抗疱疹病毒药物中的应用，本发明证实米托蒽醌或其药学上可接受的盐在无毒性浓度下能有效抑制HSV‑1、HSV‑2对细胞造成的细胞病变效应及可以抑制KSHV DNA复制及病毒粒子的产生，这说明米托蒽醌或其药学上可接受的盐具有良好的抗疱疹病毒的活性。本发明结果表明化合物米托蒽醌有潜力制备抗疱疹病毒感染的特异治疗药物，具有较好的临床应用前景。

Description

米托蒽醌和/或其可药用衍生物在制备抗疱疹病毒药物中的 应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及米托蒽醌和/或其可药用衍生物在制备抗疱疹病毒药物中的应用。

背景技术

疱疹病毒科(Herpesviridae)是一类有包膜的，基因组为双链DNA的病毒科。该科的成员能广泛地感染动物和人，并诱导相应疾病的产生。目前发现的能感染人的疱疹病毒有八种，主要包括：单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex virus-1，HSV-1)，单纯疱疹病毒II型(Herpes simplex virus-2，HSV-2)，水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus,VZV),EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)，人类疱疹病毒VI型(HHV-6)，人类疱疹病毒VII型(HHV-7)和卡波氏疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)。根据基因组序列和结构及理化性质的不同,疱疹病毒科又可以分为三个亚科：α-疱疹病毒亚科，β-疱疹病毒亚科和γ-疱疹病毒亚科。疱疹病毒生活周期分为典型的裂解期复制和潜伏期复制：在裂解期感染过程中，病毒基因组复制，产生大量成熟的病毒粒子，诱导多种疾病的发生；在潜伏期感染过程中，基因组处于静息状态，只有少量的病毒基因表达，但基因组随细胞基因组复制而复制,病毒的潜伏状态同样可以造成机体疾病的发生。

疱疹病毒的感染能够诱导多种疾病的产生，如造成人口、唇或生殖器的皮肤或粘液膜上出现水泡、角膜炎、胎儿畸形、智力障碍和感觉神经性耳聋、幼儿急疹等等，甚至能够引起多种肿瘤疾病的发生(如非霍金奇和霍金奇淋巴瘤、鼻咽癌、淋巴组织增生、卡波氏肉瘤等)。疱疹病毒感染严重影响人们的生命健康。

因此，有必要开发一种治疗或者预防疱疹病毒感染的药物。

发明内容

本发明目的是提供米托蒽醌和/或其可药用衍生物在制备抗疱疹病毒药物中的应用，本申请发现米托蒽醌对疱疹病毒有较强抑制作用，为疱疹病毒感染性疾病的治疗和预防提供了方向。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了米托蒽醌和/或其可药用衍生物在制备抗疱疹病毒药物中的应用。

进一步地，所述疱疹病毒包括卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、人类疱疹病毒VI型和人类疱疹病毒VII型中的至少一种。

进一步地，所述米托蒽醌可药用衍生物包括：米托蒽醌的药学上可接受的盐。

进一步地，所述米托蒽醌的药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐中的至少一种；所述的无机盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种；所述的有机盐包括甲磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、三氟乙酸盐、富马酸盐、柠檬酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、乳酸盐和苹果酸盐中的一种。本发明实施例具体可选用米托蒽醌的盐酸盐。作为一种具体的实施方式，可采用米托蒽醌、盐酸米托蒽醌和米托蒽醌甲磺酸盐。

进一步地，所述抗疱疹病毒药物还包括药学上可接受的辅料和载体。

进一步地，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂或着色剂中的至少一种。

进一步地，所述抗疱疹病毒药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中的至少一种。

进一步地，所述抗疱疹病毒药物的抗病毒的方式包括：抑制疱疹病毒在细胞内核酸复制、病毒蛋白的表达和感染。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1、本发明提供的米托蒽醌和/或其可药用衍生物在制备抗疱疹病毒药物中的应用，米托蒽醌或其药学上可接受的盐在实验中表现抗多种疱疹病毒的活性，说明米托蒽醌或其药学上可接受的盐具有广谱的抗疱疹病毒的活性。

