CN113663135B - 一种th2细胞活化的3d打印支架及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种TH2细胞活化的3D打印支架及其制备方法与应用。本发明通过动态共价键将聚乙烯亚胺/介孔二氧化硅微棒/卵清蛋白自组装疫苗稳定结合于3D打印钙磷基支架上；通过局部释放OVA激活体液免疫反应，实现支架中抗原特异性TH2细胞的募集，促进材料植入早期血管新生。体外实验表明，本发明的支架能够有效募集和活化树突细胞表现抗原呈递功能，并能够促进骨髓间充质干细胞成骨分化。体内实验表明，与纯支架材料组和负载有疫苗载体的支架组相比，负载疫苗的打印支架在小鼠皮下包埋模型中，能够有效提高TH2细胞在脾脏中的数量，在局部募集CD4+T细胞，促进植入早期支架内部和周围大量新生血管形成。

Description

一种TH2细胞活化的3D打印支架及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医学材料技术领域，涉及一种3D打印支架，具体涉及一种TH2细胞活化的3D打印支架及其制备方法与应用。
背景技术
临床上，由创伤和疾病造成的大段骨缺损因形状各异且难以自愈合，往往需要植入符合个体需求的骨修复植入体，然而，由于常用的自体/异体骨数量有限，目前难以满足临床需求。在骨修复植入体的制造上，由于可选材料的多样和结构的可设计性，3D打印骨修复植入体具有个性化外形和内部结构，适合研发用于临床应用。
在组织修复方面，打印植入体在临床中已有应用案例并表现出促成骨作用，内部连通的孔道结构适合于组织的长入，却没有显示出促进血管化的功能(R.Shahrokh,F.Hamid Reza,S.K.Kazem,H.Mehdi,A.Sadaf,Customized Titanium Mesh Based on the3D Printed Model vs.Manual Intraoperative Bending of Titanium Mesh forReconstructing of Orbital Bone Fracture:A Randomized ClinicalTrial.Rev.Recent Clin.Trials 12,154-158,2017.)。在大段骨缺损时，多伴随自体血管网络的破坏，植入体无血管化易导致内部缺乏细胞和组织再生所需的营养以及氧气等，从而引起中心部位坏死和修复失败，这也是其在广泛临床应用前面临的一大难题。此外，局部血流量和营养物质的多少和骨再生的速率存在着紧密联系，促进打印植入体内血管化快速形成，有望为骨重建过程提供充足的营养，从而加快组织修复。
传统方法通过将具有促进血管新生作用的生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)，纤维母细胞生长因子(FGF)等装载入骨修复材料进行缓释，以直接促进血管形成。目前，通过材料设计可一定程度克服生长因子半衰期短和在局部难以保留导致血管新生失败的问题。然而，单独生长因子并不能促使成熟血管的形成，局部免疫细胞数量和活性是骨修复体促进血管再生作用能否发挥的一大决定因素。因此，通过调控局部免疫微环境促进3D打印骨修复植入体的血管化是一个值得研究的方向。
近来，研究人员尝试将单核/巨噬细胞调控功能引入3D打印支架，在促进血管化和骨修复方面取得了一定效果。巨噬细胞在血管新生中起着重要作用，研究表明M1型巨噬细胞可促进血管新生，M2型巨噬细胞可促进血管成熟和重构。通过设计3D打印支架顺序释放生长因子IFN-γ和硅离子将巨噬细胞先向M1型极化后向M2型极化调控，在小鼠皮下包埋模型中可见促进早期新生血管形成。但是，巨噬细胞激活根据外部刺激表现为一个连续状态，M1型和M2型在其两极，在体内复杂微环境中稳定性并不完全可控。巨噬细胞对成骨、骨溶解和血管再生等的功能具有调控作用，且相关效应机制不一，不适宜的人为调控干预可能会导致组织的损伤。因此，3D打印支架精准调控巨噬细胞表型变化以促进含血管的骨组织重建需要梳理的机理相对复杂，仍然有待进一步研究。
目前被忽略却值得广泛关注的是，构建具有T细胞调控功能的3D打印支架用于促进血管化和骨组织再生同样表现出具大潜力。T细胞相关的获得免疫系统在骨缺损修复和促进血管化中起着重要作用。虽然T细胞与巨噬细胞相似亚型众多，其中CD4+T细胞的条件培养液能够显著促进人间充质干细胞的成骨矿化。在下肢缺血模型中，CD4+T细胞被发现可促进动脉的形成。CD4+T2辅助(TH2)细胞在缺血损伤中不仅能分泌有助于血管再生的生长因子，还能活化嗜酸性粒细胞分泌相关生长因子。由此可见，打印支架具有局部募集和活化TH2细胞功能，既可促进缺损部位血管化还能促进成骨。
