CN113683713A - 一种中国被毛孢多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种中国被毛孢多糖及其制备方法和应用，属于多糖提取技术领域。本发明所述中国被毛孢多糖中糖残基的构型为α构型，糖苷键类型为(1→4)‑D‑葡聚糖，在O‑6、O‑3或O‑2连有单个α‑D‑Glcp分支，分子量(Mw)为800～1000kDa。该中国被毛孢多糖结构明确，具有免疫调节活性，能够显著增强巨噬细胞的免疫功能且作用机制明确，增加免疫因子NO、IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的生成，作用机制为激活巨噬细胞内p38、JNK和NF‑κB信号通路；而且，该中国被毛孢多糖能够显著增强淋巴细胞免疫功能，增加脾淋巴细胞(T/B淋巴细胞)增殖，且免疫活性强于中国被毛孢粗多糖和中国被毛孢菌粉。

Description

一种中国被毛孢多糖及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及多糖提取技术领域，尤其涉及一种中国被毛孢多糖及其制备方法和应用。
背景技术
冬虫夏草为传统名贵中药材，是冬虫夏草菌和蝙蝠蛾科昆虫幼虫的复合体。研究表明，冬虫夏草中含有多糖、核苷、蛋白质或多肽、甾醇和D-甘露醇等多种生物活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、抗菌、抗疲劳和保肾保肝等多种药理功效。作为冬虫夏草的无性型菌株，中国被毛孢(Hirsutella sinensis Liu,Guo,Yu et Zeng,sp.nov.)具有抗疲劳、抗肿瘤、抗炎、保肾和抑制肺纤维化等多种药理活性，其发酵产物被广泛用于医药和保健食品，其最具代表性的产品为杭州华东医药股份有限公司生产的“百令胶囊”(中国被毛孢Cs-C-Q80发酵菌丝体)。2010年，中国被毛孢以冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis)的无性型菌株被《中华人民共和国药典》(2010版)收录。
糖类化合物是自然界中存在最为广泛的，有着重要生物功能的一类化合物，包括单糖及其衍生物、寡糖、多糖和复合多糖等。真菌多糖是从真菌子实体、菌丝体、发酵液中分离得到的一类活性多糖。作为一种天然生物大分子，真菌多糖因其广泛的药理活性和低毒副作用的优点，成为生物学和医学领域中的研究热点。冬虫夏草多糖(CordycepsPolysacchride，CP)具有免疫调节、降血糖、抗肿瘤等多种药理功效，是冬虫夏草的主要活性成分之一。但是，中国被毛孢多糖的研究却始终未得到广泛关注。
作为野生冬虫夏草的重要补充替代资源，中国被毛孢，特别是发酵冬虫夏草菌粉Cs-C-Q80的化学成分和药理活性研究被越来越多的研究者关注。但是，由于多糖结构的复杂性，中国被毛孢中多糖类成分的研究还不够全面深入，现有研究主要集中在分离纯化技术和单糖组成方面，对其中多糖类成分的整体认识还不清楚。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中国被毛孢多糖及其制备方法和应用，所述中国被毛孢多糖结构明确且具有优异的免疫调节活性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种中国被毛孢多糖，具有式1所示结构：
Figure BDA0003249481980000021
式1中，x+y+z＝80～90。
优选的，所述中国被毛孢多糖中糖残基的构型为α构型，糖苷键类型为(1→4)-D-葡聚糖，在O-6、O-3或O-2连有单个α-D-Glcp分支；分子量Mw为800～1000kDa。
本发明提供了上述技术方案所述中国被毛孢多糖的制备方法，包括以下步骤：
将中国被毛孢菌粉与水混合，进行提取，将所得提取液浓缩后，得到浓缩提取液；
将所述浓缩提取液与乙醇溶液混合，进行醇沉，得到中国被毛孢粗多糖；
将所述中国被毛孢粗多糖的水溶液进行阴离子交换柱层析分离，将所得分离产物依次进行第一洗脱、第一透析和第一干燥，得到中国被毛孢上级多糖；
将所述中国被毛孢上级多糖与氯化钠水溶液混合，将所得混合液采用凝胶过滤柱层析进行纯化，将所得纯化物依次进行第二洗脱、第二透析和第二干燥，得到中国被毛孢多糖。
优选的，所述中国被毛孢菌粉与水的用量比为1g:(5～20)mL。
优选的，所述提取的次数为1～4次，每次提取的温度独立为80～100℃，时间独立为1～3h；所述浓缩的温度为80～100℃。
优选的，所述乙醇溶液的质量浓度为95～100％；所述浓缩提取液与乙醇溶液混合所得混合液中乙醇的质量浓度为70～90％。
优选的，所述醇沉的温度为4～30℃，时间为12～36h。