2、米托蒽醌或其药学上可接受的盐在无毒性浓度下能有效抑制HSV-1、HSV-2对细胞造成的细胞病变效应及可以抑制KSHV DNA复制及病毒粒子的产生，这说明米托蒽醌或其药学上可接受的盐具有良好的抗疱疹病毒的活性。

3、米托蒽醌展现了抑制HSV-1、HSV-2及KSHV复制的活性，其抑制HSV-1、HSV-2及KSHV的IC₅₀均在纳摩尔水平，分别为及0.026微摩尔/升(26纳摩尔/升)、0.035微摩尔/升(35纳摩尔/升)及小于0.018微摩尔/升(18纳摩尔/升)。SI(选择指数)分别为123.07、86及738.9。而且米托蒽醌做一种临床用药，安全性良好。这说明米托蒽醌是低毒高效的抗疱疹病毒的药物。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1提供的米托蒽醌抗HSV-1的活性检测结果示意图；其中，图1A为米托蒽醌对Vero细胞的细胞毒性检测结果图；图1B为米托蒽醌抗HSV-1活性的结果图；

图2为本发明实施例2提供的米托蒽醌抗HSV-2的活性检测结果示意图；其中，图2A为米托蒽醌对Vero细胞的细胞毒性检测结果图；图2B为米托蒽醌抗HSV-2活性的结果图；

图3为本发明实施例3提供的米托蒽醌抑制KSHV病毒粒子产生的活性检测结果示意图；其中，图3A为米托蒽醌对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图；图3B为米托蒽醌抑制KSHV病毒粒子产生的活性检测结果图；

图4为本发明实施例4提供的米托蒽醌抑制KSHV DNA复制活性检测结果示意图；其中，图4A为米托蒽醌对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图；图4B为米托蒽醌抑制KS HVDNA复制活性检测结果图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

米托蒽醌，也称二羟蒽二酮，一种异喹啉型生物碱,英文名为Mitoxantrone。米托蒽醌是拓扑异构酶II(topoisomerase II)的抑制剂；也可抑制蛋白激酶C(PKC)。常制成盐酸盐供临床使用，主要用于治疗恶性淋巴瘤、乳腺癌和急性白血病等。但目前尚无米托蒽醌用于制备预防或治疗疱疹病毒的药物的报道。米托蒽醌的分子式为：C₂₂H₂₈N₄O6，CAS号为：65271-80-9，具有的结构式I所示的结构：

本申请的发明人对米托蒽醌小分子化合物进行抗疱疹病毒活性研究实验，实施例中的数据分析采用Graphpad软件进行统计分析，发现米托蒽醌对疱疹病毒有较强抑制作用，具体地：

本申请将米托蒽醌对Vero细胞的细胞毒性实验中，rism7软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(Median cyctoxic concentration，CC₅₀)，米托蒽醌对Vero细胞的CC₅₀约为3.2微摩尔/升。米托蒽醌使用的最大浓度小于3.2微摩尔/升，处于安全无毒性范围内。

本申请将米托蒽醌对抗HSV-1和HSV-2活性进行评估，通过标准的抗病毒活性测试方法对其进行活性测试。HSV-1和HSV-2都可以感染Vero，同时产生的细胞病变相似，因此利用相同的方法进行评价。提前24小时将Vero细胞接种到96孔板中，待细胞长满后，更换含2％血清的培养基，并接种病毒。病毒感染2小时后，分别用0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.025微摩尔/升、0.0125微摩尔/升的米托蒽醌处理细胞。每组三个重复。将细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，48小时后检测细胞活性。结果显示米托蒽醌抑制HSV-1复制的IC₅₀为0.026微摩尔/升，抑制HSV-2复制的IC₅₀为0.035微摩尔/升。表明米托蒽醌具有较好抑制HSV-1和HSV-2复制的活性，具体表现为可以抑制HSV-1和HSV-2病毒在细胞内核酸复制和病毒蛋白的表达，从而抑制病毒的增殖。

