CN113684174A - 一种人肾足细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化学技术领域，提供一种人肾足细胞的制备方法。本发明方法制得的人肾足细胞符合人肾脏足细胞标记物的表达结果，同时本方法重复性好、操作简单，且可以获得产量高，增值率较高且纯度高的人肾脏足细胞。

Description

一种人肾足细胞的制备方法
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，尤其涉及一种人肾脏足细胞的制备方法。
背景技术
肾脏是人体的重要器官，用于清除体内代谢产物及重吸收功能物质，从而保证机体内环境的稳定性。足细胞(podocyte)，即肾小囊脏层上皮细胞，它附着于肾小球基底膜(GBM)的外侧，连同血管内皮细胞和肾小球基膜一起构成了肾小球血液滤过屏障。足细胞具有促进肾小球的发育、对抗肾小球内压力、维持血管袢形态、调节肾小球滤过率、产生VEGF调控内皮细胞、参与炎症和免疫反应、合成与分解肾小球基底膜等功能。常见的足细胞病有IgAN、LN、DKD、MN、FSGS(局灶性节段性肾小球硬化)、MCD(微小病变肾病)等。
足细胞特殊的解剖位置，使得其体内研究较为困难；又由于正常成年机体的肾脏足细胞是一种终末分化细胞，在成熟状态下的足细胞增殖能力低，分化出的突触相互交叉形成隔膜用于过滤，为了阐明这些突触蛋白质发挥作用的功能途径，并进一步理解其内在细胞机制，足细胞细胞培养实验将变得越来越重要。足细胞体外培养实验有助于确定足细胞在肾相关疾病中对肾功能的作用。足细胞体外培养，细胞形态由增殖期的鹅卵石转化为分化期的树状细胞，树状细胞的分化表现在突触素(synaptopodin)的表达上。足细胞特异性WT-1蛋白的表达仅限于成人肾脏中的足细胞，Nephrin是一种跨膜蛋白，位于足细胞缝隙隔膜；Podocin是NPHS2基因的蛋白产物，在分化的足细胞中可以检测到。用手动分离的肾小球产量太小，无法进行传代培养或生物测定。
有鉴于此，提出本发明。
发明内容
现有技术普遍存在的技术问题是肾足细胞难于分离培养，为解决该技术问题，本发明首要的目的是寻求一种产量高、纯度高且操作简单的肾足细胞制备方法。在本研究中，应用了磁珠和胶原酶分离的方法来提高了肾足细胞产率。具体技术方案如下。
本发明首先提供现有技术普遍存在的技术问题是肾足细胞难于分离培养，为解决该技术问题，本发明首要的目的是寻求一种产量高、纯度高且操作简单的肾足细胞制备方法。在本研究中，应用了磁珠和胶原酶分离的方法来提高了肾足细胞产率。具体技术方案如下。
本发明首先提供一种人肾足细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)人肾脏单细胞的消化分离：取离体肾脏组织加入混合消化酶进行消化分离得单细胞悬液；所述混合消化酶中包含colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶；
2)人肾脏足单细胞的分选：所述分选采用足细胞细胞标记物抗体结合足细胞表面标记蛋白，通过能偶联FITC的纳米磁珠，进行人肾脏足细胞的分选。
3)人肾脏足细胞的培养：所述培养包括原代增值培养和传代增殖培养。
进一步的，所述步骤1)混合消化酶中colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶的浓度分别为0.5-2mg/mL、0.0625-0.5mg/mL、0.125-0.5mg/mL、0.025-0.5mg/mL和0.025-0.5mg/mL。
进一步的，所述步骤1)为：取离体肾脏组织剪碎后，加入相应体积的混合酶消化10-20min，用FBS终止消化；过细胞筛离心去上清，得到单细胞。
进一步的，所述步骤1)具体为：取离体肾脏组织剪碎后，加入相应体积的混合酶(优选的，所述混合酶中各组分最优浓度为0.5mg/mL colⅡ+0.0625mg/mL colIV+0.125mg/mL colⅠ+0.025mg/mL DNaseⅠ+0.025mg/mL Hyaluronidase)，消化10-20min，用10％FBS终止消化，过70μm细胞筛，离心去上清，得到单细胞；用EGM-MV培养基+20％FBS重悬单细胞并培养。