优选的，所述中国被毛孢粗多糖的水溶液的浓度为1～20mg/mL；所述阴离子交换柱层析所用阴离子交换剂为DEAE-纤维素。
优选的，所述中国被毛孢上级多糖与氯化钠水溶液混合所得混合液中，所述中国被毛孢上级多糖的浓度为1～20mg/mL；所述凝胶过滤柱层析所用凝胶过滤填料为Sepharose CL-6B。
本发明提供了上述技术方案所述中国被毛孢多糖或上述技术方案所述制备方法制备得到的中国被毛孢多糖在制备免疫增强药物中的应用。
本发明提供了一种中国被毛孢多糖，所述中国被毛孢多糖中糖残基的构型和糖苷键为：α-(1→4)-D-葡聚糖，在O-6、O-3或O-2连有单个α-D-Glcp分支，分子量(Mw)为800～1000kDa。该中国被毛孢多糖结构明确，具有免疫调节活性，能够与巨噬细胞、淋巴细胞等免疫细胞表面受体相互作用，激活其免疫功能，显著增强巨噬细胞的免疫功能且作用机制明确，增加免疫因子NO、IL-1β、IL-6和TNF-α的生成，作用机制为激活巨噬细胞内p38、JNK和NF-κB信号通路；而且，该中国被毛孢多糖能够显著增强淋巴细胞免疫功能，增加脾淋巴细胞(T/B淋巴细胞)增殖，且免疫活性强于中国被毛孢粗多糖和中国被毛孢菌粉。
本发明提供了所述中国被毛孢多糖的制备方法，本发明采用水提醇沉的方法得到中国被毛孢多糖，然后采用色谱分离技术(包括阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱分离技术)，对中国被毛孢多糖分离纯化，得到结构明确且具有活性的中国被毛孢多糖，对冬虫夏草野生资源的替代研究和发酵菌粉多糖类产品的深入开发奠定了基础。
附图说明
图1为实施例1制备的HSWP-2a的1H-NMR谱图；
图2为实施例1制备的HSWP-2a的13C-NMR谱图；
图3为实施例1制备的HSWP-2a的COSY-NMR谱图；
图4为实施例1制备的HSWP-2a的HSQC-NMR谱图；
图5为实施例1制备的HSWP-2a的HMBC-NMR谱图；
图6为实施例1制备的HSWP-2a的NOESY-NMR谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种中国被毛孢多糖，具有式1所示结构：
Figure BDA0003249481980000041
式1中，x+y+z＝80～90。
在本发明中，所述中国被毛孢多糖中糖残基的构型为α构型，糖苷键类型为(1→4)-D-葡聚糖，在O-6、O-3或O-2连有单个α-D-Glcp分支；分子量(Mw)为800～1000kDa，更优选为836～925kDa；进一步优选为852～902kDa。
本发明提供了上述技术方案所述中国被毛孢多糖的制备方法，包括以下步骤：
将中国被毛孢菌粉与水混合，进行提取，将所得提取液浓缩后，得到浓缩提取液；
将所述浓缩提取液与乙醇溶液混合，进行醇沉，得到中国被毛孢粗多糖；
将所述中国被毛孢粗多糖的水溶液进行阴离子交换柱层析分离，将所得分离产物依次进行第一洗脱、第一透析和第一干燥，得到中国被毛孢上级多糖；
将所述中国被毛孢上级多糖与氯化钠水溶液混合，将所得混合液采用凝胶过滤柱层析进行纯化，将所得纯化物依次进行第二洗脱、第二透析和第二干燥，得到中国被毛孢多糖。
在本发明中，若无特殊说明，所需制备原料均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明将中国被毛孢菌粉与水混合，进行提取，将所得提取液浓缩后，得到浓缩提取液。本发明对所述中国被毛孢菌粉的来源没有特殊的限定，本领域熟知的市售商品即可；在本发明的实施例中，具体为Ophiocordyceps sinensis发酵菌粉CS-C-Q80，购于青海珠峰虫草药业有限公司。
本发明对所述中国被毛孢菌粉与水混合的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程将物料混合均匀即可。在本发明中，所述中国被毛孢菌粉与水的用量比优选为1g:(5～20)mL，更优选为1g:(5～18)mL，进一步优选为1g:(10～12)mL。本发明利用水提取中国被毛孢菌粉中的多糖。
在本发明中，所述提取的次数优选为1～4次，每次提取的温度独立优选为80～100℃，更优选为88～96℃，进一步优选为90～95℃；时间独立优选为1～3h，更优选为1.5～2h。
完成每次提取后，本发明优选将所得提取物料进行离心，得到沉淀和上清液；将所得沉淀重复进行下次提取。在本发明中，每次离心的转速独立优选为3000～10000转/分钟，更优选为4500～8300转/分钟，进一步优选为5000～7500转/分钟；时间独立优选为15～60min，更优选为30～40min。