本申请将米托蒽醌对iSLK.219细胞的细胞毒性实验中，rism7软件计算药物对于细胞的半数中毒浓度(Median cyctoxic concentration，CC₅₀)，米托蒽醌对iSLK.219细胞的CC₅₀为13.3微摩尔/升。米托蒽醌使用的最大浓度小于13.3微摩尔/升，处于安全无毒性范围内。具体地，KSHV在多西环素和丁酸钠的诱导下才能进入裂解期复制，因此为了与抗KSHV裂解期复制实验一致，细胞毒性实验中米托蒽醌用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的细胞培养基进行梯度稀释。

本申请将米托蒽醌抗KSHV活性的评价：将iSLK.219细胞按照8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后,分别用浓度为：40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升、0.16微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.018微摩尔/升的米托蒽醌处理细胞，米托蒽醌用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的细胞培养基进行梯度稀释。每组重复三个孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。培养48小时后，收取上清添加到Vero细胞中，感染Vero细胞1个小时后更换新鲜的培养基，37℃、5％CO₂培养箱中培养。48小时后，利用高内涵细胞分析系统检测GFP表达水平。结果显示在实验浓度范围内米托蒽醌几乎能完全抑制KSHV病毒粒子的产生；由此可见KSHV感染性病毒粒子产生的半数抑制浓度(IC₅₀)小于实验最小浓度0.018微摩尔/升。同时，对iSLK.21 9细胞内KSHV DNA水平进行定量检测，结果显示米托蒽醌依赖地抑制KSHV DNA复制水平；对KSHV DNA复制的半数抑制浓度(IC₅₀)同样小于实验最小浓度0.018微摩尔/升。

本申请将米托蒽醌抗疱疹病毒广谱性分析：米托蒽醌或其药学上可接受的盐能剂量依赖地抑制KSHV DNA复制水平及可感染性病毒粒子的产生；剂量依赖地抑制HSV-1和HSV-2复制造成的细胞病变。说明其具有广谱的抑制疱疹病毒的活性，对其它疱疹病毒同样有一定的抗病毒活性。

综上可知，本发明结果表明化合物米托蒽醌对疱疹病毒具有抑制作用，有潜力用于制备治疗或预防疱疹病毒感染药物，具有较好的临床应用前景。

以上所述的疱疹病毒包括但不限于：选自卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、EB病毒(EBV)、单纯疱疹病毒I型(HSV-1)、单纯疱疹病毒II型(HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)、人类疱疹病毒VI型(HHV6)、或人类疱疹病毒VII型(HHV7)。

利用米托蒽醌或其药学上可接受的盐制备的治疗或预防疱疹病毒感染的药物，所述药物的剂型包括但不限于目前药学上可接受任何剂型，包括片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸或薄片。

本发明的米托蒽醌及其药学上可接受的盐或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物及其药学上可接受的盐可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物及其药学上可接受的盐制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物及其药学上可接受的盐与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物及其药学上可接受的盐先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物及其药学上可接受的盐片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物及其药学上可接受的盐的胶囊剂。

为将本发明化合物及其药学上可接受的盐制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

可以理解的是，以米托蒽醌为先导化合物进行进一步结构优化，用于制备治疗疱疹病毒感染性疾病药物也属于本发明想要保护的范围。其中，所述米托蒽醌可药用衍生物包括：米托蒽醌的药学上可接受的盐。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的米托蒽醌在制备抗疱疹病毒药物中的应用进行详细说明。

实施例1、米托蒽醌抗HSV-1活性的检测

1.实验材料：

1.1细胞、病毒：

Vero细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。HSV-1为F株(Ejercito,P.M.,E.D.Kieff,and B.Roizman.1968.Characterization of herpes simplex virus strainsdiffering in their effects on social behaviour of infectedcells.J.Gen.Virol.2:357-364)，为中国病毒资源与信息中心保存(China VirusResource and Bio-information Center)米托蒽醌购自翰香生物科技公司(Biochempartner)。

1.2试剂：

DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Thermofisher公司。

1.3实验仪器：

多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱为Therm ofisher公司产品。

2.实验方法与结果：

2.1米托蒽醌对Vero细胞的细胞毒性检测

(1)将Vero细胞按照8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％的青霉素和链霉素,在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。

