CN118028234A - 获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞分离培养技术领域，尤其涉及一种获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法及应用。本发明提供了一种获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法，该方法以小鼠肺组织作为分离原料，经消化和原代培养步骤，得到高纯度神经嵴源细胞。获取的神经嵴源细胞具有较强的增殖能力，体外持续培养数十代后仍具有增殖能力。另外，本发明还利用流式分选的方法分离EGFP标记的神经嵴源细胞，分选后细胞纯度最高，更适合进行EGFP阳性神经嵴源细胞的分选及后续培养。

Description

获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法及应用
技术领域
本发明涉及细胞分离培养技术领域，尤其涉及一种获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法及应用。
背景技术
神经嵴源细胞是胚胎发育过程中的一种重要细胞类型，其起源于早期胚胎发育过程中神经管背部，通过迁移至胚胎的各个部位分化成多种细胞类型，如黑色素细胞、颅面部细胞、软骨细胞、骨细胞、平滑肌细胞、中枢与外周神经元以及胶质细胞等。
由于神经嵴源细胞表现出较强的增殖及多向分化潜能，关于神经嵴源细胞的研究越发深入。但目前尚无从小鼠肺组织中提取原代神经嵴细胞进行体外培养的方法。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法及应用。本发明所述方法获取的神经嵴源细胞具有较强的增殖能力，体外持续培养数十代后仍具有增殖能力。
具体的，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法，将小鼠肺组织剪切后置于细胞消化液中消化，得到细胞群；然后使用原代培养基对所述细胞群进行培养；所述细胞消化液包含2-3mg/mL的胶原酶I和0.5-1.5mg/mL的DNaseI；所述原代培养基以DMEM培养基作为基础培养基，添加10-25vol％的胎牛血清、终浓度80-120IU/L的青霉素-链霉素、0.8-1.2vol％的浓度为90-110mM的丙酮酸钠溶液、0.8-1.2vol％的浓度为190-210mM的L-谷胺酰胺溶液、0.8-1.2vol％的浓度为8-12mM的MEM非必须氨基酸溶液和0.08-0.12vol％的浓度为50-60mM的β-巯基乙醇溶液。使用原代培养基对所述细胞群进行培养后，还包括使用流式细胞分选仪对培养获得的细胞进行分选的步骤。所述流式细胞分选仪的激发波长具有激发EGFP绿色荧光和激发Mtomato红色荧光的能力。
本发明所述方法以小鼠肺组织作为神经嵴源细胞的分离材料，先使用胶原酶I和DNaseI对小鼠肺组织进行消化，然后进行流式细胞分选，再用特定的培养基对分选获得的细胞群进行培养，从而获得高纯度神经嵴源细胞。
本发明将小鼠肺组织剪切后置于细胞消化液中消化，其中所述剪切的方法及器材在本发明中不作特别要求，本领域常规用于组织剪切的方法及器材均可。
在本发明较为优选的实施方式中，剪切后的小鼠肺组织为直径约为1mm的小块。
优选地，在所述细胞消化液中，胶原酶I的浓度为2.5mg/mL。
优选地，在所述细胞消化液中，DNaseI的浓度为1mg/mL。
优选地，在所述原代培养基中，所述胎牛血清的添加量优选为10-22vol％，更优选为10-20vol％，更优选为18-20vol％，更优选为20vol％。
优选地，在所述原代培养基中，青霉素-链霉素的终浓度为90-110IU/L；更优选为100IU/L。