Mooney等将纳米铝/卵清蛋白疫苗植入小鼠下肢缺血模型中观察到释放的OVA(卵清蛋白)抗原能够特异性募集TH2细胞，触发了局部的血管新生和缺血肢体血液灌注增加，减少了坏死并促进了肌肉中肌纤维的再生(B.J.Kwee et al.,Treating ischemia viarecruitment of antigen-specific T cells.Sci.Adv.5,eaav6313,2019.)。纳米铝颗粒作为传统疫苗载体和免疫佐剂，能够促进OVA对TH2细胞的募集。然而，OVA纳米颗粒疫苗简单分散于骨缺损部位容易快速分散进入血液循环，难以起到细胞局部募集的作用，不适合单独作为骨缺损治疗的疫苗体系。
因此，针对骨缺损患处特点，如何选择合适OVA的载体并结合于3D打印骨修复支架上，以期通过局部释放特异性抗体募集TH2细胞从而促进支架内和植入部位血管化和骨组织修复，成为现阶段亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种TH2细胞活化的3D打印支架及其制备方法与应用。本发明提供的支架能够有效募集和活化树突细胞表现抗原呈递功能，并能够促进骨髓间充质干细胞成骨分化，还能够促进植入早期支架内部和周围大量新生血管形成。本发明提供的具有抗原特异性免疫微环境调控功能的3D打印支架可促进骨组织再生，为植入材料的设计提供了一种新思路。
本发明的目的之一是提供一种TH2细胞活化的3D打印支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)MSR/PEI疫苗载体的制备：取介孔二氧化硅微棒配制成分散液，然后与聚乙烯亚胺溶液混合，在20-37℃下共孵育5-30min，制备得到MSR/PEI疫苗载体；
(2)MSR/PEI/OVA疫苗的制备：将卵清蛋白与MSR/PEI疫苗载体于37℃振荡孵育1-3h，获得MSR/PEI/OVA疫苗；
(3)取氧化聚合物和聚乙烯醇在水溶液中按照质量比1：5～20混合形成富含醛基的粘结剂，将钙磷基粉末与粘合剂均匀混合制得可打印浆料，打印制得钙磷基支架；其中，所述生物支架的无机钙磷基组分为自固化磷酸钙骨水泥、β-磷酸三钙和羟基磷灰石中的一种或几种；支架粘结液为聚乙烯醇与氧化聚合物的混合物，氧化聚合物为氧化透明质酸、氧化硫酸软骨素或氧化海藻酸钠中的一种或几种；
(4)将MSR/PEI/OVA疫苗在PBS缓冲液中重悬，然后滴在支架上制备得到载疫苗支架。
本发明启发于T细胞对血管化的调控作用，将介孔二氧化硅微棒，枝状PEI和卵清蛋白通过简单电荷作用层层组装构建了TH2细胞特异性募集疫苗，进一步的基于席夫碱反应将疫苗稳定结合于室温打印含醛基钙磷基骨修复支架，设计构建了能够局部募集TH2细胞，促进血管化的3D打印骨修复支架。介孔二氧化硅微棒作为OVA的载体可激活特异性TH2细胞反应，枝状PEI涂层介孔二氧化硅微棒作为OVA的疫苗载体可有效促进树突细胞的活化并提升T细胞反应。在磷酸钙打印墨水中引入氧化聚合物使得支架带上丰富醛基，适合MSR/PEI/OVA疫苗稳定装载；疫苗中OVA逐渐释放，可实现分泌成血管相关生长因子的TH2细胞募集，促进支架内血管化。体外细胞实验研究表明，支架上的疫苗释放OVA可迅速募集并活化树突细胞具有抗原呈递功能，而逐渐释放的硅离子可促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。在体内皮下包埋模型中，负载疫苗微棒支架可在植入早期迅速活化和募集TH2细胞，显著促进局部和支架内血管的形成。此外，体内颅骨缺损原位模型发现，负载微棒疫苗的3D打印支架具有优异的促进血管化骨再生作用。
进一步的是，步骤(1)中所述介孔二氧化硅微棒是由以下方法合成：以聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物为结构导向剂，以正硅酸四乙酯为硅源进行合成。
进一步的是，步骤(1)中所述介孔二氧化硅微棒分散液的浓度为30-70mg·mL-1，所述聚乙烯亚胺溶液的浓度为15-35μg·mL-1。
进一步的是，步骤(3)中所述氧化聚合物的制备方法为：将透明质酸，硫酸软骨素或海藻酸盐溶于蒸馏水，在4-37℃环境中逐滴加入浓度为0.5M的高碘酸钠溶液，不断搅拌2-4h，然后停止反应，4-37℃下沉淀1-6h，收集沉淀经透析和冻干，得到氧化聚合物。
进一步的是，步骤(3)中所述聚乙烯醇的重均分子量为98000。