完成所述提取后，本发明优选将离心所得上清液合并，将所得提取液进行浓缩，得到浓缩提取液。在本发明中，所述浓缩的温度优选为80～100℃，本发明优选将所得提取液浓缩至原体积的1/10～1/5，更优选为1/7～1/6。
得到浓缩提取液后，本发明将所述浓缩提取液与乙醇溶液混合，进行醇沉，得到中国被毛孢粗多糖。本发明优选将所述浓缩提取液冷却至室温后，再与乙醇溶液混合。在本发明中，所述乙醇溶液的质量浓度优选为95～100％；所述浓缩提取液与乙醇溶液混合所得混合液中乙醇的质量浓度优选为70～90％，更优选为76～85％，更优选为80％。本发明对将所述浓缩提取液与乙醇溶液混合的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程得到上述浓度的混合液即可。
在本发明中，所述醇沉优选在静置条件下进行；所述醇沉的温度优选为4～30℃，更优选为12～16℃；时间优选为12～36h，更优选为22～24h。
在所述醇沉过程中，中国被毛孢粗多糖成分在乙醇作用下沉淀。
完成所述醇沉后，本发明优选将所得物料进行离心，将所得沉淀进行干燥，得到中国被毛孢粗多糖。在本发明中，所述离心的转速优选为3000～10000转/分钟，更优选为3500～5500转/分钟，时间优选为15～60min，更优选为30～51min；所述干燥的方式优选为冷冻干燥；所述冷冻干燥的冷阱温度优选＜-60℃，更优选为-65℃、-61℃、-69℃、-63℃或-67℃，真空度优选<15Pa，更优选为9～11Pa，进一步优选为10Pa。在本发明的实施例中，所述冷冻干燥所用设备为北京博医康实验仪器有限公司的FD-1型真空冷冻干燥机。
得到中国被毛孢粗多糖后，本发明将所述中国被毛孢粗多糖的水溶液进行阴离子交换柱层析分离，将所得分离产物依次进行第一洗脱、第一透析和第一干燥，得到中国被毛孢上级多糖。在本发明中，所述中国被毛孢粗多糖的水溶液的浓度优选为1～20mg/mL，更优选为5.5～12mg/mL，进一步优选为5.5～10mg/mL。
在本发明中，所述阴离子交换柱层析所用阴离子交换剂优选为DEAE-纤维素；本发明对所述阴离子交换柱层析的具体过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程进行即可。
在本发明中，所述第一洗脱的过程优选为依次采用水和氯化钠水溶液(0.25M)进行洗脱，分别洗脱2～3倍柱体积(CV)，收集0.25M氯化钠水溶液洗脱部分，得到洗脱液。在本发明中，所述洗脱柱体积更优选为2.2～2.8倍，更优选为2.5倍。
本发明优选将所述洗脱液装入透析袋，进行第一透析。在本发明中，所述第一透析所用透析袋优选为再生纤维素膜或纤维素酯膜，截留分子量优选为500～10000Da，更优选为800～8000Da，进一步优选为1000～6000Da；本发明对所述透析袋的来源没有特殊的限定，本领域熟知的市售商品即可。在本发明中，所述第一透析的过程优选为先流水透析12～48h，然后蒸馏水透析12～24h，将透析袋内溶液浓缩至原体积的1/10～1/5，更优选为1/9～1/6，进一步优选为1/7。在本发明中，所述流水透析所用水优选为自来水；所述流水透析的时间更优选为24～36h，进一步优选为28～34h，所述蒸馏水透析的时间更优选为16～20h，更优选为18h。
完成所述第一透析后，本发明将所得物料进行第一干燥；所述第一干燥的方式优选为冷冻干燥；所述冷冻干燥的冷阱温度优选＜-60℃，更优选为-70℃、-66℃、-63℃、-67℃或-65℃，真空度优选<15Pa，更优选为14Pa、13Pa、12Pa、7Pa、或5Pa。在本发明的实施例中，所述冷冻干燥所用设备为北京博医康实验仪器有限公司的FD-1型真空冷冻干燥机。
得到中国被毛孢上级多糖后，本发明将所述中国被毛孢上级多糖与氯化钠水溶液混合，将所得混合液采用凝胶过滤柱层析进行纯化，将所得纯化物依次进行第二洗脱、第二透析和第二干燥，得到中国被毛孢多糖。在本发明中，所述中国被毛孢上级多糖与氯化钠水溶液混合所得混合液中，所述中国被毛孢上级多糖的浓度优选为1～20mg/mL，更优选为2～10mg/mL，进一步优选为5～8mg/mL；所述氯化钠水溶液的浓度优选为0.05～0.5mol/L，更优选为0.15～0.4mol/L，进一步优选为0.25～0.30mol/L。本发明对所述中国被毛孢上级多糖与氯化钠水溶液混合的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的过程得到上述浓度的混合液即可。
在本发明中，所述凝胶过滤柱层析所用凝胶过滤填料优选为Sepharose CL-6B；本发明对所述凝胶过滤柱层析进行纯化的过程没有特殊的限定，按照本领域熟知的操作进行过柱纯化即可。