优选地，在所述原代培养基中，所述丙酮酸钠溶液、所述L-谷胺酰胺溶液和所述MEM非必须氨基酸(MEM non-essential amino acids)溶液的添加量各自优选为0.9-1.2vol％；更优选为1.0vol％。所述β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)溶液的添加量优选为0.09-0.12vol％；更优选为0.1vol％。所述丙酮酸钠溶液的浓度优选为100mM。所述L-谷氨酰胺溶液的浓度优选为200mM。所述MEM非必须氨基酸溶液的浓度优选为10mM。所述β-巯基乙醇溶液的浓度优选为55mM。
本发明对所述细胞消化液或所述原代培养基中的各组分来源不作特别限定，本领域常规市售来源均可。
进一步地，在本发明提供的一种优选的实施方式中，所述小鼠肺组织中的神经嵴源细胞具有表达EGFP蛋白的能力。
更优选地，所述小鼠肺组织取材自具有Wnt1-Cre和mTomato-mGFP双杂合子的转基因小鼠。
在本发明提供的具体实施方式中，所述具有Wnt1-Cre和mTomato-mGFP双杂合子的转基因小鼠参照专利公开号：CN114946764A中记载的方法得到，包括如下步骤：(1)将杂合子Wnt1-Cre雄性转基因小鼠、纯合mTomato-mGFP雄性转基因小鼠分别与对应野生型转基因小鼠杂交，获得F1代杂合子Wnt1-Cre转基因小鼠和F1代杂合子mTomato-mGFP转基因小鼠；(2)将F1代杂合子Wnt1-Cre转基因小鼠和F1代杂合子mTomato-mGFP转基因小鼠进行杂交获得F2代转基因小鼠，筛选获得其中的Wnt1-Cre和mTomato-mGFP双杂合子的转基因小鼠即为所述永久标记神经嵴来源细胞的转基因动物；其中，Wnt1-Cre表示该转基因小鼠在Wnt1基因控制下表达Cre重组酶；mTomato-mGFP表示该转基因小鼠具有双报告基因，且在步骤(2)中Cre介导重组后的细胞中表达一种报告基因，在非重组细胞中表达另一种报告基因。该来源小鼠的肺组织中可分离到EGFP标记的神经嵴源细胞。
在该优选实施方式中，由于所述小鼠肺组织中的神经嵴源细胞具有表达EGFP蛋白的能力。本发明可利用EGFP蛋白的荧光特性，将神经嵴源细胞从细胞培养物中分离出来，剔除杂细胞，从而使获得的神经嵴源细胞纯度更高。
优选地，所述小鼠肺组织取材自矽肺造模小鼠。
本发明在前期的矽肺研究中发现，经矽肺造模后，矽肺模型组小鼠肺组织中发现异常聚集的神经嵴源细胞，且荧光定量显示矽肺组中EGFP荧光强度高于空白组小鼠，该实验结果指示矽肺模型组中神经嵴源细胞数量高于空白组小鼠。进而使用矽肺造模后的小鼠，神经嵴源细胞的分离及纯化培养效果相较更好。
优选地，所述流式细胞分选仪为Beckman MoFlo Astrios EQ。
流式细胞分选仪器和参数对分选得到的细胞纯度很重要。本发明对比了BD FACSS ORP ARIAII和Beckman MoFlo Astrios EQ两种不同型号的仪器，发现BD FACS S ORPARIAII仅具备488nm的激发波长，该波长可以同时激发EGFP绿色荧光也能激发Mtomato红色荧光，但是无法将两者完全区分，会导致进行分选后原代培养的EGFP阳性神经嵴源细胞中混杂着MT阳性(表达Mtomato蛋白)的细胞，导致神经嵴源细胞的生长受到限制，无法纯化；而Beckman MoFlo Astrios EQ由于同时具备488nm和561nm的激发波长，分选后细胞纯度最高，更适合进行EGFP阳性神经嵴源细胞的分选。
进一步地，在本发明提供的一种优选的实施方式中，使用流式细胞分选仪对培养获得的细胞进行分选后，还包括分化培养的步骤；所述分化培养使用的培养基以MEM-α培养基作为基础培养基，添加10-25vol％的胎牛血清、终浓度80-120IU/L的青霉素-链霉素、0.8-1.2vol％的浓度为90-110mM的丙酮酸钠溶液、0.8-1.2vol％的浓度为190-210mM的L-谷胺酰胺溶液、0.8-1.2vol％的浓度为8-12mM的MEM非必须氨基酸溶液和0.08-0.12vol％的浓度为50-60mM的β-巯基乙醇溶液。