本发明的目的之二是提供一种TH2细胞活化的3D打印支架，其是由如上方法制备而得。所述3D打印支架具有抗原特异性T细胞募集功能。
本发明的目的之三是提供上述3D打印支架的应用，其中，包括在制备促进骨修复材料方面的应用，如在制备促进骨组织再生材料方面的应用和在制备促进血管新生材料方面的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明通过动态共价键将聚乙烯亚胺(PEI)/介孔二氧化硅微棒(MSR)/卵清蛋白(OVA)自组装疫苗稳定结合于3D打印钙磷基支架上；通过局部释放的OVA，激活体液免疫反应，实现支架中抗原特异性TH2细胞的募集，促进材料植入早期血管新生；介孔二氧化硅微棒中硅离子逐渐释放可在缺损部位形成良好的血运的同时，促进骨组织的再生。在体外实验中，本发明的支架能够有效募集和活化树突细胞表现抗原呈递功能，并能够促进骨髓间充质干细胞成骨分化。在体内实验中，与纯支架材料组和负载有疫苗载体的支架组相比，负载疫苗的打印支架在小鼠皮下包埋模型中，能够有效提高TH2细胞在脾脏中的数量，在局部募集TH2细胞，促进植入早期支架内部和周围大量新生血管形成。
附图说明
图1为MSR疫苗体系的制备和表征；(A)MSR和MSR/PEI微棒SEM图；(B)MSR/PEI微棒的EDS面扫描图；(C)MSR和MSR/PEI微棒的氮吸脱附曲线，孔径分布和TEM图；(D)MSR、MSR/PEI和MSR/PEI/OVA微棒的Zeta电位图；(E)支化PEI和抗原逐一吸附于MSR上的示意图；
图2为MSR疫苗体系负载支架的制备和表征；(A)CPC和MSR/PEI负载CPC支架的SEM图；(B)透明质酸和氧化透明质酸的FTIR谱图；(C)CPC-MSR/PEI/OVA支架上OVA的释放曲线；(D)释放液中Si离子浓度；
图3为疫苗负载支架募集和活化树突细胞；(A)树突细胞与CPC、CPC-MSR/PEI和CPC-MSR/PEI/OVA支架共培养24小时后的细胞黏附SEM图和MHC-II表面标记物共聚焦图；(B)树突细胞与CPC、CPC-MSR/PEI和CPC-MSR/PEI/OVA支架共培养24小时后表面CD86 andMHC-II表达流式细胞术分析；(C)树突细胞与CPC、CPC-MSR/PEI和CPC-MSR/PEI/OVA支架共培养48小时后细胞募集情况；(D)共培养48小时后支架上细胞表达SIINFEKL-H2Kb的共聚焦观察；(E)培养液中树突细胞表达SIINFEKL-H2Kb的流式细胞检测结果；
图4为疫苗负载支架促进mBMSCs细胞黏附和成骨分化；(A)细胞在CPC、CPC-MSR/PEI和CPC-MSR/PEI/OVA支架上黏附SEM图；(B)细胞与CPC、CPC-MSR/PEI和CPC-MSR/PEI/OVA支架共培养7天后的ALP染色照片；
图5为疫苗负载支架促进抗原特异性细胞募集和血管新生；(A)皮下植入实验示意图；(B)脾脏CD4+T细胞中IL4+和IFN-γ+细胞的比例(***P<0.001vs.Control，###P<0.001vs.CPC组，●●●P<0.001vs.CPC-MSR/PEI组)；(C)支架植入7天后的CD4免疫荧光染色图和相关荧光强度统计图(###P<0.001vs.CPC组，●●●P<0.001vs.CPC-MSR/PEI组)；支架植入14天后的(D)超声图和(E)数码照片；
图6为疫苗负载支架促进大鼠颅骨缺损中血管化骨再生；(A)支架植入缺损的照片；(B)植入8周后，基于Micro-CT结果的植入支架颅骨三维重建图、剖面图和含新生骨支架感兴趣区域重建图(黄色：支架，白色：新生骨)；(C)各组新生骨体积比例(BV/TV)，n＝3.*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001vs.Untreated组；#P<0.05vs.CPC组；(D)支架的HE、Masson染色和CD31免疫组织化学染色。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例
1.实验方法
(一)疫苗的制备
介孔二氧化硅微棒(MSR)参考现有文献(C.Li et al.,RhBMP-2loaded 3D-printed mesoporous silica/calcium phosphate cement porous scaffolds withenhanced vascularization and osteogenesis properties.Sci.Rep.7,41331,2017.)的报道，通过溶胶凝胶法，以P123共聚物(聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物)为结构导向剂，以正硅酸四乙酯为硅源合成。
