CN114159434B - 一种含氮多环类芳香化合物在制备抗疱疹病毒药物中的应用 - Google Patents

一种含氮多环类芳香化合物在制备抗疱疹病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含氮多环类芳香化合物在制备抗疱疹病毒药物中的应用。本发明首次发现含氮多环类芳香化合物3,3,3’,3’,9,9’‑六甲基‑4,4’,9,9’‑四氢‑3‑氢,3’‑氢‑1,1’‑双吡咯[3,4‑b]吲哚能够剂量依赖的抑制疱疹病毒增殖及感染宿主细胞，安全性良好，是低毒高效的抗疱疹病毒的药物。

Description

一种含氮多环类芳香化合物在制备抗疱疹病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚在制备抗疱疹病毒药物中的应用。
背景技术
疱疹病毒科(Herpesviridae)是一类有包膜的，基因组为双链DNA的病毒科。该科的成员能广泛地感染动物和人，并诱导相应疾病的产生。目前发现的能感染人的疱疹病毒有八种，主要包括：单纯疱疹病毒I型(Herpes simplex virus-1，HSV-1)，单纯疱疹病毒II型(Herpes simplex virus-2，HSV-2)，水痘-带状疱疹病毒(Varicella zoster virus,VZV),EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)，巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)，人类疱疹病毒VI型(HHV-6)，人类疱疹病毒VII型(HHV-7)和卡波氏疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)。根据基因组序列和结构及理化性质的不同,疱疹病毒科又可以分为三个亚科：α-疱疹病毒亚科，β-疱疹病毒亚科和γ-疱疹病毒亚科。疱疹病毒生活周期分为典型的裂解期复制和潜伏期复制：在裂解期感染过程中，病毒基因组复制，产生大量成熟的病毒粒子，诱导多种疾病的发生；在潜伏期感染过程中，基因组处于静息状态，只有少量的病毒基因表达，但基因组随细胞基因组复制而复制，病毒的潜伏状态同样可以造成机体疾病的发生。
疱疹病毒的感染能够诱导多种疾病的产生，如造成人口、唇或生殖器的皮肤或粘液膜上出现水泡、角膜炎、胎儿畸形、智力障碍和感觉神经性耳聋、幼儿急疹等等，甚至能够引起多种肿瘤疾病的发生(如非霍金奇和霍金奇淋巴瘤、鼻咽癌、淋巴组织增生、卡波氏肉瘤等)。疱疹病毒感染严重影响人们的生命健康。
因此，有必要开发一种治疗或者预防疱疹病毒感染的药物。
3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚是新近合成的化合物，其结构式如下式(I)所示，
Figure BDA0003338837890000021
目前尚无3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚用于制备预防或治疗疱疹病毒感染的药物的报道。
发明内容
为克服现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚(以下简称：式(I)化合物)在制备抗疱疹病毒药物中的应用。本申请发现3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚对疱疹病毒有较强抑制作用，为疱疹病毒感染性疾病的治疗和预防提供了方向。
具体而言，为解决本发明的技术问题，采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供式(I)化合物3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚在如下X1)-X5)中任一种的应用：
Figure BDA0003338837890000022