(2)Vero细胞贴壁后添加梯度药物(米托蒽醌)处理。米托蒽醌浓度分别为：6.4微摩尔/升、3.2微摩尔/升、1.6微摩尔/升、0.8微摩尔/升、0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升。利用培养基稀释后的米托蒽醌直接添加到贴壁的Vero细胞中，每组三个重复,置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)培养48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测米托蒽醌的细胞毒性，此试剂盒的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂,其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102Mul tilabel Reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号，并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 MultilabelReader)读取荧光信号。

(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物组)/未加药物×100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。

(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制米托蒽醌对Vero细胞的细胞毒性检测结果图。如图1A所示。

图1A结果显示：米托蒽醌对Vero细胞的CC₅₀为3.2微摩尔/升。

2.2米托蒽醌抑制HSV-1导致的细胞病变效应的检测：

HSV-1感染Vero细胞后，病毒复制使细胞发生剧烈的细胞病变，造成细胞裂解或活力降低。HSV-1感染细胞后的细胞活性可以一定程度上反映病毒的复制能力。因此，可以通过检测药物对病毒致细胞活力降低的影响来定义药物的抗病毒效果。

(1)提前24小时将vero细胞接种到96孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％FBS的培养基，并接种病毒。

(2)HSV-1病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。

(3)更换添加含有梯度药物(米托蒽醌)的培养基，药物浓度分别为：0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.025微摩尔/升、0.0125微摩尔/升。培养基稀释后的药物直接添加到Vero细胞中，每组三个重复,置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(4)48小时后，去除上清，用PBS洗细胞3次。

(5)利用Alamarblue试剂盒检测细胞的活性，此试剂盒的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 Multilabel Reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。根据计算公式：细胞活性(％)＝(药物组-空白对照)/(细胞对照-空白对照)×100。绘制抗HSV-1曲线图，如图1B。

由图1B结果显示，米托蒽醌抑制HSV-1复制的IC₅₀为0.026微摩尔/升计算出米托蒽醌抗HSV-1的SI(选择指数)为123.07。

实施例2、米托蒽醌抗HSV-2活性的检测

1.实验材料

1.1细胞、病毒

Vero细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。HSV-2为G株(Ejercito PM,Kieff ED,Roizman B.Characterization of herpes simplex virus strains differing intheir effect on social behavior of infected cells.J Gen Virol.1968；2:357–64.)，中国病毒资源与信息中心保存(China Virus Resource and Bio-informationCenter)。米托蒽醌购自翰香生物科技公司(Biochempartner)。

1.2试剂

DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Thermofisher公司。

1.3实验仪器

多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱为Therm ofisher公司产品。

2.实验方法与结果

2.1米托蒽醌对Vero细胞的细胞毒性检测

(1)将Vero细胞按照8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素。在37℃，5％CO₂的加湿培养箱中培养。

(2)Vero细胞贴壁后添加梯度药物(米托蒽醌)处理。药物浓度分别为：6.4微摩尔/升、3.2微摩尔/升、1.6微摩尔/升、0.8微摩尔/升、0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升。培养基稀释后的药物直接添加到贴壁的Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 MultilabelRead er)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号，并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 Multilabel Reader)读取荧光信号。

(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物组)/未加药物×100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。

(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制米托蒽醌对Vero细胞的细胞毒性检测结果图。如图2A所示。

图2A结果显示：米托蒽醌对Vero细胞的CC₅₀为3.01微摩尔/升。

2.2米托蒽醌抑制HSV-2导致的细胞病变效应的检测

HSV-2感染Vero细胞后，病毒复制使细胞发生剧烈的细胞病变，造成细胞裂解或活力降低。HSV-2感染细胞后的细胞活性可以一定程度上反映病毒的复制能力。因此，可以通过检测药物对病毒致细胞活力降低的影响来定义药物的抗病毒效果。

(1)提前24小时将vero细胞接种到96孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％FBS的培养基，并接种病毒。