将40μL浓度为50mg·mL-1的MSR工作液与100μL浓度为25μg·mL-1的PEI(聚乙烯亚胺)溶液，在37℃下混合并共孵育15min，制备得到MSR/PEI疫苗载体。取100μg OVA(卵清蛋白)与MSR/PEI微棒于37℃振荡孵育1h后获得MSR/PEI/OVA疫苗。
上述微棒冷冻干燥后进行理化检测。通过扫描电镜观察MSR和MSR/PEI微棒的外形；用比表面和孔隙率分析仪与透射电子显微镜对MSR和MSR/PEI微棒的介孔结构进行分析；用能谱仪对MSR/PEI微棒表面进行元素面扫描分析；用纳米Zeta电位仪分析疫苗体系的Zeta电位。
(二)疫苗在支架的装载
氧化透明质酸(OHA)按照下述方法合成：将1g透明质酸(HA)完全溶于200mL蒸馏水，在冰浴中逐滴加入浓度为0.5M的高碘酸钠溶液5mL，不断搅拌3h后，加入40mL乙二醇停止反应，在4℃下沉淀1h后，收集底部OHA，透析并冻干。通过傅里叶变换红外光谱仪对HA和OHA样品进行红外光谱分析。
接下来，将1wt％OHA水溶液与10wt％聚乙烯醇(Mw＝98000，Sigma-Aldrich)水溶液混合形成富含醛基的粘结剂；将CPC(磷酸钙骨水泥)粉末与粘合剂均匀混合制得可打印浆料，装入打印机料筒在室温下进行打印，打印的CPC支架在37℃、100％湿度环境中水化过夜，然后风干备用。
最后，分别将1mg和2mg MSR/PEI/OVA微棒在PBS缓冲液中重悬，并滴在打印的CPC支架上制备分别用于体外和体内实验的载疫苗支架(CPC-MSR/PEI/OVA)。用相同的方法制备MSR/PEI负载支架，作为负载疫苗载体支架组(CPC-MSR/PEI)。
(三)OVA的释放曲线
将支架(10×10×2mm3)置于1mL PBS中在37℃共孵育，在不同的时间点收集并替换PBS。用Pierce Micro BCA蛋白检测试剂盒测定PBS中的OVA量。计算释放量并绘制释放曲线。
(四)硅离子的释放行为
将支架(10×10×2mm3)置于1mL PBS中在37℃共孵育，每隔一天收集并更换一次PBS。用电感耦合等离子体发射光谱仪测量PBS中硅离子的含量。
(五)树突细胞(DCs)分化、活化和抗原呈递检测
树突细胞从C57BL/6J小鼠骨髓细胞分离得到。从股骨和胫骨收集骨髓，在含10％胎牛血清、1％青霉素链霉素和20ng/mL小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的RPMI培养液中培养单细胞悬液。在分化培养的第7～9天收集非贴壁细胞用于实验研究。
为评估支架刺激对DCs活性的作用，将1×106mL-1未成熟的DCs接种到在12孔板中的支架上共培养24小时。随后，收集DCs，用anti-CD11c、anti-CD86和anti-MHC II在冰上染色并使用流式细胞仪分析。支架上的细胞表面标记用anti-MHC II染色，细胞核用DAPI染色，然后，通过共聚焦显微镜观察。
为评估刺激后DCs的交叉呈递，将0.5×106mL-1DCs接种于支架上共培养48小时后收集上清中的DCs，用anti-SIINFEKL/H-2Kb染色并使用流式细胞仪分析。支架上细胞表面标记用anti-SIINFEKL/H-2Kb染色，细胞核用DAPI染色，然后，通过共聚焦显微镜观察。
(六)细胞和支架浸提液液制备用于成骨分化试验
从C57BL/6J小鼠的股骨和胫骨中分离出小鼠骨髓间充质干细胞(mBMSCs)，使用含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养液培养。
CPC、CPC-MSR/PEI和CPC-MSR/PEI/OVA支架(10×10×2mm3)各组每个支架逐一置于24孔培养板并浸泡于1mL培养基中，每隔一天更换一次培养液。浸泡7天后，获得用于后续体外实验的支架。
CPC、CPC-MSR/PEI和CPC-MSR/PEI/OVA支架浸提液参照文献(C.Li et al.,RhBMP-2loaded 3D-printed mesoporous silica/calcium phosphate cement porousscaffolds with enhanced vascularization and osteogenesisproperties.Sci.Rep.7,41331,2017.)方法制备。将上述处理过的支架在37℃以一定的质量/体积比在培养液中浸泡24h后，收集上清，0.22μm过滤膜过滤后4℃保存备用。