X1)制备预防和/或治疗疱疹病毒所致疾病的产品；
X2)制备预防和/或治疗疱疹病毒感染的产品；
X3)制备疱疹病毒抑制剂；
X4)制备抑制疱疹病毒增殖的产品；
X5)制备抑制疱疹病毒产生细胞病变效应的产品。
优选地，上述应用中，式(I)化合物可以作为唯一活性成分，或者可以与一种、两种或更多种其他抗病毒药物一起作为活性成分。
优选地，其他抗病毒药物选自更昔洛韦、阿昔洛韦、金刚烷胺、金刚乙胺、奥司他韦、阿巴卡韦、醋孟南、阿昔洛韦钠、阿德福韦、阿洛夫定、阿韦舒托、盐酸三环癸胺、阿拉诺丁、阿立酮、阿替韦啶甲磺酸酯、阿夫立定、西多福韦、西潘茶碱、恩曲他滨、盐酸阿糖胞苷、甲磺酸地拉韦啶、地昔洛韦、去羟肌苷、二噁沙利、依度尿苷、乙米韦林、依曲西他平、恩韦拉登、恩韦肟、贺普丁、泛昔洛韦、盐酸氯苯氢异喹、非西他滨、非阿尿苷、磷利酯、膦甲酸钠、膦乙酸钠、甘西洛维钠、碘苷、茚地那韦、乙氧丁酮醛、拉米夫定、洛布卡韦、洛德腺苷、洛匹那韦、盐酸美莫汀、甲红硫脲、那非那韦、奈韦拉平、喷昔洛韦、吡罗达韦、利巴韦林、甲磺酸沙奎那韦、利托那韦、盐酸索金刚胺、索立夫定、匍枝青霉菌素、司他夫定、替诺福韦、盐酸梯络龙、曲氟尿苷、盐酸伐昔洛韦、阿糖腺苷、磷酸阿糖腺苷、阿糖腺苷磷酸钠、替拉那韦、韦罗肟、扎西他滨、齐多夫定、净韦肟。
优选地，上述应用中，疱疹病毒所致疾病为疱疹病毒引起的感染性疾病或其并发症；进一步优选地，感染性疾病为粘膜、皮肤局部和神经组织集聚的疱疹。
优选地，上述应用中，所述疱疹病毒包括卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、人类疱疹病毒VI型和人类疱疹病毒VII型中的至少一种。
优选地，上述应用中，所述产品为药物。
第二方面，本发明提供一种包含式(I)化合物的药物组合物在如下X1)-X5)中任一种应用：
X1)制备预防和/或治疗疱疹病毒所致疾病的产品；
X2)制备预防和/或治疗疱疹病毒感染的产品；
X3)制备疱疹病毒抑制剂；
X4)制备抑制疱疹病毒增殖的产品；
X5)制备抑制疱疹病毒产生细胞病变效应的产品。
优选地，上述应用中，疱疹病毒所致疾病为疱疹病毒引起的感染性疾病或其并发症；进一步优选地，感染性疾病为粘膜、皮肤局部和神经组织集聚的疱疹。
优选地，上述应用中，所述疱疹病毒包括卡波氏肉瘤相关疱疹病毒、EB病毒、单纯疱疹病毒I型、单纯疱疹病毒II型、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、人类疱疹病毒VI型和人类疱疹病毒VII型中的至少一种。
本发明还提供预防和/或治疗疱疹病毒相关疾病的方法，包括给予患者预防或治疗有效量的包含式(I)化合物的药物组合物。
根据本发明的实施方案，所述疱疹病毒相关疾病可以包括疱疹病毒所致疾病、疱疹病毒感染、疱疹病毒增殖或疱疹病毒产生的细胞病变效应。
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体和/或赋型剂。
优选地，所述载体包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。
优选地，所述赋形剂的某些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲基纤维素。
优选地，所述药物组合物中还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。
优选地，所述药物组合物中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
优选地，所述药物组合物的剂型，包括但不限于片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。使用上述剂型可以经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射等；腔道给药，如经直肠和阴道；呼吸道给药，如经鼻腔，粘膜给药。