在本发明中，所述第二洗脱所用洗脱试剂优选为氯化钠水溶液，所述氯化钠水溶液的浓度优选为0.05～0.5mol/L，更优选为0.15～0.4mol/L，进一步优选为0.25～0.30mol/L。本发明优选洗脱1倍柱体积(CV)，收集0.4～0.8CV洗脱液，进行第二透析；更优选为0.42～0.75CV，还优选为0.45～0.75CV，进一步优选为0.5～0.7CV。
在本发明中，所述第二透析所用透析袋优选为再生纤维素膜或纤维素酯膜，截留分子量优选为500～10000Da，更优选为800～8000Da，进一步优选为1000～3000Da；所述第二透析的过程优选为先流水透析12～48h，然后蒸馏水透析12～24h，将透析袋内溶液浓缩至原体积的1/10～1/5，更优选为1/8～1/6。在本发明中，所述流水透析的时间优选为17～38h，更优选为24～30h，所述蒸馏水透析的时间优选为16～21h，更优选为17～20h。
完成所述第二透析后，本发明将所得物料进行第二干燥；所述第二干燥的方式优选为冷冻干燥；所述冷冻干燥的冷阱温度优选＜-60℃，更优选为-66℃、-61℃、-64℃或-61℃；真空度优选<15Pa，更优选为10Pa、6Pa、11Pa、或5Pa。在本发明的实施例中，所述冷冻干燥所用设备为北京博医康实验仪器有限公司的FD-1型真空冷冻干燥机。
本发明提供了上述技术方案所述中国被毛孢多糖或上述技术方案所述制备方法制备得到的中国被毛孢多糖在制备免疫增强药物中的应用。本发明对所述应用的方法没有特殊的限定，按照本领域熟知的方法应用即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)中国被毛孢菌粉(Ophiocordyceps sinensis发酵菌粉CS-C-Q80，购于青海珠峰虫草药业有限公司)，按照与水的用量比1g:10mL，在90℃条件下提取2h，将所得提取溶液在5000转/分钟离心30min，分别收集沉淀和上清液；将所得沉淀再按照上述条件提取2次；提取后离心所得上清液合并，90℃条件下浓缩至原体积的1/5，得到浓缩提取液；
(2)将所述浓缩提取液冷却至室温后，加入质量浓度为95％的乙醇溶液，至混合溶液中乙醇浓度达到80％，将所得混合液在4℃条件下静置24h，将所得物料在5000转/分钟离心30min，收集沉淀，冷冻干燥(冷阱温度-65℃，真空度10Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢粗多糖；
(3)将所述中国被毛孢粗多糖按照浓度为10mg/mL溶于去离子水，采用DEAE-cellulose阴离子交换柱层析对中国被毛孢粗多糖进行分离，依次采用水和浓度为0.25mol/L氯化钠水溶液进行洗脱，分别洗脱2倍柱体积(CV)，收集0.25M氯化钠洗脱部分，将所得洗脱液装入透析袋(纤维素酯膜，截留分子量1000Da)，先流水透析24h，随后蒸馏水透析12h；透析袋内溶液浓缩至原体积的1/5后，冷冻干燥(冷阱温度-70℃，真空度12Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢上级多糖HSWP-2；
(4)将所述中国被毛孢上级多糖HSWP-2，按照浓度为10mg/mL溶于0.15mol/L的氯化钠水溶液，将所得混合物采用Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析进行纯化，将所得纯化物采用浓度为0.15mol/L的氯化钠水溶液进行洗脱，洗脱1倍柱体积(CV)，收集0.45～0.75CV之间所有的洗脱部分，将所得洗脱液装入透析袋(再生纤维素膜，截留分子量1000Da)，流水透析24h，随后蒸馏水透析16h；将透析袋内溶液浓缩至原体积的1/6，冷冻干燥(冷阱温度-66℃，真空度5Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢多糖，记为HSWP-2a。
实施例2
(1)中国被毛孢菌粉(Ophiocordyceps sinensis发酵菌粉CS-C-Q80，购于青海珠峰虫草药业有限公司)，按照与水的用量比1g:5mL，在80℃条件下提取1h，将所得提取溶液在3000转/分钟离心60min，分别收集沉淀和上清液；将所得沉淀再按照上述条件提取3次；提取后离心所得上清液合并，80℃条件下浓缩至原体积的1/10，得到浓缩提取液；
(2)将所述浓缩提取液冷却至室温后，加入质量浓度为100％的乙醇溶液，至混合溶液中乙醇浓度达到90％，将所得混合液在30℃条件下静置36h，将所得物料在10000转/分钟离心15min，收集沉淀，冷冻干燥(冷阱温度-61℃，真空度14Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢粗多糖；