(七)细胞黏附
每个24孔板中的支架接种5×104个mBMSCs共培养24小时。随后，支架经PBS清洗，4％多聚甲醛(PFA)固定，梯度乙醇脱水和恒温干燥处理制样，用扫描电镜观察细胞在支架上的黏附情况。
(八)碱性磷酸酶活性检测
每个24孔板中的支架接种5×104个mBMSCs共培养。培养液每3天更换一次。培养7天后，用4％的多聚甲醛固定细胞，用碱性磷酸酶试剂盒染色，并通过肉眼和光学显微镜观察。
(九)皮下移植模型
为进行材料体内免疫调节和血管化性能研究，建立了小鼠皮下植入模型(模型建立方法参照C.Li,et al.,Patient-specific Scaffolds with a Biomimetic GradientEnvironment for Articular Cartilage-Subchondral Bone Regeneration.ACSAppl.Bio Mater.3,4820-4831,2020.)。订购健康雄性C57BL/6J小鼠24只(6周龄，15-20g)。将CPC、CPC-MSR/PEI和CPC-MSR/PEI/OVA支架
Figure GDA0003816632120000121
植入钝性分离制备的皮下包埋区域(n＝6)。未手术的老鼠作为对照组(n＝6)。
(十)体内T细胞活化募集
植入7天后处死动物，取出支架及其周围组织。脾脏含2％胎牛血清RPMI培养液下经物理研磨提取淋巴细胞。CD8+或CD4+T细胞使用细胞分选试剂盒获得。分选后的T细胞在37℃处理培养1天，收集后用抗小鼠CD3e、CD8a和CD4冰上染色，固定并通透。然后经抗小鼠IL-4和IFN-γ在4℃下染色后用流式细胞仪分析。
取出的支架进行脱钙、石蜡包埋和切片，切片脱蜡、复水后与抗CD4一抗在4℃下孵育过夜，二抗和DAPI染色后，共聚焦显微镜观察切片，分析支架的局部免疫调节功能。使用Image J软件计算平均荧光强度，对募集的细胞进行定量测定。
(十一)体内血管生成
植入14天后，用多模式超声/光声成像系统检测小鼠局部血流，分析支架内血管生成情况；随后处死动物，取出支架观察血管新生情况。
(十二)原位缺陷修复模型
在体内成骨研究中，建立了一个临界颅骨缺损模型(模型建立方法参照D.Zou etal.,Repairing critical-sized calvarial defects with BMSCs modified by aconstitutively active form of hypoxia-inducible factor-1αand a phosphatecement scaffold.Biomaterials 32,9707-9718,2011)。选取8周龄健康雄性SD大鼠24只，随机分为4组：(1)未处理组；(2)CPC；(3)CPC-MSR/PEI；(4)CPC-MSR/PEI/OVA。每只大鼠使用环钻制造直径为4mm的缺陷。小心植入支架
Figure GDA0003816632120000131
后闭合切口。材料植入8周后，处死动物，收集颅骨经4％PFA固定用于进一步分析。(n＝6)
(十三)Micro-CT断层扫描分析
使用Micro-CT成像系统对所有样本进行扫描用于骨形成分析，分辨率为20μm。扫描后，用DataViewer软件重建三维图像。基于不同的灰度范围分别重建支架和骨(支架和新形成的骨分别渲染为黄色和白色)。使用DataViewer软件对新生骨进行定量计算。
(十四)组织学评价
4％PFA固定后，将样品脱钙，石蜡包埋，切片，切片用苏木精/伊红(HE)，马森三色(Masson)染色和CD31免疫组织化学染色，用光学显微镜观察切片。
(十五)统计学分析
每组实验数据至少重复3次，用平均数±标准差表示。数据结果用GraphPad Prism5软件进行统计并用ANOVA进行方差分析。
2.实验结果
(一)疫苗负载支架
为制备疫苗负载支架，首先制备并分析了自组装疫苗。通过扫描电镜观察，粒径为600nm的棱柱状纳米棒聚集形成MSR微棒，其平均长度为23.2μm，直径为3.7μm(图1A)。用透射电子显微镜观察能够看到MSR内典型的层状介孔(图1C)。BET分析结果显示(图1C)，MSRs的N2吸脱附等温线为含H1滞后环的IV型等温线，验证了介孔有序特性，介孔孔径为7.8nm，比表面积为849.9m2·g-1，总孔体积为1.25cm3·g-1。