可按单位剂型配制组合物，每一剂量含约5～1000mg，更通常约100～500mg活性成分。术语“单位剂型”是指物理上分离的适宜作为用于人患者和其它哺乳动物的单一剂量单位，各单位含有与适宜的药物赋形剂混合的经计算可产生所需疗效的预定量的活性物质。
活性化合物的有效剂量的范围可很大，通常按药用有效量给药。但是，可以理解实际给予的化合物的量通常由医师根据相关情况决定，它们包括所治疗的病症、所选择的给药途径、所给予的实际化合物；患者个体的年龄、重量和反应；患者症状的严重程度等。
对于制备固体组合物例如片剂，将主要的活性成分与药物赋形剂混合，形成含本发明化合物的均匀混合物的固体预制剂组合物。当称这些预制剂组合物为均匀时，是指活性成分通常均匀地分布在整个组合物中，致使该组合物可容易地划分为同等有效的单位剂型例如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将该固体预制剂划分为上述类型的含例如约0.1～1000mg本发明活性成分的单位剂型。
可将本发明片剂或丸剂包衣或复合，得到提供长效作用优点的剂型。例如，片剂或丸剂含内剂量和外剂量组分，后者是前者的被膜形式。可通过肠溶层将两种组分隔离，肠溶层用于在胃中阻止崩解，以使内组分完整通过十二指肠或延迟释放。多种物质可用于此类肠溶层或包衣剂，此类物质包括多种高分子酸和高分子酸与此类物质如虫胶、鲸蜡醇和醋酸纤维素的混合物。
其中可掺入本发明化合物和组合物，用于口服或注射给药的液体形式包括水溶液、适当矫味的糖浆剂、水或油混悬液；和用食用油例如棉子油、芝麻油、椰子油或花生油矫味的乳剂；以及酏剂和类似的药用溶媒。
用于吸入或吹入的组合物包括溶于药学上可接受的水或有机溶剂或其混合物的溶液剂和混悬液、散剂。液体或固体组合物可含有如上所述适宜的药学上可接受的赋形剂。在某些实施方案中，通过口服或鼻呼吸途径给予组合物，实现局部或全身作用。可通过使用呈惰性的气体，使组合物成雾化。可直接由雾化装置吸入雾化溶液，或雾化装置可与面罩帷或间歇正压呼吸机连接。可通过口服或由按适当方式递送制剂的装置通过鼻给予溶液、混悬液或粉末组合物。
给予患者的化合物或组合物的量不固定，取决于给予的药物、给药的目的例如预防或治疗；患者的状态、给药的方式等。在治疗应用时，可给予已患疾病的患者足够治愈或至少部分抑制疾病及其并发症症状的量的组合物。有效剂量应取决于所治疗的疾病状态和主治临床医师的判断，该判断取决于例如疾病的严重程度、患者的年龄、体重和一般状况等因素。
给予患者的药物组合物可以是上述药用组合物形式。可通过常规灭菌技术或可过滤灭菌，将这些组合物灭菌。可将水溶液包装原样使用，或冻干，给药前，将冻干制剂与无菌水性载体混合。化合物制剂的pH通常为3～11，更优选5～9，最优选7～8。可以理解，使用某些前述赋形剂、载体或稳定剂会导致形成药物盐。
本发明化合物的治疗剂量可根据例如以下而定：治疗的具体用途、给予化合物的方式、患者的健康和状态，以及签处方医师的判断。本发明化合物在药用组合物中的比例或浓度可不固定，取决于多种因素，它们包括剂量、化学特性(例如疏水性)和给药途径。例如可通过含约0.1～10％w/v该化合物的生理缓冲水溶液提供本发明化合物，用于肠胃外给药。某些典型剂量范围为约1μg/kg～约1g/kg体重/日。在某些实施方案中，剂量范围为约0.01mg/kg～约100mg/kg体重/日。剂量很可能取决于此类变量，如疾病或病症的种类和发展程度、具体患者的一般健康状态、所选择的化合物的相对生物学效力、赋形剂制剂及其给药途径。可通过由体外或动物模型试验系统导出的剂量-反应曲线外推，得到有效剂量。
本发明的有益效果：
本发明首次发现式(I)化合物(3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚)可抑制疱疹病毒增殖及感染宿主细胞，可用作治疗疱疹病毒感染方面的疾病。