(3)将所述中国被毛孢粗多糖按照浓度为1mg/mL溶于去离子水，采用DEAE-cellulose阴离子交换柱层析对中国被毛孢粗多糖进行分离，依次采用水和浓度为0.25mol/L氯化钠水溶液进行洗脱，分别洗脱3倍柱体积(CV)，收集0.25M氯化钠洗脱部分，将所得洗脱液装入透析袋(纤维素酯膜，截留分子量10000Da)，先流水透析48h，随后蒸馏水透析24h；透析袋内溶液浓缩至原体积的1/10后，冷冻干燥(冷阱温度-66℃，真空度7Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢上级多糖HSWP-2；
(4)将所述中国被毛孢上级多糖HSWP-2，按照浓度为20mg/mL溶于0.5mol/L的氯化钠水溶液，将所得混合物采用Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析进行纯化，将所得纯化物采用浓度为0.5mol/L的氯化钠水溶液进行洗脱，洗脱1倍柱体积(CV)，收集0.5～0.7CV之间所有的洗脱部分，将所得洗脱液装入透析袋(纤维素酯膜，截留分子量3000Da)，流水透析12h，随后蒸馏水透析24h；将透析袋内溶液浓缩至原体积的1/10，冷冻干燥(冷阱温度-61℃，真空度11Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢多糖，记为HSWP-2a。
实施例3
(1)中国被毛孢菌粉(Ophiocordyceps sinensis发酵菌粉CS-C-Q80，购于青海珠峰虫草药业有限公司)，按照与水的用量比1g:20mL，在100℃条件下提取1h，将所得提取溶液在10000转/分钟离心15min，分别收集沉淀和上清液；将所得沉淀再按照上述条件提取3次；提取后离心所得上清液合并，100℃条件下浓缩至原体积的1/5，得到浓缩提取液；
(2)将所述浓缩提取液冷却至室温后，加入质量浓度为95％的乙醇溶液，至混合溶液中乙醇浓度达到70％，将所得混合液在4℃条件下静置12h，将所得物料在10000转/分钟离心15min，收集沉淀，冷冻干燥(冷阱温度-69℃，真空度10Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢粗多糖；
(3)将所述中国被毛孢粗多糖按照浓度为20mg/mL溶于去离子水，采用DEAE-cellulose阴离子交换柱层析对中国被毛孢粗多糖进行分离，依次采用水和浓度为0.25mol/L氯化钠水溶液进行洗脱，分别洗脱2.5倍柱体积(CV)，收集0.25M氯化钠洗脱部分，将所得洗脱液装入透析袋(再生纤维素膜，截留分子量8000Da)，先流水透析36h，随后蒸馏水透析20h；透析袋内溶液浓缩至原体积的1/6后，冷冻干燥(冷阱温度-63℃，真空度12Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢上级多糖HSWP-2；
(4)将所述中国被毛孢上级多糖HSWP-2，按照浓度为15mg/mL溶于0.05mol/L的氯化钠水溶液，将所得混合物采用Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析进行纯化，将所得纯化物采用浓度为0.05mol/L的氯化钠水溶液进行洗脱，洗脱1倍柱体积(CV)，收集0.44～0.74CV之间所有的洗脱部分，将所得洗脱液装入透析袋(再生纤维素膜，截留分子量8000Da)，流水透析30h，随后蒸馏水透析20h；将透析袋内溶液浓缩至原体积的1/5，冷冻干燥(冷阱温度-64℃，真空度6Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢多糖，记为HSWP-2a。
实施例4
(1)中国被毛孢菌粉(Ophiocordyceps sinensis发酵菌粉CS-C-Q80，购于青海珠峰虫草药业有限公司)，按照与水的用量比1g:12mL，在88℃条件下提取1.5h，将所得提取溶液在4500转/分钟离心40min，分别收集沉淀和上清液；将所得沉淀再按照上述条件提取3次；提取后离心所得上清液合并，85℃条件下浓缩至原体积的1/7，得到浓缩提取液；
(2)将所述浓缩提取液冷却至室温后，加入质量浓度为96％的乙醇溶液，至混合溶液中乙醇浓度达到85％，将所得混合液在16℃条件下静置22h，将所得物料在5500转/分钟离心42min，收集沉淀，冷冻干燥(冷阱温度-63℃，真空度9Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢粗多糖；