MSRs与支化PEI溶液混合并在37℃孵育15分钟，形成PEI涂层的MSR/PEI微棒。通过分析PEI的氮(N)元素，MSR的氧(O)和硅(Si)元素在能谱仪面扫描图中的分布观察PEI和MSR的结合情况。N、O和Si元素的相同分布验证了PEI在MSR上的涂层充足且均匀(图1B)。随后，TEM和BET检测表明MSR/PEIs保持了微棒外形和介孔结构，比表面积和孔体积与报道现象一致略有减小。推测可能是PEI在微棒表面介孔上覆盖导致了减小。由于MSR/PEI微棒具有较高的比表面积和孔容，且带有正电荷，适合作为抗原的载体实现持续释放。
进一步以OVA为抗原模型，将MSR/PEI分散在OVA抗原溶液中直接吸附制备了MSR/PEI/OVA疫苗微棒。MSR、MSR/PEI和MSR/PEI/OVA微棒的Zeta电位分别为-22.33±1.80、29.50±0.46和19.47±1.70，证实了疫苗的成功自组装(图1D)。在PBS中分散后，MSR微棒表面的硅羟基使其具有负Zeta电位。在聚阳离子PEI涂层良好的情况下，MSR/PEI的Zeta电位由负(MSR)变为正。带负电荷的多肽OVA的加入，使MSR/PEI/OVAs的Zeta电位低于MSR/PEI。随后制备载疫苗支架并进行检测。根据FTIR结果(图2B)，在OHA的光谱中，在1715.3cm-1附近出现了一个新的与醛基对应的吸收峰，验证了合成的成功。PVA/OHA溶液作为粘结剂使得CPC生物墨水可以流畅地从打印喷嘴中挤出。扫描电镜结果表明，打印的CPC支架具有可控的外形，大小为500μm相互连通良好的大孔。此外，可以看到MSR/PEI能在支架上较好分散(图2A)。为了避免被血液快速冲走，设计将疫苗与打印支架通过共价键结合。因此，仔细观察了抗原和硅离子从支架释放的行为。Micro-BCA试剂盒检测结果显示(图2C)，OVA在7天内逐渐从支架中释放。虽然每天更换释放液，释放液中Si离子浓度在72小时内从6mg·L-1逐渐下降到1mg·L-1，并能维持在1mg·L-1左右(图2D)，这一现象表明MSR/PEIs与CPC支架的结合相对稳定。
(二)装载疫苗的支架可以招募并激活树突细胞
据报道，大量树突细胞的激活与体液免疫应答的诱导作用密切相关。因此，进一步分析了负载MSR/PEI/OVA的支架对树突细胞募集和激活的作用。
首先，观察了树突细胞在疫苗负载支架上的募集情况。通过扫描电镜观察发现，细胞在24小时内募集到载体和疫苗装载支架上并主要附着在微棒上，而在CPC支架上只看到少量细胞(图3A)。然后，根据之前的报道用共刺激表面标记物CD86和主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ的表达水平来评估树突状细胞的激活。共聚焦显微镜结果显示(图3A)，MHCⅡ+的募集细胞分布在MSR/PEI和MSR/PEI/OVAs表面，并显示出特征的微棒形态。此外，培养液中细胞组成的流式细胞检测结果(图3B)显示，CPC组、MSR/PEI组和MSR/PEI/OVA组的CD11c+树突状细胞分别表达CD86+的有28.7％、36.7％和39.4％，分别表达MHCⅡ+的有31.6％、38.7％和41％。共培养48h后分析疫苗负载支架对树突状细胞抗原呈递的影响发现，显微镜下可见支架大孔中释放的MSR/PEI和MSR/PEI/OVAs间有树突细胞募集(图3C)。此外，共聚焦显微镜观察到，CPC-MSR/PEI/OVAs支架上SIINFEKL-H2Kb+抗原交叉递呈树突细胞比CPC-MSR/PEI和CPC支架上更多(图3D)。用流式细胞术检测培养液中的细胞发现，CPC、CPC-MSR/PEI和CPC-MSR/PEI/OVAs组CD11c+树突细胞中SIINFEKL-H2Kb+的表达量分别为10.5％、12.4％和15.0％(图3E)。已有报道表明，作为一种潜在的生物相容性疫苗佐剂，MSR与人树突状细胞共培养后能够增强CD86的表达。我们的结果表明，在3D打印支架上负载的MSR/PEI不仅能够促进树突状细胞活化，还能促进其呈递抗原。此外，与其他两组相比，CPC-MSR/PEI/OVAs组树突状细胞在支架上及其培养液中SIINFEKL-H2Kb+的数量最多，证实了有效的DCs募集和激活功能。与其他组相比，载MSR/PEI/OVA的支架培养液中活化的细胞更多也表明从支架中释放出来的抗原仍然保持其功能。
(三)疫苗负载支架促进骨髓间充质干细胞附着和成骨分化