优选地，在所述分化培养使用的培养基中，所述胎牛血清的添加量优选为10-22vol％，更优选为10-20vol％，更优选为18-20vol％，更优选为20vol％。
优选地，在所述分化培养使用的培养基中，青霉素-链霉素的终浓度为90-110IU/L；更优选为100IU/L。
优选地，在所述分化培养使用的培养基中，所述丙酮酸钠溶液、所述L-谷胺酰胺溶液和所述MEM非必须氨基酸(MEM non-essential amino acids)溶液的添加量各自优选为0.9-1.2vol％；更优选为1.0vol％。所述β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)溶液的添加量优选为0.09-0.12vol％；更优选为0.1vol％。所所述丙酮酸钠溶液的浓度优选为100mM。所述L-谷氨酰胺溶液的浓度优选为200mM。所述MEM非必须氨基酸溶液的浓度优选为10mM。所述β-巯基乙醇溶液的浓度优选为55mM。
本发明对所述分化培养使用的培养基中的各组分来源不作特别限定，本领域常规市售来源均可。
第二方面，本发明提供了所述获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法在神经嵴源细胞生产中的应用。和其他方法获得的神经嵴源细胞相比，本发明获取的神经嵴源细胞具有相较更强的增殖能力，体外持续培养数十代后仍具有增殖能力。
第三方面，本发明还提供了一种神经嵴源细胞的鉴定方法，以前述方法获得的神经嵴源细胞为待测样品，将待测细胞置于多聚赖氨酸包被的玻片上贴壁培养20-28h，然后使用荧光检测装置进行检测，根据检测结果判断待测细胞是否为神经嵴源细胞；判断的方法为：若检测到绿色荧光，则判断待测细胞为神经嵴源细胞。
有益效果：
本发明提供了一种获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法，该方法以小鼠肺组织作为分离原料，经消化和原代培养步骤，得到高纯度神经嵴源细胞。获取的神经嵴源细胞具有较强的增殖能力，体外持续培养数十代后仍具有增殖能力。另外，本发明还利用流式分选的方法分离EGFP标记的神经嵴源细胞，分选后细胞纯度最高，更适合进行EGFP阳性神经嵴源细胞的分选及后续培养。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1为本发明实施例1中的小鼠肺组织原代细胞分离培养图，标尺200μm。
图2为本发明实施例1中的小鼠肺组织原代细胞免疫荧光图，图中EGFP阳性细胞(绿色)即神经嵴源细胞，标尺200μm。
图3为本发明实施例1中的BD FACS S ORP ARIAII分选图，左图为流式分选时的散点图，图中P4为EGFP阳性的神经嵴源细胞，右图为EGFP信号直方图。
图4为本发明实施例1中的BD FACS S ORP ARIAII分选后神经嵴源细胞原代培养图，标尺200μm。可以看到部分细胞表达Mtomato蛋白，说明分选得到的细胞并非纯的神经嵴源细胞。
图5为本发明实施例1中的BD FACS S ORP ARIAII分选后神经嵴源细胞免疫荧光图。从最右边的图片中可以发现，EGFP阳性的神经嵴源细胞中混杂着不表达EGFP的细胞，即MT阳性的其他细胞，细胞不纯导致实验不能继续展开。
图6为本发明实施例1中的Beckman MoFlo Astrios EQ分选散点图。
图7为本发明实施例1中的Beckman MoFlo Astrios EQ分选后神经嵴源细胞原代培养图，由图可见分选的细胞纯度很高，不存在其他混杂细胞。
图8为本发明实施例1中的Beckman MoFlo Astrios EQ分选后神经嵴源细胞免疫荧光图，其中SOX10为神经嵴干细胞标志物。培养后的细胞仍然表达神经嵴干细胞标志物SOX10，红色代表SOX10，绿色代表EGFP，标尺100μm。