进一步的，所述步骤2)为：步骤1)单细胞悬液培养后，经胰酶消化，加入FcRblocker和FITC-Nephrin抗体，室温放置后再加入Selection Cocktail和RapidSpheresTM孵育，去除上清液。
进一步的，所述步骤2)为：步骤1)单细胞悬液培养一周后，经0.25％胰酶消化，加入FcR blocker混匀，加入FITC-Nephrin抗体到细胞中，室温放置15-20min，加入SelectionCocktail在室温孵育15-20min，加入RapidSpheresTM室温孵育10-20min，去除上清；随后在培养基EGM-MV和20％FBS中继续培养。
进一步的，所述步骤2)具体为：步骤1)单细胞悬液培养一周后，细胞贴壁生长及细胞数量较多时，用0.25％胰酶消化，10％FBS终止消化，细胞悬液计数约1×108个细胞时，加入1mL EasySepTMBuffer重悬到EP管中，加入100uL FcR blocker混匀，加入3μL FITC-Nephrin抗体到细胞中，室温放置15-20min，加入100μL Selection Cocktail室温孵育15-20min，加入50μL RapidSpheresTM室温孵育10-20min；加入EasySepTMBuffer到2.5mL，磁力架上室温孵育5-8min，去除上清液；再加入EasySepTMBuffer 2.5mL，孵育5-8min，去除上清；随后在培养基EGM-MV和20％FBS中继续培养。
进一步的，所述步骤3)中所述原代增殖培养采用1640完全培养基与20％FBS的EGM-MV培养基(优选，以体积比为1:1比例的进行混合)作为细胞原代增殖培养基；所述传代增殖培养采用1640基础培养基、20％FBS、IFN-γ(优选50u/mL)和双抗，或者，1640基础培养基、10％FBS、IFN-γ(优选50u/mL)、Human Vegf(优选50ng/mL)、ITS-A(优选0.5％)和双抗作为细胞传代增殖培养基。
进一步的，所述步骤3)中所述传代增殖培养后，进一步包括分化培养，所述分化培养基为传代增殖培养基中去掉IFN-γ组分。
进一步的，所述步骤3)具体为：1640完全培养基与20％FBS的EGM-MV培养基以体积比为1:1比例的进行混合，作为细胞原代增殖培养基使用，在35-37℃5％CO2下增殖培养；0.25％的胰酶消化5-8min后，传代增值培养，细胞传代增殖培养基为1640基础培养基、20％FBS、50u/mLIFN-γ和双抗，或者1640基础培养基、10％FBS、50u/mL IFN-γ、Human Vegf50ng/mL、0.5％ITS-A和双抗；当人足细胞分化时，培养基中去掉50u/mL IFN-γ进行分化培养，复苏后先进入30-33℃，5％CO2培养2-3天，再进入35-37℃5％CO2培养10-12天。
本发明还包括一种人肾足细胞的制备试剂盒，所述试剂盒中包含消化酶组分、纳米磁珠组分以及培养基组分。
进一步的，所述消化酶组分包含colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶；
进一步的，所述消化酶中colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶的浓度分别为0.5-2mg/mL、0.0625-0.5mg/mL、0.125-0.5mg/mL、0.025-0.5mg/mL和0.025-0.5mg/mL。
更进一步的，所述消化酶中colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶的浓度分别为0.5mg/mL、0.0625mg/mL、0.125mg/mL、0.025mg/mL、0.025mg/mL。
进一步的，所述纳米磁珠组分包含RapidSpheresTM组分，优选来自EasySepTM
Human FITC Positive Selection Kit II；因此组分中还包括EasySepTMBuffer、FcR blocker、FITC-Nephrin、Selection Cocktail等组分。