式(I)化合物能够剂量依赖的抑制HSV-1和HSV-2复制，其IC50(半数抑制浓度)分别为0.026μM、0.035μM，选择指数(SI)分别为123.07、86；此外，式(I)化合物对KSHV感染性病毒粒子产生的半数抑制浓度(IC50)小于实验最小浓度0.018微摩尔/升；同时，对iSLK.219细胞内KSHV DNA水平进行定量检测，结果显示式(I)化合物剂量依赖地抑制KSHV DNA复制水平，对KSHV DNA复制的半数抑制浓度(IC50)同样小于实验最小浓度0.018微摩尔/升，计算得式(I)化合物抑制KSHV可感染性病毒产生的SI大于738.9，抑制KSHV DNA复制的SI大于628.3，说明式(I)化合物可以抑制KSHV DNA复制及病毒粒子的产生。因此，式(I)化合物是低毒高效的抗疱疹病毒的药物。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的式(I)化合物抗HSV-1的活性检测结果示意图；其中，图1A为式(I)化合物对Vero细胞的细胞毒性检测结果图；图1B为式(I)化合物抗HSV-1活性的结果图；
图2为本发明实施例3提供的式(I)化合物抗HSV-2的活性检测结果示意图；其中，图2A为式(I)化合物对Vero细胞的细胞毒性检测结果图；图2B为式(I)化合物抗HSV-2活性的结果图；
图3为本发明实施例4提供的式(I)化合物抑制KSHV病毒粒子产生的活性检测结果示意图；其中，图3A为式(I)化合物对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图；图3B为式(I)化合物抑制KSHV病毒粒子产生的活性检测结果图；
图4为本发明实施例5提供的式(I)化合物抑制KSHV DNA复制活性检测结果示意图；其中，图4A为式(I)化合物对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图；图4B为式(I)化合物抑制KSHV DNA复制活性检测结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
定义与说明：
本文所用的术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
本文所用的“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1：式(I)化合物的制备方法
将2-甲基-1(1-甲基-1H-吲哚-3)-2-丙氨(购于国药集团)202mg(1.0mmol)溶解在二氯甲烷中(30mL)，在0℃时加入乙二醛水溶液(90μl，0.60equiv.)。再加入干燥的分子筛后搅拌，在酸(如三氟乙酸)作用下，10℃反应过夜。次日使用TLC分析后，原料消失后，过滤去掉分子筛，并用大极性溶剂，如甲醇与二氯甲烷的混合溶剂(1：5)，洗涤分子筛，合并反应物，减压蒸馏去掉溶剂，剩余物质使用硅胶(200-300目)分离得到目标产物，产率71％左右，反应式如下：
Figure BDA0003338837890000081
化合物表征如下：
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.61(d,J＝8.0Hz,2H),7.30(dd,J＝11.0,4.0Hz,2H),7.27(d,J＝6.5Hz,2H),7.15(dd,J＝10.9,3.9Hz,2H),3.62(s,6H),3.00(s,4H),1.44(s,3H×4).
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ155.44,138.90,128.54,125.43,124.43,119.89,117.52,110.16,56.40,32.23,32.12,31.81,31.68,28.19.
HRMS-ESI m/z calcd for C28H30N4[M+H]+423.2549,found 423.2540.
