CN113651875A - 一种寡肽-34的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种寡肽‑34的合成方法，包括先制备Fmoc‑Gly‑二氯三苯甲基树脂，基于该树脂固相合成寡肽‑34片段肽树脂，随后制备寡肽‑34肽链片段，并采用液相合成制备全保护多肽寡肽‑34，最后制备寡肽‑34，即可。本发明的合成方法采用固相合成与液相合成相结合的方式，有效解决了多肽固相合成C端Gly‑Asp形成内酯六元环副反应的发生，提高了产品的收率和纯度。
Description
技术领域
本发明属于寡肽的制备工艺领域，尤其涉及一种寡肽-34的合成方法。
背景技术
寡肽-34是一种合成肽，含有13种氨基酸，包括精氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、谷氨酰胺、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和色氨酸。在化妆品中应用具有亮肤、美白、淡斑等效用，能够降低黑色素细胞的黑色素合成和酪氨酸酶活性，减少黑素体向新角质形成细胞的转移，减少色素沉着，对色素斑有明显的增白作用。
寡肽-34序列为Ile-Trp-Ser-Leu-Asp-Thr-Gln-Tyr-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp，现有的多肽固相合成从碳端asp开始合成，当接完fmoc-gly-cooh，用哌啶脱除fmoc时，在哌啶弱碱催化下很容易发生游离-NH2基对分子内的C末端酯键的氨解反应，导致Gly-Asp形成六元环，进而将多肽在树脂载体上连根拔起，致使后续反应无法进行。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种新型的寡肽-34的合成方法，该方法能够有效解决多肽固相合成C端Gly-Asp形成内酯六元环副反应。
技术方案：本发明寡肽-34的合成方法，包括如下步骤：
（1）制备Fmoc-Gly-二氯三苯甲基树脂：按摩尔比1:1.1-1.5将二氯三苯甲基树脂与Fmoc-Gly-OH混合反应制得Fmoc-Gly-二氯三苯甲基树脂；
（2）固相合成寡肽-34片段肽树脂：基于Fmoc-Gly-二氯三苯甲基树脂，偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly–OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH及Boc-Ile-OH，制得寡肽-34片段肽树脂；其中，所述Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly–OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH及Boc-Ile-OH与二氯三苯甲基树脂的摩尔比均为1.8-2.5:1；
（3）制备寡肽-34肽链片段：将寡肽-34片段肽树脂加入三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中，反应后过滤掉树脂并调节其pH至中性，旋干制得寡肽-34肽链片段；其中，所述三氟乙酸和二氯甲烷的混合液与二氯三苯甲基树脂的体积质量比为8-15:1；
（4）液相合成制备全保护多肽寡肽-34：溶解寡肽-34肽链片段后，加入H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl、PyBop、1-羟基苯并三唑及N,N-二异丙基乙胺，搅拌反应4-5 h，经萃取、洗涤、干燥浓缩制得油状的全保护多肽寡肽-34；其中，所述H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl与二氯三苯甲基树脂的摩尔比为2-3:1，PyBop与二氯三苯甲基树脂的摩尔比为1.8-2.5:1，1-羟基苯并三唑与二氯三苯甲基树脂的摩尔比为1.8-2.5:1，N,N-二异丙基乙胺与二氯三苯甲基树脂的摩尔比为3-6:1；
（5）制备寡肽-34：切除全保护多肽寡肽-34上的侧链保护基团，制得寡肽-34。
本发明摒弃了现有的寡肽-34固相依次从Asp开始合成的方式，采用固相与液相结合合成的方式，先从Gly开始依次合成Arg、Gly、Gly、Tyr、Gln、Thr、Asp、Leu、Ser、Trp及Ile后，再合成Asp，进而有效解决了多肽固相合成C端Gly-Asp形成内酯六元环副反应的发生，提高了寡肽-34的收率和纯度。
进一步说，本发明合成方法的步骤（1）中，Fmoc-Gly-二氯三苯甲基树脂具体由如下步骤制得：将取代度为0.4-0.6 mmol/g的二氯三苯甲基树脂浸泡于二氯甲烷中充分溶胀，加入Fmoc-Gly-OH充分溶解后，加入N,N-二异丙基乙胺，采用氮气鼓动的方式反应2-2.5h后，加入甲醇继续反应1-1.5h，洗涤制得Fmoc-Gly-二氯三苯甲基树脂。
优选的，二氯甲烷与二氯三苯甲基树脂的体积质量比为10-15:1，N,N-二异丙基乙胺与二氯三苯甲基树脂的体积质量比为1-3:1，甲醇与二氯三苯甲基树脂的体积质量比为1.6-10:1。
进一步说，本发明合成方法的步骤（2）中，偶联时还加入二氯三苯甲基树脂摩尔量3-6倍的1,3-二异丙基碳二亚胺，二氯三苯甲基树脂摩尔量1.8-2.5倍的1-羟基苯并三唑。
进一步说，本发明合成方法的步骤（3）中，所述三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为2:98。
进一步说，本发明合成方法的步骤（5）中，采用切割试剂进行切除，该切割试剂与全保护多肽寡肽-34的体积质量比为4-8:1。
优选的，切割试剂为体积比95:3:2的三氟乙酸、三异丙基硅烷及纯水混合物。
有益效果：与现有技术相比，本发明的显著优点为：该方法采用固相合成与液相合成相结合，有效解决了多肽固相合成C端Gly-Asp形成内酯六元环副反应的发生，优化了合成路线和条件，制备的粗品产品收率高，纯度高，操作工艺简便，适合规模性的生产。
附图说明
图1为本发明实施例1合成方法所制备的寡肽-34的质谱图；
图2为本发明实施例1合成方法所制备的寡肽-34的HPLC图；
图3为本发明实施例2合成方法所制备的寡肽-34的质谱图；
图4为本发明实施例2合成方法所制备的寡肽-34的HPLC图；
图5为本发明实施例3合成方法所制备的寡肽-34的质谱图；