进一步的，所述培养基组分包括原代增值培养基、传代增殖培养基和分化培养基。
进一步的，所述原代增值培养基包括1640完全培养基与20％FBS的EGM-MV培养基(优选，以体积比为1:1比例的进行混合)；所述传代增殖培养采用1640基础培养基、20％FBS、IFN-γ(优选50u/mL)和双抗，或者，1640基础培养基、10％FBS、IFN-γ(优选50u/mL)、Human Vegf(优选50ng/mL)、ITS-A(优选0.5％)和双抗作为细胞传代增殖培养基；所述所述分化培养基组分为所述传代增殖培养基中去除IFN-γ。
本发明还提供一种上述消化酶组分、纳米磁珠组分以及培养基组分在人肾足细胞的制备中的用途。
与现有技术相比，本发明至少具有如下优势：
1)肾足细胞难于分离培养是本领域公认问题，而本发明应用胶原酶分离的方法来提高产率；抗体-磁珠细胞分选方法使得手术得到的肾脏组织未经分离组织结构也可得到纯度较高的人足细胞。实验证实本发明制得的人肾足细胞，通过western blot及流式细胞仪分析显示，在人肾脏足细胞中synaptopodin、WT-1、Nephrin、Podocin表达为阳性，符合人肾脏足细胞标记物的表达结果。
2)本发明采用全新混合酶组合物(colⅡ+colIV+colⅠ+DNaseⅠ+Hyaluronidase)进行消化，消化效果显著优于现有技术中的常规消化酶。
3)本发明通过对消化培养后的肾脏细胞采用EasySepTMHuman FITC PositiveSelection Kit II磁珠分离出人肾脏足细胞，有效解决部分人肾脏组织手术后是片段性的结构，不能很好的区分肾皮质和肾髓质，也就是即使不能够准确的提取出人的肾脏足细胞，也可通过本专利提出的磁珠分离方法得到纯度较高的人肾脏足细胞。
4)本发明综合优化确立的整个制备体系，可以获得产量高，增值率较高且纯度高的人肾脏足细胞。
5)本发明提出了较优化的人肾脏足细胞的增殖和分化的培养基配方及培养条件方法，有助于提供人肾脏足细胞在体外培养的实验基础性支持。
6)本发明提供的一种肾脏足细胞的制备方法，重复性好，操作简单，适于推广使用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1人肾脏组织制备单细胞后培养第2天的细胞状态图。
图2培养一周后人肾脏细胞形态图。
图3传代增殖后的人肾足细胞形态图。
图4肾脏足细胞进入分化的细胞形态图。
图5 western blot做synaptopodin、WT-1、Podocin标记物蛋白定性分析图。
图6用流式细胞仪检测Nephrin标记物的表达分析图。
图7人肾足细胞的细胞荧光免疫图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。
下面为具体的实施例。
本发明所使用的材料及主要试剂
人肾脏组织来自山西省人民医院泌尿外科切除透明性肾细胞癌病人所得的废弃肾组织；1×PBS博士德生物工程有限公司；EasySepTMBuffer Stemcell公司；EasySepTMHuman FITC Positive Selection Kit II Stemcell公司；Nephrin antibody(FITC)英国biorbyt公司；EGM-MV BulletKit Lonza公司；1640液体培养基Hyclone公司；Human Vegf165上海源叶生物科技有限公司；FBS superfine CELLMA公司；胰蛋白酶-EDTA(0.25％)，含酚红GibcoTM公司；Insulin-Transferrin-Selenium-Sodium Pyruvate(ITS-A)(100X)GibcoTM公司；Synaptopodin Polyclonal antibody Proteintech公司；WT1AntibodyProteintech公司；Actin-Tracker Green-488(微丝绿色荧光探针)碧云天公司；免疫染色洗涤液碧云天公司；免疫荧光染色二抗稀释液碧云天公司；抗荧光淬灭封片液碧云天公司。Hoechst 33258荧光染料Solarbio公司。
实施例1人肾脏足细胞制备例1