(3)将所述中国被毛孢粗多糖按照浓度为12mg/mL溶于去离子水，采用DEAE-cellulose阴离子交换柱层析对中国被毛孢粗多糖进行分离，依次采用水和浓度为0.25mol/L氯化钠水溶液进行洗脱，分别洗脱2.2倍柱体积(CV)，收集0.25M氯化钠洗脱部分，将所得洗脱液装入透析袋(再生纤维素膜，截留分子量500Da)，先流水透析28h，随后蒸馏水透析16h；透析袋内溶液浓缩至原体积的1/9后，冷冻干燥(冷阱温度-67℃，真空度13Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢上级多糖HSWP-2；
(4)将所述中国被毛孢上级多糖HSWP-2，按照浓度为8mg/mL溶于0.25mol/L的氯化钠水溶液，将所得混合物采用Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析进行纯化，将所得纯化物采用浓度为0.25mol/L的氯化钠水溶液进行洗脱，洗脱1倍柱体积(CV)，收集0.4～0.8CV之间所有的洗脱部分，将所得洗脱液装入透析袋(纤维素酯膜，截留分子量500Da)，流水透析17h，随后蒸馏水透析21h；将透析袋内溶液浓缩至原体积的1/8，冷冻干燥(冷阱温度-61℃，真空度10Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢多糖，记为HSWP-2a。
实施例5
(1)中国被毛孢菌粉(Ophiocordyceps sinensis发酵菌粉CS-C-Q80，购于青海珠峰虫草药业有限公司)，按照与水的用量比1g:18mL，在96℃条件下提取2.1h，将所得提取溶液在8300转/分钟离心31min，分别收集沉淀和上清液；将所得沉淀再按照上述条件提取2次；提取后离心所得上清液合并，82℃条件下浓缩至原体积的1/6，得到浓缩提取液；
(2)将所述浓缩提取液冷却至室温后，加入质量浓度为97％的乙醇溶液，至混合溶液中乙醇浓度达到76％，将所得混合液在12℃条件下静置24h，将所得物料在3500转/分钟离心51min，收集沉淀，冷冻干燥(冷阱温度-67℃，真空度11Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢粗多糖；
(3)将所述中国被毛孢粗多糖按照浓度为5.5mg/mL溶于去离子水，采用DEAE-cellulose阴离子交换柱层析对中国被毛孢粗多糖进行分离，依次采用水和浓度为0.25mol/L氯化钠水溶液进行洗脱，分别洗脱2.8倍柱体积(CV)，收集0.25M氯化钠洗脱部分，将所得洗脱液装入透析袋(再生纤维素膜，截留分子量800Da)，先流水透析34h，随后蒸馏水透析18h；透析袋内溶液浓缩至原体积的1/7后，冷冻干燥(冷阱温度-65℃，真空度14Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢上级多糖HSWP-2；
(4)将所述中国被毛孢上级多糖HSWP-2，按照浓度为2mg/mL溶于0.4mol/L的氯化钠水溶液，将所得混合物采用Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析进行纯化，将所得纯化物采用浓度为0.4mol/L的氯化钠水溶液进行洗脱，洗脱1倍柱体积(CV)，收集0.42～0.75CV之间所有的洗脱部分，将所得洗脱液装入透析袋(纤维素酯膜，截留分子量800Da)，流水透析38h，随后蒸馏水透析17h；将透析袋内溶液浓缩至原体积的1/7，冷冻干燥(冷阱温度-66℃，真空度10Pa，北京博医康实验仪器有限公司，FD-1型真空冷冻干燥机)，得到中国被毛孢多糖，记为HSWP-2a。
表征及性能测试
1)对实施例1制备的中国被毛孢多糖进行一维和二维核磁表征，结果见图1～6；其中，图1为HSWP-2a的1H-NMR谱图，图2为HSWP-2a的13C-NMR谱图，图3为HSWP-2a的COSY-NMR谱图，图4为HSWP-2a的HSQC-NMR谱图，图5为HSWP-2a的HMBC-NMR谱图，图6为HSWP-2a的NOESY-NMR谱图；
图1～6中除了吡喃型葡萄糖残疾(Glcp)信号无其他类型单糖残疾信号。如图2所示，在13C-NMR谱图中3个异头碳型号分别位于δ99.63,99.74,and98.60ppm处，显示出3个不同类型的α糖苷键类型的Glcp，分别命名为残基A、B、C。如图1和图4所示，在HSQC-NMR谱图中3处交叉信号峰位于δ5.31/99.63,5.27/99.74和4.87/98.60ppm，表明残基A、B、C的异头质子分别对应1H-NMR谱图中的δ5.31,5.27和4.87ppm信号。根据图3的13C-NMR谱图中δ76.76、76.85和69.30ppm处信号，推断出残基A、B、C分别为1,4-连接α-D-Glcp、1,4,6-连接α-D-Glcp和末端α-D-Glcp。