(2)HSV-2病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。

(3)更换添加含有梯度药物(米托蒽醌)的培养基，药物浓度分别为：0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.025微摩尔/升、0.0125微摩尔/升。培养基稀释后的药物直接添加到Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(4)48小时后，去除上清，PBS洗细胞3次。

(5)利用Alamarblue试剂盒检测细胞的活性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 Multilabel Reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。根据计算公式：细胞活性(％)＝(药物组-空白对照)/(细胞对照-空白对照)×100。绘制抗HSV-2曲线图，如图2B。

由图2B结果显示，米托蒽醌抑制HSV-2复制的IC₅₀为0.035，计算出米托蒽醌抗HSV-2的SI(选择指数)为86。

实施例3、米托蒽醌抑制KSHV裂解期复制的活性检测

1.实验材料：

1.1细胞、病毒：

iSLK.219细胞由Dr.Don Ganem教授惠赠(Myoung J,Ganem D(2011)Generationof a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin:Maintenance of tight latency with efficient reactivation uponinduction.Journal of Virological Methods 174:12-21)，该细胞为含有重组病毒rKSHV.219和多西环素(Doxycycline)调控RTA表达系统的SLK细胞(分离自牙龈卡波西肉瘤组织中的内皮细胞)。在该细胞中，RTA表达序列被构建入pRetro-X Tet-ON诱导表达系统中(Clontech，Mountainview，CA)，该系统的表达受多西环素的调控，多西环素存在的情况下，RTA表达才能发生；Vero细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。

1.2试剂：

DMEM培养基、1640培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Thermofisher公司；SYBR混合液(iTaq^TMUniversal

Green Supermix)购自Bio-Rad公司。

1.3实验仪器：

定量PCR仪(Bio-Rad CFX96 Touch^TMReal-Time PCR detection system)购自Bio-Rad公司。多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司。

1.0R型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermofisher公司。

2.实验方法与结果：

2.1米托蒽醌对iSLK.219细胞的细胞毒性检测：

(1)将iSLK.219细胞按照8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，iSLK.219细胞培养在37℃，5％CO₂的加湿培养箱中，采用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL新霉素(G418)，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。

(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期发生。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释米托蒽醌。药物(米托蒽醌)浓度分别为：40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升、0.16微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.018微摩尔/升。将含米托蒽醌的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102 MultilabelRead er)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。

(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未加药物组×100。计算结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。

(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制米托蒽醌对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图(即存活率曲线图)。存活率曲线图如图3A所示。

由图3A可以得出，米托蒽醌对iSLK.219细胞的CC₅₀(半数细胞毒性浓度)为13.3微摩尔/升。

2.2米托蒽醌抑制KSHV感染性病毒粒子产生的检测

(1)将iSLK.219细胞按照8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL G418，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素，并在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。

(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期复制。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释米托蒽醌。药物(米托蒽醌)浓度分别为：40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升、0.16微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.018微摩尔/升。将含米托蒽醌的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)培养48小时后，收取上清添加到Vero细胞中，感染Vero细胞1个小时后更换新鲜的培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(4)48小时后，利用高内涵细胞分析系统检测GFP表达水平。

(5)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组×100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。

(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制米托蒽醌抑制KSHV感染性病毒粒子产生的结果图(即抑制率曲线图)，抑制率曲线图如图3B所示。

图3B结果显示米托蒽醌能剂量依赖地抑制KSHV可感染性病毒粒子的产生；米托蒽醌对KSHV感染性病毒粒子产生的半数抑制浓度(IC₅₀)为0.018微摩尔/升，计算得米托蒽醌抑制KSHV可感染性病毒产生的SI(选择指数)大于738.9。

实施例4、米托蒽醌抑制KSHV DNA复制的检测

1.实验材料：

1.1细胞、病毒：

iSLK.219细胞由Dr.Don Ganem教授惠赠(Myoung J,Ganem D(2011)Generationof a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin:Maintenance of tight latency with efficient reactivation uponinduction.Journal of Virological Methods 174:12-21)，该细胞为含有重组病毒rKSHV.219和多西环素(Doxycycline)调控RTA表达系统的SLK细胞(分离自牙龈卡波西肉瘤组织中的内皮细胞)。在该细胞中，RTA表达序列被构建入pRetro-X Tet-ON诱导表达系统中(Clontech，Mountainview，CA)，该系统的表达受多西环素的调控，多西环素存在的情况下，RTA表达才能发生；Vero细胞为本实验室保存，购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。