1)人肾脏单细胞的消化分离
将肾脏切除手术中所得的肾脏组织剪碎，称重，以1/3的质量体积比，加入相应体积的混合酶(0.5mg/mL colⅡ+0.0625mg/mL ColIV+0.125mg/mL colⅠ+0.025mg/mL DNaseⅠ+0.025mg/mL Hyaluronidase)消化20min，用10％FBS终止消化，过70μm细胞筛，离心，去上清，得到单细胞，将过滤后剩余的组织用注射器头在细胞筛上研磨，清洗细胞筛，过滤后得到所取组织的总的单细胞悬液。用EGM-MV培养基+20％FBS重悬单细胞，及时换液，去掉死细胞。
2)人肾脏足细胞提取—磁珠分选
培养基培养一周后，细胞贴壁生长及细胞数量较多时，用0.25％的胰酶消化，10％FBS终止消化，细胞悬液用细胞计数仪计数得到约1×108个细胞，加入1mLEasySepTMBuffer重悬到5mL的EP管中，加入100uL FcR blocker混匀，加入3μLFITC-Nephrin抗体到细胞中，室温放置15min，加入100μL Selection Cocktail在室温孵育15min，加入50μLRapidSpheresTM室温孵育10min；
加入EasySepTMBuffer到2.5mL，放到磁力架上，室温孵育5min，倾斜磁力架去除上清液；加入EasySepTMBuffer 2.5mL，孵育5min，去除上清，重复两次，去掉上清，加入培养基EGM-MV和20％FBS到培养皿中继续培养。
3)人肾脏足细胞的细胞培养
1640完全培养基与20％FBS的EGM-MV培养基以体积比为1:1比例的进行混合，作为细胞原代增殖培养基使用，其中EGM-MV中有生长因子：GA-1000 0.1％rhEGF 0.1％hydrocortisone 0.1％BBE 0.4％，在37℃ 5％CO2下增殖培养，增殖速率较快。用0.25％的胰酶消化5min后，传代培养，细胞传代增殖培养基为1640基础培养基、20％FBS、50u/mLIFN-γ和双抗；人足细胞细胞分化时，培养基中去掉50u/mL IFN-γ，复苏后需要先进入33℃，5％CO2培养3天，再进入37℃，5％CO2培养12天。
实施例2人肾脏足细胞制备例2
1)人肾脏足细胞消化分离
将肾脏切除手术中所得的肾脏组织剪碎，称重，以1/3的质量体积比，加入相应体积的混合酶(1mg/mL colⅡ+0.125mg/mL ColIV+0.25mg/mL colⅠ+0.05mg/mL DNaseⅠ+0.05mg/mL Hyaluronidase)消化20min，用10％FBS终止消化，过70μm细胞筛，离心，去上清，得到单细胞，将过滤后剩余的组织用注射器橡胶软头在细胞筛上研磨，清洗细胞筛，过滤后得到单细胞悬液；用EGM-MV培养基+20％FBS重悬单细胞，及时换液，去掉死细胞；
2)人肾脏足细胞磁珠分选
培养基培养一周后，细胞贴壁生长及细胞数量较多时，用0.25％的胰酶消化，10％FBS终止消化，细胞悬液用细胞计数仪计数得到约2×108个细胞，加入1mLEasySepTMBuffer重悬到5mL的EP管中，加入200uL FcR blocker混匀，加入6μLFITC-Nephrin抗体到细胞中，室温放置15min，加入200μL Selection Cocktail在室温孵育15min，加入50μLRapidSpheresTM室温孵育10min；
加入EasySepTMBuffer到2.5mL，放到磁力架上，室温孵育5min，倾斜磁力架去除上清液；加入EasySepTMBuffer 2.5mL，孵育8min，去除上清，重复两次，去掉上清，加入培养基EGM-MV和20％FBS到培养皿中继续培养。
3)人肾脏足细胞的细胞培养
1640完全培养基与20％FBS的EGM-MV培养基以体积比为1:1比例的进行混合，作为细胞原代增殖培养基使用，其中EGM-MV中有生长因子：GA-1000 0.1％rhEGF 0.1％hydrocortisone 0.1％BBE 0.4％，在33℃ 5％CO2下增殖培养。