图6为本发明实施例3合成方法所制备的寡肽-34的HPLC图；
图7为现有固相合成方法所制备的寡肽-34的质谱图；
图8为现有固相合成方法所制备的寡肽-34的HPLC图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明。需说明的是，本发明的合成方法中所采用的原料均可购自市售。
实施例1
该实施例寡肽-34的合成方法包括如下步骤：
（1）制备Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂：
在夹套层析柱中加入10 g取代度为0.4-0.6 mmol/g的2-ChlorotritylCholoride Resin树脂，加入120 ml的有机溶剂二氯甲烷(DCM)浸泡树脂5 min，使树脂充分溶胀，加入1.78 g的Fmoc-Gly-OH待充分溶解后加入10 ml有机碱N,N-二异丙基乙胺（DIEA），之后通入氮气鼓动的方式反应2 h，加入50 ml甲醇继续1 h后抽掉反应液，分别采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2进行洗涤，制得Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂。
（2）制备寡肽-34片段肽树脂：
该树脂的序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)
-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-2CTC Resin；
1）将反应制得的Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂浸泡在100 ml（树脂质量8至15倍量体积）有机溶剂二氯甲烷中，通入氮气鼓动使其充分溶胀，抽掉，用DMF洗涤三次，抽掉；
2）加入100 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2进行洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入6.48 g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，2.5 ml的DIC和1.35 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
3）加入100 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入2.97 g的Fmoc-Gly–OH，2.5 ml的DIC和1.35 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
4）加入100 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入2.97 g的Fmoc-Gly–OH，2.5 ml的DIC和1.35 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
5）加入100 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入4.57 g的Fmoc-Tyr(tBu)-OH，2.5 ml的DIC和1.35 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
6）加入100 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入6.10 g的Fmoc-Gln(Trt)-OH，2.5 ml的DIC和1.35 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
7）加入120 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入3.97 g的Fmoc-Thr(tBu)-OH，2.5 ml DIC和1.35 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
8）加入120 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入4.11 g的Fmoc-Asp(OtBu)-OH，2.5 ml的DIC和1.35 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
9）加入120 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入3.53 g的Fmoc-Leu-OH，2.5 ml的DIC和1.35 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
10）加入120 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入3.83 g的Fmoc-Ser(tBu)-OH，2.5 ml的DIC和1.35 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
11）加入120 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入5.26 g的Fmoc-Trp(Boc)-OH，2.5 ml的DIC和1.35 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
12）加入120 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入2.31 g的Boc-Ile-OH，2.5ml的DIC和1.35 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min，后茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次，甲醇洗4次，干燥制得肽树脂。
（3）制备寡肽-34肽链片段：
该寡肽-34肽链片段序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr
(tBu)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-OH；
配置体积比为2:98的三氟乙酸（TFA）/二氯甲烷（DCM）混合溶液，将上述制备的寡肽-34片段肽树脂加入100 ml（树脂质量10倍体积）的三氟乙酸/二氯甲烷混合溶液中，置于恒温气浴摇床振荡器摇动反应1 h，过滤掉树脂，并将制得的混合溶液中加入有机碱N,N-二异丙基乙胺（DIEA），调节三氟乙酸（TFA）二氯甲烷（DCM）混合溶液的pH值至中性，使用旋转蒸发仪真空浓缩制得寡肽-34肽链片段。
（4）液相合成制备全保护多肽寡肽-34：
序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-
Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-OtBu.HCl；
在1L单口瓶中加入500 mlDMF溶解上述制得的寡肽-34肽链片段，加入4 g的H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl，5.2 g的PyBop，1.5 g的HOBT及4 ml的DIEA搅拌反应4 h，用1 L乙酸乙酯（EA）和300 ml水萃取出反应完全的全保护多肽寡肽-34，上层用5%柠檬酸水洗2遍，饱和盐水洗2遍后干燥，浓缩后得全保护多肽寡肽-34（油状物）。
（5）制备寡肽-34粗品：在12.13 g油状全保护多肽寡肽-34中加入50 ml（质量4至8倍量体积）切割试剂（三氟乙酸(TFA):三异丙基硅烷(TIS):纯水=95:3:2），置于恒温气浴摇床振荡器摇动反应2.5 h，反应结束后直接加入无水乙醚，有固体析出，用无水乙醚洗涤3遍，抽滤得到干燥固体，该干燥固体即为寡肽-34粗品，称重6.28 g。
性能检测1
将实施例1制备的寡肽-34进行质谱及HPLC图检测分析，获得的结果如图1和图2所示。通过该图可知，粗品分子量正确，粗品纯度75%以上，粗品较好。
实施例2
本实施例寡肽-34的合成方法包括如下步骤：
（1）制备Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂：
在夹套层析柱中加入15 g取代度为0.4-0.6 mmol/g的2-ChlorotritylCholoride Resin树脂，加入200 ml的有机溶剂二氯甲烷(DCM)浸泡树脂5 min，使树脂充分溶胀，加入2.90 g的Fmoc-Gly-OH待充分溶解后加入15 ml有机碱N,N-二异丙基乙胺（DIEA），之后通入氮气鼓动的方式反应2 h后加入80 ml甲醇继续1 h后抽掉反应液，分别采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2进行洗涤，制得Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂。
（2）制备寡肽-34片段肽树脂：
序列为：Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)
-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-2CTC Resin；
1）将反应制得的Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂浸泡在150 ml（树脂质量8至15倍量体积）有机溶剂二氯甲烷中，通入氮气鼓动使其充分溶胀，抽掉，用DMF洗涤三次，抽掉；
2）加入150 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2进行洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入9.72 g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，3.8 ml的DIC和2.03 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
3）加入150 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入4.46 g的Fmoc-Gly –OH，3.8ml的DIC和2.03 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
4）加入150 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入4.46 g的Fmoc-Gly–OH，3.8 ml的DIC和2.03 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
5）加入150 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入6.86 g的Fmoc-Tyr(tBu)-OH，3.8 ml的DIC和2.03 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
6）加入150 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入9.15 g的Fmoc-Gln(Trt)-OH，3.8 ml的DIC和2.03 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
7）加入180 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入5.96 g的Fmoc-Thr(tBu)-OH，3.8 ml的DIC和2.03 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
8）加入180 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入6.17 g的Fmoc-Asp(OtBu)-OH，3.8 ml的DIC和2.03 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