如图5和图6所示，HSWP-2a的HMBC和NOESY-NMR谱图显示出糖残基的连接顺序和连接位点。图5的HMBC-NMR谱图中，δ5.31/76.76 ppm(AH-1/A C-4)和3.57/99.63ppm(AH-4/AC-1)信号表明1,4-连接Glcp的存在。残基A的H-1(5.31ppm)与残基B的C-4(76.85ppm)之间的交叉信号峰表明1,4-Glcp在O-6分支的糖残基构成活性多糖(HSWP-2a)的主链。残基C的H-1与残基B的H-6之间的交叉信号峰表明多糖侧链存在末端1位连接的α-D-Glcp。综合上述结果，活性多糖(HSWP-2a)的结构为：α-(1→4)-D-葡聚糖，在O-6、O-3或O-2连有单个α-D-Glcp分支，如式1所示，x+y+z＝86。
2)根据现有技术(Wang H,Gao T,Du Y,et al.Anticancer andimmunostimulating activities of a novelhomogalacturonan from Hippophaerhamnoides L.berry[J].Carbohydrate Polymers.2015,131:288-296.)记载的方法，对实施例1～5制备的中国被毛孢多糖进行结构和分子量测定，结果表明：
实施例1～5制备的HSWP-2a中糖残基的构型均为α构型，糖苷键类型均为(1→4)-D-葡聚糖，在O-6、O-3或O-2连有单个α-D-Glcp分支；
实施例1制备的中国被毛孢多糖的分子量(Mw)为872kDa，实施例2制备的中国被毛孢多糖的分子量(Mw)为852kDa；实施例3制备的中国被毛孢多糖的分子量(Mw)为925kDa；实施例4制备的中国被毛孢多糖的分子量(Mw)为836kDa，实施例5制备的中国被毛孢多糖的分子量(Mw)为902kDa。
3)对实施例1制备的中国被毛孢多糖进行组成测定，结果表明，总糖含量大于95％(葡萄糖为标准单糖，测定方法：Dubois M,Gilles KA,Hamilton JK,et al.Colorimetricmethod for determination of sugars and related substances[J].AnalyticalChemistry，1956，28：350-356)；半乳糖醛酸含量小于1％(半乳糖醛酸为标准单糖，测定方法：Blumenkrantz,N.,Asboe Hansen,G.,1973.New method for quantitativedetermination ofuronic acids.Analytical Biochemistry 54,484-489.)；蛋白质含量小于1％(测定方法：Sedmark JJ，Grossberg SE.Arapid，sensitive，and versatile assayforprotein using Coomassie brilliantblue G250[J].Analytical Biochemistry，1979，79：544-552)。
4)根据现有技术(Duo Jie,Tingting Gao,Zhongshu Shan,Jiayin Song,MingZhang,Olga Kurskaya,Kirill Sharshov,Lixin Wei*,Hongtao Bi*.Immunostimulatingeffect ofpolysaccharides isolated from Ma-Nuo-Xi decoction incyclophosphamide-immunosuppressed mice.International Journal of BiologicalMacromolecules,2020,146:45-52)记载的方法，测试实施例1～5制备的中国被毛孢多糖对单核巨噬细胞(RAW264.7)免疫功能增强作用，结果表明：
实施例1制备的HSWP-2a对巨噬细胞RAW264.7免疫功能增强作用：吞噬能力EC50为209μg/mL，NO生成EC50为0.4μg/mL，肿瘤坏死因子TNF-α生成EC50为0.3μg/mL，白介素IL-1β生成EC50为21μg/mL，白介素IL-6生成EC50为163μg/mL；
实施例2制备的HSWP-2a对巨噬细胞RAW264.7免疫功能增强作用：吞噬能力EC50为184μg/mL，NO生成EC50为0.3μg/mL，TNF-α生成EC50为0.2μg/mL，IL-1β生成EC50为19μg/mL，IL-6生成EC50为152μg/mL；
实施例3制备的HSWP-2a对巨噬细胞RAW264.7免疫功能增强作用：吞噬能力EC50为224μg/mL，NO生成EC50为0.5μg/mL，TNF-α生成EC50为0.5μg/mL，IL-1β生成EC50为15μg/mL，IL-6生成EC50为184μg/mL.