用0.25％的胰酶消化6min后，传代培养，细胞传代增殖培养基为1640基础培养基、10％FBS、50u/mL IFN-γ、Human Vegf 50ng/mL、0.5％ITS-A和双抗，人足细胞细胞分化时，培养基中去掉50u/mL IFN-γ，复苏后先进入33℃，5％CO2培养3天，再进入37℃，5％CO2培养12天。
实施例3人肾脏足细胞制备例3
1)人肾脏足细胞消化分离
将肾脏切除手术中所得的肾脏组织剪碎，称重，以1/3的质量体积比，加入相应体积的混合酶(2mg/mLcolⅡ+0.25mg/mL ColIV+0.5mg/mL colⅠ+0.1mg/mL DNaseⅠ+0.1mg/mLHyaluronidase)消化20min，用10％FBS终止消化，过70μm细胞筛，离心，去上清，得到单细胞，将过滤后剩余的组织用注射器头在细胞筛上研磨，清洗细胞筛，过滤后得到单细胞悬液；用EGM-MV培养基+20％FBS重悬单细胞，及时换液，去掉死细胞；
2)人肾脏足细胞磁珠纯化
培养基培养一周后，细胞贴壁生长及细胞数量较多时，用0.25％的胰酶消化，10％FBS终止消化，细胞悬液用细胞计数仪计数得到约1×108个细胞，加入1mLEasySepTMBuffer重悬到5mL的EP管中，加入100uL FcR blocker混匀，加入3μLFITC-Nephrin抗体到细胞中，室温放置15-20min，加入100μL Selection Cocktail在室温孵育15min，加入50μLRapidSpheresTM室温孵育10min；
加入EasySepTMBuffer到2.5mL，放到磁力架上，室温孵育5min，倾斜磁力架去除上清液；加入EasySepTMBuffer 2.5mL，孵育6min，去除上清，重复两次，去掉上清，加入培养基EGM-MV和20％FBS到培养皿中继续培养。
3)人肾脏足细胞的细胞分选
1640完全培养基与20％FBS的EGM-MV培养基以体积比为1:1比例的进行混合，作为细胞原代增殖培养基使用，其中EGM-MV中有生长因子：GA-1000 0.1％rhEGF 0.1％hydrocortisone 0.1％BBE 0.4％，在37℃5％CO2下增殖培养，增殖速率较快。
用0.25％的胰酶消化5min后，传代培养，细胞传代增殖培养基为1640基础培养基、20％FBS、50u/mLIFN-γ和双抗，人足细胞细胞分化时，培养基中去掉50u/mL IFN-γ，复苏后先进入33℃，5％CO2培养7天，再进入37℃，5％CO2培养7天。
实施例4人肾脏足细胞的鉴定
4.1人肾足细胞的形态学鉴定
实验证明上述制备例1-3证实均能高效获得产量高，增值率高的人肾脏足细胞，进一步将组织消化成细胞培养7天后，细胞贴壁长满培养皿后用倒置光学显微镜观察细胞的形态，传代及进入分化期时观察细胞的形态。用hoechst33258和phalloidin绿色荧光探针对足细胞细胞核和微丝进行荧光染色，对增殖期和分化期的形态变化做鉴定。具体操作：用6孔板将细胞进行铺板，长满后，用PBS清洗2次，用4％的多聚甲醛固定细胞15min，用免疫洗涤液1mL洗涤3次，每次5min；用免疫染色二抗稀释液按照1:40的比例稀释actin-trackergreen-488，每个孔中加入200uL的染色液，室温避光孵育30min，用免疫洗涤液清洗3次，每次孵育5min，加入Hoechst 33258 10ug/mL工作液1mL，37℃孵育20min，PBS清洗2次，每次5min，加入抗荧光淬灭剂封片液50uL，在高内涵40倍空气镜下观察。
2.4.2synaptopodin、WT-1、Podocin标记物的表达
提取蛋白：用6cm的皿进行细胞培养，加入100uL的RIPA裂解液和PMSF的混合液。细胞刮研磨，冰上裂解15分钟，两次。4℃12000rpm离心5min，取上清。
蛋白变性及western blot蛋白定性分析：加入1×lodding buffer，煮沸6分钟，配制10％分离胶和5％上层胶。100v电泳1h40min，100v转膜1.5h，5％脱脂牛奶封闭1h，分别加入1:1000的WT1、podocin和synaptopodin一抗孵育，过夜；孵育二抗，TBST洗膜三次，显影。
2.4.3Nephrin标记物的表达