以上制备方法参考了发明名称：一种含氮多环类芳香化合物及其制备方法和应用(申请号：202110721322.5)的专利申请。
实施例2：式(I)化合物(3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚)抗HSV-1活性的检测
1.实验材料：
1.1细胞、病毒：
Vero细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。HSV-1为F株(Ejercito,P.M.,E.D.Kieff,and B.Roizman.1968.Characterization of herpes simplex virus strainsdiffering in their effects on social behaviour of infectedcells.J.Gen.Virol.2:357-364)，为中国病毒资源与信息中心保存(China VirusResource and Bio-information Center)，3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚购自翰香生物科技公司(Biochempartner)。
1.2试剂：
DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Thermofisher公司。
1.3实验仪器：
多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱为Thermofisher公司产品。
2.实验方法与结果：
2.1式(I)化合物对Vero细胞的细胞毒性检测
(1)将Vero细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％的青霉素和链霉素,在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)Vero细胞贴壁后添加梯度式(I)化合物处理，式(I)化合物浓度分别为：6.4微摩尔/升、3.2微摩尔/升、1.6微摩尔/升、0.8微摩尔/升、0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升。利用培养基稀释后的式(I)化合物直接添加到贴壁的Vero细胞中，每组三个重复，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)培养48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测式(I)化合物的细胞毒性，此试剂盒的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂，其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison2102Multilabel Reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号，并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102MultilabelReader)读取荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物组)/未加药物×100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制式(I)化合物对Vero细胞的细胞毒性检测结果图。如图1A所示。
图1A结果显示：式(I)化合物对Vero细胞的CC50为3.2微摩尔/升。
2.2式(I)化合物抑制HSV-1导致的细胞病变效应的检测：
HSV-1感染Vero细胞后，病毒复制使细胞发生剧烈的细胞病变，造成细胞裂解或活力降低。HSV-1感染细胞后的细胞活性可以一定程度上反映病毒的复制能力。因此，可以通过检测药物对病毒致细胞活力降低的影响来定义药物的抗病毒效果。
(1)提前24小时将vero细胞接种到96孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％FBS的培养基，并接种病毒。
(2)HSV-1病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。
(3)更换添加含有梯度式(I)化合物的培养基，药物浓度分别为：0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.025微摩尔/升、0.0125微摩尔/升。培养基稀释后的药物直接添加到Vero细胞中，每组三个重复,置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，去除上清，用PBS洗细胞3次。
(5)利用Alamarblue试剂盒检测细胞的活性，此试剂盒的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102Multilabel Reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。根据计算公式：细胞活性(％)＝(药物组-空白对照)/(细胞对照-空白对照)×100。绘制抗HSV-1曲线图，如图1B。
由图1B结果显示，式(I)化合物抑制HSV-1复制的IC50为0.026微摩尔/升，计算出式(I)化合物抗HSV-1的SI(选择指数)为123.07。
实施例3：式(I)化合物(3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚)抗HSV-2活性的检测
1.实验材料
1.1细胞、病毒
Vero细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。HSV-2为G株(Ejercito PM,Kie ffED,Roizman B.Characterization of herpes simplex virus strains differing intheir effect on social behavior of infected cells.J Gen Virol.1968；2:357–64.)，中国病毒资源与信息中心保存(China Virus Resource and Bio-informationCenter)。3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚购自翰香生物科技公司(Biochem partner)。
1.2试剂
DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Thermofisher公司。
1.3实验仪器
多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司；细胞培养箱为Ther mofisher公司产品。