图9为本发明实施例1中的Beckman MoFlo Astrios EQ分选后神经嵴源细胞用间充质细胞分化培养基培养后的细胞免疫荧光图。培养后的细胞表达间充质细胞标志物，红色分别代表α-SMA和ColA1、FN1，绿色代表EGFP，标尺100μm。
图10为本发明实施例1中的小鼠肺组织原代细胞P26代细胞形态和荧光图，图标尺200μm，细胞形态清晰，细胞能够正常增殖，没有出现老化迹象。
图11为本发明实施例1中的小鼠肺组织原代细胞P26代细胞活性测定结果，神经嵴源细胞的细胞活性为95％，细胞活性较高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
以下实施例中所用实验材料来源如下：
矽肺造模小鼠由市售小鼠(007676，购买自“The Jackson lab”)参照专利公开号：CN114946764A中记载的方法得到。
DMEM培养基，购买自Gibco，货号为11885084。
MEM-α培养基，购买自Gibco，货号为12571063。
胎牛血清，购买自Bovogen，货号为SFBS。
青霉素-链霉素，购买自Gibco，货号为15070063。
浓度为100mM的丙酮酸钠溶液，购买自Gibco，货号为11360070。
浓度为200mM的L-谷胺酰胺溶液，购买自Gibco，货号为A2916801。
浓度为10mM的MEM non-essential amino acids(非必须氨基酸)溶液，购买自Gibco，货号为11140050。
浓度为55mM的2-mercaptoethanol(β-巯基乙醇)溶液，购买自Gibco，货号为21985023。
实施例1
本实施例提供小鼠肺组织中神经嵴源细胞的分离、培养与分化方法。具体如下：
(1)小鼠肺组织中神经嵴源细胞的原代分离：
取矽肺造模30天小鼠的肺组织，在无菌条件下，剪成1毫米左右小块后，加入PBS磷酸盐缓冲液(含0.05％BSA)转移至25T培养瓶中，加入胶原酶I(2.5mg/ml)、DNaseI(1mg/ml)，放于温控摇床中37℃、750rpm消化1小时。消化结束后，将消化液用40um细胞筛网进行过滤，此时细胞悬液300g、4℃离心15mins后弃去上清，加入10ml PBS磷酸盐缓冲液洗涤两遍后，弃上清，用6ml原代培养基重悬，接种于预先加入4ml原代培养基的10cm皿(底面积约50cm2)中，10cm皿中总共接种1.5×106个细胞(分散于10ml原代培养及悬液中)，此时接种的密度为30000个细胞每平方厘米。培养两天后对细胞进行换液，随后每四天传代一次，如图1和2。
上述原代培养基为：DMEM培养基、20vol％胎牛血清、100IU/L青霉素-链霉素、1vol％丙酮酸钠溶液、1vol％L-谷胺酰胺溶液、1vol％MEM non-essential amino acids(非必须氨基酸)溶液、0.1vol％2-mercaptoethanol(β-巯基乙醇)溶液。
(2)小鼠肺组织来源的神经嵴源细胞的分选纯化、增殖培养及鉴定：
当细胞汇合度达到80-90％时，弃去培养基，用PBS磷酸缓冲盐溶液清洗两遍，加1ml胰酶在37℃下消化3-5分钟，显微镜下观察细胞变圆变亮时加入3ml的原代培养基终止消化，收集细胞悬液在4℃下1500rpm离心5分钟，弃去上清，加入FACS缓冲液清洗两遍，最后用FACS缓冲液重悬细胞，上机分选。
本发明对比了BD FACS S ORP ARIAII和Beckman MoFlo Astrios EQ两种不同型号的仪器，发现BD FACS S ORP ARIAII仅具备488nm的激发波长，该波长可以同时激发EGFP绿色荧光也能激发Mtomato红色荧光，但是无法将两者完全区分，会导致进行分选后原代培养的EGFP阳性神经嵴源细胞中混杂着MT阳性的细胞，导致神经嵴源细胞的生长受到限制，无法纯化如图3，4和5；而Beckman MoFlo Astrios EQ由于同时具备488nm和561nm的激发波长，分选后细胞纯度最高，更适合进行EGFP阳性神经嵴源细胞的分选如图6和7。