用6cm的皿进行细胞培养，长满培养皿后，用胰蛋白酶-EDTA(0.25％)孵育4min，使贴壁细胞全部悬浮，100×g离心，用PBS清洗两次，Flow cytometry Staining buffer加入100uL，加入Nephrin antibody-FITC 2uL，对照组不加抗体，室温避光孵育30min，BDFACSCantoTM流式上机分析，收细胞10000个。
结果如下：
图1人肾脏组织制备单细胞后培养第2天的细胞状态图，此时细胞数目较多，有很多细胞团和组织碎片存在。贴壁细胞视野被覆盖，由磁珠分选人肾脏单细胞，分选前后对细胞进行计数，发现磁珠分选效率为4.88％，人肾脏组织消化后7天贴壁，图2为培养一周后人肾脏单细胞形态图。以约105数目的细胞进入传代细胞增殖，在传代分化培养2天后，细胞能够长满T25细胞培养皿；图3为传代增殖后的人肾足细胞形态图。图4为肾脏足细胞进入分化的细胞形态图。原代增殖期细胞为鹅卵石形态，进入分化期时，细胞核增大，细胞膜不规则，伪足出现。
图5为western blot做synaptopodin、WT-1、Podocin标记物蛋白定性分析图。用western blot做蛋白定性分析可以发现synaptopodin、WT-1、Podocin足细胞标记物的表达较高；图6用流式细胞仪检测Nephrin标记物的表达分析图。发现用流式细胞仪检测细胞表面标记Nephrin，阳性率超过98.5％，提纯度较高。图7为人肾足细胞的细胞荧光免疫图，是细胞刚进入分化期的状态图示，由细胞荧光免疫分析可知，增殖期人肾脏足细胞时鹅卵石形态的，进入分化期后开始转化为树状细胞；且进入树状细胞通常是双核的。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种人肾足细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)人肾脏单细胞的消化分离：取离体肾脏组织加入混合消化酶进行消化分离得单细胞悬液；所述混合消化酶中包含colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶；
2)人肾脏足单细胞的分选：所述分选采用足细胞细胞标记物抗体结合足细胞表面标记蛋白，通过能偶联FITC的纳米磁珠，进行人肾脏足细胞的分选。
3)人肾脏足细胞的培养：所述培养包括原代增值培养和传代增殖培养。
2.权利要求1所述的人肾足细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤1)混合消化酶中colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶的浓度分别为0.5-2mg/mL、0.0625-0.5mg/mL、0.125-0.5mg/mL、0.025-0.5mg/mL和0.025-0.5mg/mL。
3.权利要求1-2任一所述的的人肾足细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤1)为：取离体肾脏组织剪碎后，加入相应体积的混合酶消化10-20min，用10％FBS终止消化，过70μm细胞筛，离心去上清，得到单细胞；用EGM-MV培养基+20％FBS重悬单细胞并培养。
4.权利要求1-3任一所述的人肾足细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2)为：步骤1)单细胞悬液培养后，经胰酶消化，加入FcR blocker和FITC-Nephrin抗体，室温放置后再加入Selection Cocktail和RapidSpheresTM孵育，去除上清液。
5.权利要求1-4任一所述的人肾足细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤2)为：步骤1)单细胞悬液培养一周后，经0.25％胰酶消化，加入FcR blocker混匀，加入FITC-Nephrin抗体到细胞中，室温放置15-20min，加入Selection Cocktail在室温孵育15-20min，加入RapidSpheresTM室温孵育10-20min，去除上清；随后在培养基EGM-MV和20％FBS中继续培养；