2.实验方法与结果
2.1式(I)化合物对Vero细胞的细胞毒性检测
(1)将Vero细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用加有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素。在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)Vero细胞贴壁后添加梯度式(I)化合物处理。药物浓度分别为：6.4微摩尔/升、3.2微摩尔/升、1.6微摩尔/升、0.8微摩尔/升、0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升。培养基稀释后的药物直接添加到贴壁的Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102Multila belReader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号，并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102Multilabel Read er)读取荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物-药物组)/未加药物×100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制式(I)化合物对Vero细胞的细胞毒性检测结果图。如图2A所示。
图2A结果显示：式(I)化合物对Vero细胞的CC50为3.01微摩尔/升。
2.2式(I)化合物抑制HSV-2导致的细胞病变效应的检测
HSV-2感染Vero细胞后，病毒复制使细胞发生剧烈的细胞病变，造成细胞裂解或活力降低。HSV-2感染细胞后的细胞活性可以一定程度上反映病毒的复制能力。因此，可以通过检测药物对病毒致细胞活力降低的影响来定义药物的抗病毒效果。
(1)提前24小时将vero细胞接种到96孔板中，待细胞生长至100％汇合度时，更换含2％FBS的培养基，并接种病毒。
(2)HSV-2病毒按0.1PFU每细胞的滴度加入细胞中，37℃培养2小时。
(3)更换添加含有梯度式(I)化合物的培养基，药物浓度分别为：0.4微摩尔/升、0.2微摩尔/升、0.1微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.025微摩尔/升、0.0125微摩尔/升。培养基稀释后的药物直接添加到Vero细胞中，每组三个重复。将加有药物的细胞置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，去除上清，PBS洗细胞3次。
(5)利用Alamarblue试剂盒检测细胞的活性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102Multilabel Reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。根据计算公式：细胞活性(％)＝(药物组-空白对照)/(细胞对照-空白对照)×100。绘制抗HSV-2曲线图，如图2B。
由图2B结果显示，式(I)化合物抑制HSV-2复制的IC50为0.035，计算出式(I)化合物抗HSV-2的SI(选择指数)为86。
实施例4：式(I)化合物(3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚)抑制KSHV裂解期复制的活性检测
1.实验材料：
1.1细胞、病毒：
iSLK.219细胞由Dr.Don Ganem教授惠赠(Myoung J,Ganem D(2011)Generat ionof a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin:Mainten ance of tight latency with efficient reactivation uponinduction.Journal of Virological Methods 174:12-21)，该细胞为含有重组病毒rKSHV.219和多西环素(Doxycycline)调控RTA表达系统的SLK细胞(分离自牙龈卡波西肉瘤组织中的内皮细胞)。在iSLK.219细胞中，RTA表达序列被构建入pRetro-X Tet-ON诱导表达系统中(Clontech，Mount ainview，CA)，该系统的表达受多西环素的调控，多西环素存在的情况下，RTA表达才能发生；Vero细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。
1.2试剂：
DMEM培养基、1640培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Thermofisher公司；SYBR混合液(iTaqTM Universal
Figure BDA0003338837890000121
Green Supermix)购自Bio-Rad公司。
1.3实验仪器：
定量PCR仪(Bio-Rad CFX96 TouchTM Real-Time PCR detection system)购自Bio-Rad公司。多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司
Figure BDA0003338837890000131
1.0R型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermofisher公司。
2.实验方法与结果：
2.1式(I)化合物对iSLK.219细胞的细胞毒性检测：
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，iSLK.219细胞培养在37℃，5％CO2的加湿培养箱中，采用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL新霉素(G418)，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。