其中，BD FACS S ORP ARIAII分选参数设置情况见表1。Beckman MoFlo AstriosEQ分选参数设置情况见表2。
表1
参数名称 参数值 单位
FSC 160 V
SSC 289 V
GFP 385 V
PE 568 V
Freq 47 无
Amp1 40.1 无
Drop1 145 无
Gap 15 无
表2
参数名称 参数值 单位
488-FSC 283 V
488-SSC 245 V
488-526 380 V
561-579 400 V
Theshod(％) 2.5 无
Tigger 488-SSC 无
用流式分选仪分选EGFP阳性细胞后，将所收集的细胞悬液在1500rpm，4℃下离心5分钟，弃去上清，用原代培养基进行单层传代扩增培养，如图4和7。
(3)为探究肺组织来源的神经嵴源细胞是否保留神经嵴干细胞的分子标记，使用细胞免疫荧光法对EGFP和SOX10进行免疫荧光共染色，如图8，将细胞爬片置于12孔板中，每孔接种5×104个神经嵴源细胞，24小时后弃去培养基，用PBS缓冲液静置清洗2-3遍。每孔加入1ml 4％多聚甲醛固定30分钟，细胞固定后，将培养板置于摇床上，950rpm，PBS缓冲液清洗3遍，每遍清洗5分钟。用0.5％Triton-X100(细胞核上表达的蛋白)或者0.1％Twen-20(胞质中表达的蛋白)室温通透20分钟，PBST缓冲液清洗3遍，每遍清洗5分钟，此步骤清洗结束后，将爬片晾干，随后用1％的BSA在室温下进行封闭30分钟。封闭结束后，4℃孵育一抗过夜。PBST缓冲液清洗3遍，每遍清洗5分钟，37℃中孵育荧光二抗A594，至此后所有步骤均要避光操作。1小时后，PBST缓冲液清洗3遍，每遍清洗5分钟。用DAPI染色液复染细胞核，每孔加300μl，避光孵育5分钟，PBST缓冲液清洗3遍，每遍清洗5分钟。最后，用抗荧光淬灭封片液把细胞爬片倒扣在载破片上，使用共聚焦显微镜拍照。
(4)小鼠肺组织来源的神经嵴源细胞的分化培养及鉴定：
为了验证神经嵴源细胞具有分化潜能，将分选后的神经嵴源细胞接种于MSC培养基中，每两天进行换液，每四天进行传代。
MSC(间充质细胞)分化培养基为：MEM-α培养基、20vol％胎牛血清、100IU/L青霉素-链霉素、1vol％L-谷胺酰胺溶液、1vol％MEM non-essential amino acids(非必须氨基酸)溶液、1vol％sodium pyruvate(丙酮酸钠)溶液、0.1vol％2-mercaptoethanol(β-巯基乙醇)溶液。
对分化培养后的细胞表达间充质细胞特异分子的能力进行鉴定如图9，其具体方法为：将细胞消化后传至poly-lysine(多聚赖氨酸)包被的玻片上，待细胞贴壁24h后，4％多聚甲醛固定15分钟，PBS浸洗细胞爬片3遍，每遍5min。然后用0.5％Triton X-100(PBS配制)室温通透20min，PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水纸吸干PBS，在爬片上滴加1％BSA，室温封闭30分钟，吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜。第二天，弃去一抗，用PBS浸洗细胞爬片3次，每次5min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中37℃避光孵育1h，PBS浸洗3次，每次5min，滴加DAPI避光孵育5min复染核，用PBS浸洗细胞爬片3次，洗去多余的DAPI染料，用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