实施例4制备的HSWP-2a对巨噬细胞RAW264.7免疫功能增强作用：吞噬能力EC50为152g/mL，NO生成EC50为0.2μg/mL，TNF-α生成EC50为0.3μg/mL，IL-1β生成EC50为19μg/mL，IL-6生成EC50为167μg/mL；
实施例5制备的HSWP-2a对巨噬细胞RAW264.7免疫功能增强作用：吞噬能力EC50为167μg/mL，NO生成EC50为0.4μg/mL，TNF-α生成EC50为0.4μg/mL，IL-1β生成EC50为13μg/mL，IL-6生成EC50为179μg/mL。
5)根据现有技术(Hailiang Wang,HongtaoBi,TingtingGao,BinZhao,WeihuaNi*,JunLiu*.A homogalact-uronan from Hippophae rhamnoides L.Berriesenhanceimmunomodulatory activity through TLR4/MyD88 pathwaymediatedactivation of macrophages.International Journal of BiologicalMacromolecules,2018,107,1039-1045.)记载的方法，测试实施例1～5制备的中国被毛孢多糖对脾淋巴细胞免疫功能增强作用，结果表明：
实施例1制备的HSWP-2a对脾淋巴细胞免疫功能增强作用：刀豆蛋白ConA诱导的T淋巴细胞增殖最低起效浓度为37μg/mL，脂多糖LPS诱导的B淋巴细胞增殖最低起效浓度为128μg/mL；
实施例2制备的HSWP-2a对脾淋巴细胞免疫功能增强作用：ConA诱导的T淋巴细胞增殖最低起效浓度为32μg/mL，LPS诱导的B淋巴细胞增殖最低起效浓度为110μg/mL；
实施例3制备的HSWP-2a对脾淋巴细胞免疫功能增强作用：ConA诱导的T淋巴细胞增殖最低起效浓度为47μg/mL，LPS诱导的B淋巴细胞增殖最低起效浓度为195μg/mL；
实施例4制备的HSWP-2a对脾淋巴细胞免疫功能增强作用：ConA诱导的T淋巴细胞增殖最低起效浓度为41μg/mL，LPS诱导的B淋巴细胞增殖最低起效浓度为106μg/mL；
实施例5制备的HSWP-2a对脾淋巴细胞免疫功能增强作用：ConA诱导的T淋巴细胞增殖最低起效浓度为40μg/mL，LPS诱导的B淋巴细胞增殖最低起效浓度为134μg/mL。
6)将实施例1～6制备的中国被毛孢多糖(HSWP-2a)、对应案例的中国被毛孢菌粉粗多糖与中国被毛孢菌粉的免疫调节活性进行比较，结果见表1。表1实施例1～6制备的中国被毛孢多糖(HSWP-2a)与中国被毛孢菌粉、中国被毛孢菌粉粗多糖的免疫调节活性的比较结果
Figure BDA0003249481980000151
Figure BDA0003249481980000161
由表1可知，本发明的中国被毛孢多糖(HSWP-2a)对巨噬细胞免疫功能增强作用：吞噬能力EC50≤300μg/mL，NO生成EC50≤0.5μg/mL，TNF-α生成EC50≤0.5μg/mL，IL-1β生成EC50≤25μg/mL，IL-6生成EC50≤200μg/mL；对脾淋巴细胞免疫功能增强作用：ConA诱导的T淋巴细胞增殖最低起效浓度≤50μg/mL，LPS诱导的B淋巴细胞增殖最低起效浓度≤200μg/mL。而且，本发明的中国被毛孢多糖对巨噬细胞RAW264.7免疫功能和脾淋巴细胞免疫功能的增强功能均明显优于中国被毛孢菌粉和中国被毛孢菌粉粗多糖。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种中国被毛孢多糖，其特征在于，具有式1所示结构：
Figure FDA0003249481970000011
式1中，x+y+z＝80～90。
2.根据权利要求1所述的中国被毛孢多糖，其特征在于，所述中国被毛孢多糖中糖残基的构型为α构型，糖苷键类型为(1→4)-D-葡聚糖，在O-6、O-3或O-2连有单个α-D-Glcp分支；分子量Mw为800～1000kDa。
3.权利要求1或2所述中国被毛孢多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将中国被毛孢菌粉与水混合，进行提取，将所得提取液浓缩后，得到浓缩提取液；
将所述浓缩提取液与乙醇溶液混合，进行醇沉，得到中国被毛孢粗多糖；
将所述中国被毛孢粗多糖的水溶液进行阴离子交换柱层析分离，将所得分离产物依次进行第一洗脱、第一透析和第一干燥，得到中国被毛孢上级多糖；
将所述中国被毛孢上级多糖与氯化钠水溶液混合，将所得混合液采用凝胶过滤柱层析进行纯化，将所得纯化物依次进行第二洗脱、第二透析和第二干燥，得到中国被毛孢多糖。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述中国被毛孢菌粉与水的用量比为1g:(5～20)mL。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述提取的次数为1～4次，每次提取的温度独立为80～100℃，时间独立为1～3h；所述浓缩的温度为80～100℃。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇溶液的质量浓度为95～100％；所述浓缩提取液与乙醇溶液混合所得混合液中乙醇的质量浓度为70～90％。
7.根据权利要求3或6所述的制备方法，其特征在于，所述醇沉的温度为4～30℃，时间为12～36h。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述中国被毛孢粗多糖的水溶液的浓度为1～20mg/mL；所述阴离子交换柱层析所用阴离子交换剂为DEAE-纤维素。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述中国被毛孢上级多糖与氯化钠水溶液混合所得混合液中，所述中国被毛孢上级多糖的浓度为1～20mg/mL；所述凝胶过滤柱层析所用凝胶过滤填料为Sepharose CL-6B。
10.权利要求1或2所述中国被毛孢多糖或权利要求3～9任一项所述制备方法制备得到的中国被毛孢多糖在制备免疫增强药物中的应用。
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