(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期发生。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释式(I)化合物。式(I)化合物浓度分别为：40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升、0.16微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.018微摩尔/升。将含式(I)化合物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测药物的细胞毒性，此试剂的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison 2102Multila belReader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590nm为基础检测样品的荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未加药物组×100。计算结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制式(I)化合物对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图(即存活率曲线图)。存活率曲线图如图3A所示。
由图3A可以得出，式(I)化合物对iSLK.219细胞的CC50(半数细胞毒性浓度)为13.3微摩尔/升。
2.2式(I)化合物抑制KSHV感染性病毒粒子产生的检测
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL G418，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素，并在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期复制。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释式(I)化合物。式(I)化合物浓度分别为：40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升、0.16微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.018微摩尔/升。将含式(I)化合物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)培养48小时后，收取上清添加到Vero细胞中，感染Vero细胞1个小时后更换新鲜的培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(4)48小时后，利用高内涵细胞分析系统检测GFP表达水平。
(5)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝(未加药物组-药物组)/未加药物组×100。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制式(I)化合物抑制KSHV感染性病毒粒子产生的结果图(即抑制率曲线图)，抑制率曲线图如图3B所示。
图3B结果显示式(I)化合物能剂量依赖地抑制KSHV可感染性病毒粒子的产生；式(I)化合物对KSHV感染性病毒粒子产生的半数抑制浓度(IC50)为0.018微摩尔/升，计算得式(I)化合物抑制KSHV可感染性病毒产生的SI(选择指数)大于738.9。
实施例5：式(I)化合(3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚)抑制KSHV DNA复制的检测
1.实验材料：
1.1细胞、病毒：
iSLK.219细胞由Dr.Don Ganem教授惠赠(Myoung J,Ganem D(2011)Generat ionof a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin:Mainten ance of tight latency with efficient reactivation uponinduction.Journal of Virological Methods 174:12-21)，该细胞为含有重组病毒rKSHV.219和多西环素(Doxycycline)调控RTA表达系统的SLK细胞(分离自牙龈卡波西肉瘤组织中的内皮细胞)。在iSLK.219细胞中，RTA表达序列被构建入pRetro-X Tet-ON诱导表达系统中(Clontech，Mount ainview，CA)，该系统的表达受多西环素的调控，多西环素存在的情况下，RTA表达才能发生；Vero细胞为本实验室保存，购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)。
1.2试剂：
DMEM培养基和FBS购自GIBCO公司；Alamarblue活性检测试剂盒购自Thermofisher公司；SYBR混合液(iTaqTM Universal
Figure BDA0003338837890000151
Green Supermix)购自Bio-Rad公司。
1.3实验仪器：
定量PCR仪(Bio-Rad CFX96 TouchTM Real-Time PCR detection system)购自Bio-Rad公司。多标记微孔板读取仪和高内涵细胞分析仪购自PerkinElmer公司。
Figure BDA0003338837890000152
1.0R型冷冻离心机和细胞培养箱购自Thermofisher公司。
2.实验方法与结果：
2.1式(I)化合物对iSLK.219细胞的细胞毒性检测：
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，iSLK.219细胞培养在37℃，5％CO2的加湿培养箱中，采用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL遗传霉素(G418)，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。
(2)多西环素联合丁酸钠可以激活KSHV裂解期发生。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释式(I)化合物。式(I)化合物浓度分别为：40微摩尔/升、13.3微摩尔/升、4.44微摩尔/升、1.48微摩尔/升、0.49微摩尔/升、0.16微摩尔/升、0.05微摩尔/升、0.018微摩尔/升。将含药物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后，利用Alamarblue活性检测试剂盒检测式(I)化合物的细胞毒性，此试剂盒的主要成分刃天青(Resazurin)是一种氧化还原指示剂其在氧化状态下呈现紫蓝色无荧光性，而在还原状态下，转变为呈粉红或红色荧光的还原产物，因此，通过细胞内氧化还原环境的改变指证细胞的活性状态。并用PerkinElmer多标记读板仪(Envison2102Multilabel Reader)读取荧光信号，该仪器以激发波长为530-560nm，发射波长590n m为基础检测样品的荧光信号。