本发明可以从小鼠肺组织中提取神经嵴细胞，获得的小鼠肺组织来源的神经嵴细胞，经过流式分选后具有较高的纯度和增殖能力。本发明的神经嵴源细胞培养方法可使分离的神经嵴细胞具有较强的增殖能力，并能维持神经嵴细胞特性，获得的神经嵴源细胞传代至第26代时仍然具有较强的增殖能力，如图10和图11。
传统的原代神经嵴细胞纯化过程较为复杂，耗费时间较长，并且鉴定过程也十分复杂。与传统的神经嵴细胞原代培养相比较，本专利采用流式分选的方法将神经嵴源细胞进行分选，可以保证细胞的纯度，并且易于鉴定，还能够缩短细胞培养的时间，在比较短的时间内可获得高纯度的神经嵴源细胞。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法，其特征在于，将小鼠肺组织剪切后置于细胞消化液中消化，得到细胞群；然后使用原代培养基对所述细胞群进行培养；所述细胞消化液包含2-3mg/mL的胶原酶I和0.5-1.5mg/mL的DNaseI；所述原代培养基以DMEM培养基作为基础培养基，添加10-25vol％的胎牛血清、终浓度80-120IU/L的青霉素-链霉素、0.8-1.2vol％的浓度为90-110mM的丙酮酸钠溶液、0.8-1.2vol％的浓度为190-210mM的L-谷胺酰胺溶液、0.8-1.2vol％的浓度为8-12mM的MEM非必须氨基酸溶液和0.08-0.12vol％的浓度为50-60mM的β-巯基乙醇溶液；使用原代培养基对所述细胞群进行培养后，还包括使用流式细胞分选仪对培养获得的细胞进行分选的步骤；所述流式细胞分选仪的激发波长具有激发EGFP绿色荧光和激发Mtomato红色荧光的能力。
2.根据权利要求1所述获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法，其特征在于，所述小鼠肺组织中的神经嵴源细胞具有表达EGFP蛋白的能力。
3.根据权利要求2所述获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法，其特征在于，所述小鼠肺组织取材自具有Wnt1-Cre和mTomato-mGFP双杂合子的转基因小鼠。
4.根据权利要求1-3任意一项所述获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法，其特征在于，所述小鼠肺组织取材自矽肺造模小鼠。
5.根据权利要求1所述获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法，其特征在于，所述流式细胞分选仪为Beckman MoFlo Astrios EQ。
6.根据权利要求1或5所述获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法，其特征在于，使用流式细胞分选仪对培养获得的细胞进行分选后，还包括分化培养的步骤；所述分化培养使用的培养基以MEM-α培养基作为基础培养基，添加10-25vol％的胎牛血清、终浓度80-120IU/L的青霉素-链霉素、0.8-1.2vol％的浓度为90-110mM的丙酮酸钠溶液、0.8-1.2vol％的浓度为190-210mM的L-谷胺酰胺溶液、0.8-1.2vol％的浓度为8-12mM的MEM非必须氨基酸溶液和0.08-0.12vol％的浓度为50-60mM的β-巯基乙醇溶液。
7.权利要求1-6任意一项所述获得小鼠肺组织中神经嵴源细胞的方法在神经嵴源细胞生产中的应用。
8.神经嵴源细胞的鉴定方法，其特征在于，以权利要求1-6任意一项所述方法获得的神经嵴源细胞为待测样品，将待测细胞置于多聚赖氨酸包被的玻片上贴壁培养20-28h，然后使用荧光检测装置进行检测，根据检测结果判断待测细胞是否为神经嵴源细胞；判断的方法为：若检测到绿色荧光，则判断待测细胞为神经嵴源细胞。
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