作为用于骨修复的生物材料，支架对骨髓间充质干细胞的活性、黏附和成骨分化的影响起着重要作用。现有报道发现3D打印支架释放适当浓度的硅离子促进了骨髓间充质干细胞的成骨分化，然而，新疫苗系统的生物相容性和成骨特性尚不清楚。因此，我们考察了疫苗负载对mBMSCs功能的影响。SEM观察发现mBMSCs紧密附着在所有支架表面，而CPC-MSR/PEI和CPC-MSR/PEI/OVA支架上细胞较多(图4A)。此外，在CPC-MSR/PEI和MS-MSR/PEI/OVA支架上，mBMSCs表现出更伸展的形态。由于三组支架具有相似的表面形态，我们猜测细胞粘附和伸展的促进作用可能与MSR/PEI和MSR/PEI/OVA的正电荷有关。随后，我们观察了疫苗负载对细胞成骨分化行为的影响。在骨髓间充质干细胞与支架共培养7天后检测其ALP活性发现，CPC-MSR/PEI和MS-MSR/PEI/OVA支架上的ALP阳性面积明显大于CPC支架，验证了疫苗体系具有促进成骨的作用。CPC-MSR/PEI组比CPC-MSR/PEI/OVA组具有更多的阳性面积。这可能与MSR/PEI/OVA的释放有关。由于加载OVA会导致MSR/PEI/OVA上较少可与支架上的醛基结合的NH2，MSR/PEI/OVA微棒比MSR/PEI微棒更容易从支架上释放。我们也观察到CPC-MSR/PEI/OVA支架培养孔底部的ALP阳性细胞多于CPC-MSR/PEI支架。虽然CPC支架上几乎看不到ALP阳性区域，但培养孔底部的部分细胞显示出ALP活性。这与之前的报道以及细胞黏附结果一致，虽然支架上黏附的细胞较少，CPC支架释放成分可轻微促进骨髓间充质干细胞成骨分化。总之，以上结果表明，负载疫苗系统的支架可以促进骨髓间充质干细胞的黏附和成骨分化。为评估疫苗和CPC支架的结合作用，我们将装载MSR/PEI和MSR/PEI/OVAs的支架用培养基浸泡和冲洗几天后开始以上实验，其结果进一步证明了结合的稳定性。
(四)皮下包埋模型中疫苗负载支架诱导TH2反应并促进血管生成
我们将负载MSR/PEI/OVA支架植入C57BL/6J小鼠皮下观察其产生和募集抗原特异性CD4+T细胞的能力。24只小鼠随机分为4组：(1)未接种小鼠，(2)接种空白CPC支架的小鼠，(3)接种CPC-MSR/PEI支架的小鼠，(4)接种CPC-MSR/PEI/OVA支架的小鼠。为表征支架引起的TH1和TH2反应，分析了植入后第7天分离的脾脏CD4+T细胞中表达干扰素(IFN)-γ+(一种关键的TH1标记物)和白细胞介素(IL)-4+(一种关键的TH2标记物)的细胞比例(图5B)。CPC-MSR/PEI组IFN-γ+和IL4+细胞比例均较高，表明MSR/PEI可同时触发TH1和TH2反应。然而，与CPC-MSR/PEI支架相比，CPC-MSR/PEI/OVA支架可使IFN-γ+细胞量降低，IL-4+细胞量显著增加(P<0.001)。这表明CPC-MSR/PEI/OVA支架能够有效引发抗原OVA的特异性免疫刺激反应。接着，我们继续观察CPC-MSR/PEI/OVA支架募集抗原特异性CD4+T细胞的能力。在接种后第7天，CPC-MSR/PEI/OVA支架大孔中CD4+T细胞的聚集量明显高于CPC-MSR/PEI支架和空白支架(P<0.001)(图5C)；与空白支架相比，CPC-MSR/PEI支架中CD4+T细胞较多，这一趋势与体外DCs活化结果一致。
此前研究发现，OVA疫苗基于对CD4+T细胞募集的作用，在后肢缺血中有效增强了血管新生和血液灌流。因此，我们考察了植入CPC-MSR/PEI/OVA支架促进小鼠血管生成的能力。植入后第14天，使用活体动物多模式超声成像系统检测支架内的血液灌注(图5D)。从结果来看，CPC-MSR/PEI/OVA支架大孔中自上而下可见血流信号。然而，CPC支架仅表面可见血流信号，CPC-MSR/PEI支架仅能探测到从表面到支架中部信号。通过肉眼观察收集的支架发现(图5E)，CPC-MSR/PEI/OVA支架周围和内部新形成的血管比其他支架更多。以上研究证实，支架植入后的疫苗微环境可促进血管迅速生长。局部增强血管生成的机制可能与OVA特异性IL-5和IL-10的增加有关。这些由抗原特异性TH2细胞和嗜酸性粒细胞分泌的因子可通过直接增强内皮细胞芽生促进体内血管生成。深入机制仍有待后续研究。虽然适当浓度的硅离子释放可以促进血管生成，但OVA特异性免疫反应的增强效果被证明更有效。
(五)载疫苗支架促进大鼠颅骨缺损修复模型血管化骨再生