优选的，所述步骤2)具体为：步骤1)单细胞悬液培养一周后，细胞贴壁生长及细胞数量较多时，用0.25％胰酶消化，10％FBS终止消化，细胞悬液计数约1×108个细胞时，加入1mLEasySepTM Buffer重悬到EP管中，加入100uL FcR blocker混匀，加入3μL FITC-Nephrin抗体到细胞中，室温放置15-20min，加入100μL Selection Cocktail室温孵育15-20min，加入50μL RapidSpheresTM室温孵育10-20min；加入EasySepTMBuffer到2.5mL，磁力架上室温孵育5-8min，去除上清液；再加入EasySepTMBuffer 2.5mL，孵育5-8min，去除上清；随后在培养基EGM-MV和20％FBS中继续培养。
6.权利要求1-5任一所述的人肾足细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中所述原代增殖培养采用1640完全培养基与20％FBS的EGM-MV培养基(优选，以体积比为1:1比例的进行混合)作为细胞原代增殖培养基；所述传代增殖培养采用1640基础培养基、20％FBS、IFN-γ(优选50u/mL)和双抗，或者，1640基础培养基、10％FBS、IFN-γ(优选50u/mL)、HumanVegf(优选50ng/mL)、ITS-A(优选0.5％)和双抗作为细胞传代增殖培养基。
7.权利要求1-6任一所述的人肾足细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中所述传代增殖培养后，进一步包括分化培养，所述分化培养基为传代增殖培养基中去掉IFN-γ组分。
8.权利要求1-7任一所述的人肾足细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤3)具体为：1640完全培养基与20％FBS的EGM-MV培养基以体积比为1:1比例的进行混合，作为细胞原代增殖培养基使用，在35-37℃ 5％CO2下增殖培养；0.25％的胰酶消化5-8min后，传代增值培养，细胞传代增殖培养基为1640基础培养基、20％FBS、50u/mLIFN-γ和双抗，或者1640基础培养基、10％FBS、50u/mL IFN-γ、Human Vegf 50ng/mL、0.5％ITS-A和双抗；当人足细胞分化时，培养基中去掉50u/mLIFN-γ进行分化培养，复苏后先进入30-33℃，5％CO2培养2-3天，再进入35-37℃5％CO2培养10-12天。
9.一种人肾足细胞的制备试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含消化酶组分、纳米磁珠组分以及培养基组分；所述消化酶组分包含colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶；所述纳米磁珠组分选自磁珠RapidSpheresTM；所述培养基组分包括原代增值培养基组分、传代增殖培养基组分和分化培养基组分。
10.权利要求9所述的人肾足细胞的制备试剂盒，其特征在于，所述消化酶组分中colⅡ、colIV、colⅠ、DNaseⅠ和透明质酸酶的浓度分别为0.5-2mg/mL、0.0625-0.5mg/mL、0.125-0.5mg/mL、0.025-0.5mg/mL和0.025-0.5mg/mL；所述纳米磁珠组分中还包含EasySepTMBuffer、FcR blocker、FITC-Nephrin和Selection Cocktail组分；所述原代增值培养基包括1640完全培养基与20％FBS的EGM-MV培养基(优选以体积比为1:1比例的进行混合)；所述传代增殖培养基包含1640基础培养基、20％FBS、IFN-γ(优选50u/mL)和双抗，或者，1640基础培养基、10％FBS、IFN-γ(优选50u/mL)、Human Vegf(优选50ng/mL)、ITS-A(优选0.5％)和双抗；所述分化培养基组分为所述传代增殖培养基中去除IFN-γ后的培养基。
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