(4)各组数据以未加药物对照组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未加药物组×100。计算结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(5)利用步骤(4)中的计算结果绘制式(I)化合物对iSLK.219细胞的细胞毒性检测结果图(即存活率曲线图)。存活率曲线图如图4A所示。
由图4A可以得出，式(I)化合物对iSLK.219细胞的CC50(半数细胞毒性浓度)为11.31微摩尔/升。
2.2式(I)化合物抑制KSHV DNA复制的检测
(1)将iSLK.219细胞按照8×103个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，采用10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，培养基中添加1％青霉素和链霉素，100μg/mL G418，100μg/mL潮霉素B和4μg/mL嘌呤霉素。在37℃，5％CO2的加湿培养箱中培养。
(2)多西环素联合丁酸钠可以诱导KSHV裂解期复制。用含1μg/mL多西环素和1.2mM丁酸钠的DMEM培养基梯度稀释式(I)化合物。式(I)化合物浓度分别为：40微摩尔/升、20微摩尔/升、10微摩尔/升、5微摩尔/升、2.5微摩尔/升、1.25微摩尔/升。将含式(I)化合物的培养基直接添加到贴壁的iSLK.219细胞中，每组重复三个孔，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。
(3)48小时后去除上清，PBS洗细胞2-3次，利用苯酚-氯仿的方法提取细胞内DNA，利用酒精沉淀DNA，然后将DNA晾干后溶解到TE中。
(4)通过基因组定量PCR方法(QPCR)检测KSHV基因组复制水平。定量RCR引物针对KSHV的LANA基因序列，定量RCR引物如下：
5'-CCGAGGACGAAATGGAAGTG-3'(如SEQ ID NO：1所示)；
5'-GGTGATGTTCTGAGTACATAGCGG-3'(如SEQ ID NO：2所示)。
选择管家基因GAPDH作为校正的内参对照基因，针对GAPDH的定量RCR引物如下：
5'-GCTCCCTCTTTCTTTGCAGCAAT-3'(如SEQ ID NO：3所示)；
5'-TACCATGAGTCCTTCCACGATAC-3'(如SEQ ID NO：4所示)。
(5)定量的Ct值通过内参基因(GAPDH)进行校对，各组数据以未诱导组作为标准组进行归一计算，计算公式＝药物组/未诱导对照组。结果通过GraphPad Prism 5软件计算出平均值和标准差。
(6)利用步骤(5)中的计算结果绘制式(I)化合物抑制KSHV裂解期DNA复制的结果图。结果如图4B所示。
图4B结果显示：在iSLK.219细胞中，式(I)化合物能剂量依赖地抑制KSHV裂解期DNA复制水平,式(I)化合物对KSHV DNA复制的的IC50(半数抑制浓度)为0.018微摩尔/升。
综上所述，式(I)化合物具有良好的抗疱疹病毒的活性，有潜力进一步开发制备临床上有效对抗疱疹病毒感染的药物。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中山亿维迪科技有限公司
<120> 一种含氮多环类芳香化合物在制备抗疱疹病毒药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgaggacga aatggaagtg 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtgatgttc tgagtacata gcgg 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctccctctt tctttgcagc aat 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taccatgagt ccttccacga tac 23

Claims (10)

1.式(I)化合物3,3,3’,3’,9,9’-六甲基-4,4’,9,9’-四氢-3-氢,3’-氢-1,1’-双吡咯[3,4-b]吲哚在如下X1)-X5)中任一种的应用：
Figure FDA0004136707020000011
X1)制备预防和/或治疗疱疹病毒所致疾病的药品；
X2)制备预防和/或治疗疱疹病毒感染的药品；
X3)制备疱疹病毒抑制剂；
X4)制备抑制疱疹病毒增殖的药品；
X5)制备抑制疱疹病毒产生细胞病变效应的药品；
所述疱疹病毒选自HSV-1、HSV-2或KSHV。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，式(I)化合物作为唯一活性成分。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述疱疹病毒所致疾病为疱疹病毒引起的感染性疾病或其并发症。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述感染性疾病为粘膜、皮肤局部和神经组织集聚的疱疹。
5.一种包含式(I)化合物的药物组合物在如下X1)-X5)中任一种的应用：
Figure FDA0004136707020000012
X1)制备预防和/或治疗疱疹病毒所致疾病的药品；
X2)制备预防和/或治疗疱疹病毒感染的药品；
X3)制备疱疹病毒抑制剂；
X4)制备抑制疱疹病毒增殖的药品；
X5)制备抑制疱疹病毒产生细胞病变效应的药品；
所述疱疹病毒选自HSV-1、HSV-2或KSHV。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述组合物包含药学上可接受的载体，所述载体选自水溶性载体材料、难溶性载体材料或肠溶性载体材料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述载体是水溶性载体材料。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物组合物中添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂、着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
9.根据权利要求5-8任一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、栓剂或冻干粉针剂。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，使用权利要求9中的剂型经注射给药，包括皮下注射、静脉注射、肌肉注射和腔内注射；或，经直肠或阴道腔道给药；或，经鼻腔，粘膜呼吸道给药。
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