我们在大鼠颅骨缺损修复模型中研究了疫苗负载支架对血管化骨再生的作用(图6A)。Micro-CT结果显示(图6B,C)，植入8周后，未治疗组、CPC组、CPC-MSR/PEI组和CPC-MSR/PEI/OVA组缺损内新生骨体积比(BV/TV)分别为5.02±0.35％、8.78±0.61％、11.13±2.45％、12.18±0.39％。CPC-MSR/PEI/OVA组显示了最好的修复效果，具有最高的BV/TV值(P<0.01)。从3D重建图像上看，CPC-MSR/PEI/OVA支架周围和内部新形成的骨比其他组多。此外，CPC-MSR/PEI支架比CPC支架具有更好的促成骨作用。我们还通过组织学分析对组织再生情况进行更详细的分析。植入支架的骨缺损部位HE和Masson染色结果如图6D所示，在未治疗组和CPC支架中几乎未发现成骨。CPC-MSR/PEI/OVA组比CPC-MSR/PEI组有更多的成熟新生骨组织。此外，在CPC-MSR/PEI和CPC-MSR/PEI/OVA支架中可见丰富CD31+细胞在大孔和新生骨内聚集成管。MSR/PEI支架的促成骨作用与我们的预期一致。CPC-MSR/PEI/OVA支架更有效的成骨促进作用可能与以下两个原因有关。首先，支架内血管充足，进一步促进骨再生。其次，募集的CD4+T也可通过其他通路直接促进成骨。
3.结论
通过MSR/PEI/OVA疫苗的稳定装载，本发明成功构建了具有抗原特异性T细胞募集功能的3D打印支架。合成的MSR作为载体具有层状有序介孔和高比表面积，与枝状聚阳离子高分子PEI和抗原OVA逐层组装制备得到了表面富含氨基的MSR/PEI/OVA疫苗。基于席夫碱基反应，疫苗与支架表面醛基共价交联并稳定结合于支架上，实现了OVA和硅离子的缓释。体外研究表明，负载的疫苗体系不仅能够募集和活化树突细胞使其处理抗原，还能够促进骨髓间充质干细胞在支架上黏附，铺展和成骨分化。体内实验结果表明，在动物体内植入负载疫苗的支架后，逐渐释放的OVA快速募集了抗原特异性CD4+T细胞，促进了局部血管新生并增加了支架中的血流灌注。在增加的血液供应和释放的硅离子共同作用下，负载MSR/PEI/OVA疫苗的3D打印支架还促进了骨组织的再生。总之，我们研发了一个用于促进血管新生的抗原特异性免疫调控3D打印支架治疗平台。

Claims (8)

1.一种用于促进骨组织再生的TH2细胞活化的3D打印支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）MSR/PEI疫苗载体的制备：取介孔二氧化硅微棒配制成分散液，然后与聚乙烯亚胺溶液混合，在37 ℃下共孵育5-30 min，制备得到MSR/PEI疫苗载体；
（2）MSR/PEI/OVA疫苗的制备：将卵清蛋白与MSR/PEI疫苗载体于37 ℃振荡孵育1-3 h，获得MSR/PEI/OVA疫苗；
（3）取氧化聚合物和聚乙烯醇在水溶液中按照质量比1：5~20混合形成富含醛基的粘结剂，将磷酸钙基粉末与粘合剂均匀混合制得可打印浆料，打印制得钙磷基支架；其中，所述磷酸钙基粉末为自固化磷酸钙骨水泥，所述氧化聚合物为氧化透明质酸；所述氧化聚合物的制备方法为：将透明质酸溶于蒸馏水，在4-37℃环境中逐滴加入浓度为0.5 M的高碘酸钠溶液，不断搅拌2-4 h，然后停止反应，4-37℃下沉淀1-6 h，收集沉淀经透析和冻干，得到氧化聚合物；
（4）将MSR/PEI/OVA疫苗在PBS缓冲液中重悬，然后滴在支架上制备得到载疫苗支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述介孔二氧化硅微棒是由以下方法合成：以聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物为结构导向剂，以正硅酸四乙酯为硅源进行合成。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述介孔二氧化硅微棒分散液的浓度为30-70 mg·mL-1，所述聚乙烯亚胺溶液的浓度为15-35 μg·mL-1。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述聚乙烯醇的重均分子量为98000。
5.一种TH2细胞活化的3D打印支架，其特征在于，是由权利要求1-4任一项所述方法制备而得，所述3D打印支架具有抗原特异性T细胞募集功能。
6.如权利要求1-4任一项所述制备方法得到的3D打印支架或如权利要求5所述的3D打印支架的应用，其特征在于，所述应用包括在制备促进骨修复材料方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括在制备促进骨组织再生材料方面的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括在制备促进血管新生材料方面的应用。
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