1.2试剂：

DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Thermofisher公司；SYBR混合液(iTaq^TMUniversal

Green Supermix)购自Bio-Rad公司。

1.3实验仪器：

定量PCR仪(Bio-Rad CFX96 Touch^TMReal-Time PCR detection system)购自Bio-Rad公司。多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司。

1.0R型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermofisher公司。

2.实验方法与结果：

2.1米托蒽醌对iSLK.219细胞的细胞毒性检测：

(1)将iSLK.219细胞按照8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，iSLK.219细胞培养在37℃，5％CO₂的加湿培养箱中，采用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL遗传霉素(G418)，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。

(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期发生。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释米托蒽醌。药物(米托蒽醌)浓度分别为：40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升、0.16微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.018微摩尔/升。将含药物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测米托蒽醌的细胞毒性，此试剂盒的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102Multilab el Reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。

(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未加药物组×100。计算结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。

(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制米托蒽醌对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图(即存活率曲线图)。存活率曲线图如图4A所示。

由图4A可以得出，米托蒽醌对iSLK.219细胞的CC₅₀(半数细胞毒性浓度)为11.31微摩尔/升。

2.2米托蒽醌抑制KSHV DNA复制的检测

(1)将iSLK.219细胞按照8×10³个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL G418，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。

(2)多西环素联合丁酸钠可以诱导KSHV裂解期复制。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释米托蒽醌。药物(米托蒽醌)浓度分别为：40微摩尔/升、20微摩尔/升、10微摩尔/升、5微摩尔/升、2.5微摩尔/升、1.25微摩尔/升。将含药物(米托蒽醌)的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(3)48小时后去除上清，PBS洗细胞2-3次，利用苯酚-氯仿的方法提取细胞内DNA，利用酒精沉淀DNA，然后将DNA晾干后溶解到TE中。

(4)通过基因组定量PCR方法(QPCR)检测KSHV基因组复制水平。定量RCR引物针对KSHV的LANA基因序列，定量RCR引物如下：

5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'(如SEQ ID NO：1所示)；

5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3'(如SEQ ID NO：2所示)。

选择管家基因GADPH作为校正的内参对照基因，针对GADPH的定量RCR引物如下：

5'-GCTCCCTCTTTCTTTGCAGCAAT-3'(如SEQ ID NO：3所示)；

5'-TACCATGAGTCCTTCCACGATAC-3'(如SEQ ID NO：4所示)。

(5)定量的Ct值通过内参基因(GAPDH)进行校对，各组数据以未诱导组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未诱导对照组。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。

(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制米托蒽醌抑制KSHV裂解期DNA复制的结果图。结果如图4B所示。

图4B结果显示：在iSLK.219细胞中，米托蒽醌能剂量依赖地抑制KSHV裂解期DNA复制水平,米托蒽醌对KSHV DNA复制的的IC₅₀(半数抑制浓度)大于0.018微摩尔/升。

综上所述，米托蒽醌具有良好的抗疱疹病毒的活性，有潜力进一步开发制备临床上有效对抗疱疹病毒感染的药物。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 米托蒽醌和/或其可药用衍生物在制备抗疱疹病毒药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccgaggacga aatggaagtg 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtgatgttc tgagtacata gcgg 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctccctctt tctttgcagc aat 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taccatgagt ccttccacga tac 23

Claims (5)

1.米托蒽醌在制备抗卡波氏肉瘤相关疱疹病毒药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗疱疹病毒药物还包括药学上可接受的辅料和载体。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂和着色剂中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗疱疹病毒药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗疱疹病毒药物的抗病毒的方式包括：抑制疱疹病毒在细胞内核酸复制、病毒蛋白的表达和感染。

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