9）加入180 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入5.03 g的Fmoc-Leu-OH，3.8 ml的DIC和2.03 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
10）加入180 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入5.75 g的Fmoc-Ser(tBu)-OH，3.8 ml的DIC和2.03 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
11）加入180 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入7.89 g的Fmoc-Trp(Boc)-OH，3.8 ml的DIC和2.03 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
12）加入180 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入3.47 g的Boc-Ile-OH，3.8 ml的DIC和2.03 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min，后茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次，甲醇洗4次，干燥制得肽树脂。
（3）制备寡肽-34肽链片段：
该寡肽-34肽链片段序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr
(tBu)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-OH；
配置体积比为2:98的三氟乙酸（TFA）/二氯甲烷（DCM）混合溶液，将上述制备的寡肽-34片段肽树脂加入120 ml（树脂质量8倍体积）的三氟乙酸/二氯甲烷混合溶液中，置于恒温气浴摇床振荡器摇动反应1 h，过滤掉树脂，并将制得的混合溶液中加入有机碱N,N-二异丙基乙胺（DIEA），调节三氟乙酸（TFA）二氯甲烷（DCM）混合溶液的pH值至中性，使用旋转蒸发仪真空浓缩制得寡肽-34肽链片段。
（4）制备全保护多肽寡肽-34：
序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-
Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-OtBu.HCl；
在1 L单口瓶中加入600 ml的DMF溶解上述制得的寡肽-34肽链片段，加入6 g的H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl，7.8 g的PyBop，2.6 g的HOBT及6.5 ml的DIEA搅拌反应4 h，用1.5 L乙酸乙酯（EA）和450 ml水萃取出反应完全的全保护多肽寡肽-34，上层用5%柠檬酸水洗2遍，饱和盐水洗2遍后干燥，浓缩后得全保护多肽寡肽-34（油状物）。
（5）制备寡肽-34粗品：在17.34 g油状全保护多肽寡肽-34中加入100 ml（质量4至8倍量体积）切割试剂（三氟乙酸(TFA):三异丙基硅烷(TIS):纯水=95:3:2），置于恒温气浴摇床振荡器摇动反应2.5 h，反应结束后直接加入无水乙醚，有固体析出，用无水乙醚洗涤3遍，抽滤得到干燥固体，该干燥固体即为寡肽-34粗品，称重9.12 g。
性能检测2
将该实施例2制备的寡肽-34进行质谱及HPLC图检测分析，获得的结果如图3和图4所示。通过该图可知，粗品质谱干净，粗品纯度近80%，粗品好。
实施例3
本实施例寡肽-34的合成方法包括如下步骤：
（1）制备Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂：
在夹套层析柱中加入20 g取代度为0.5 mmol/g的2-Chlorotrityl CholorideResin树脂，加入240 ml有机溶剂二氯甲烷(DCM)浸泡树脂5 min，使树脂充分溶胀，加入3.63 g的Fmoc-Gly-OH待充分溶解后加入20 ml有机碱N,N-二异丙基乙胺（DIEA），之后通入氮气鼓动的方式反应2 h后加入100 ml甲醇继续1 h后抽掉反应液，分别采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2进行洗涤，制得Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂。
（2）制备寡肽-34片段肽树脂：
序列为：Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)
-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-2CTC Resin；
1）将反应制得的Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂浸泡在200 ml（树脂质量8至15倍量体积）有机溶剂二氯甲烷中，通入氮气鼓动使其充分溶胀，抽掉，用DMF洗涤三次，抽掉；
2）加入200 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2进行洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入12.96 g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，5 ml的DIC和2.7 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
3）加入200 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入5.94 g的Fmoc-Gly –OH，5 ml的DIC和2.7 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
4）加入200 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入5.94 g的Fmoc-Gly–OH，5 ml的DIC和2.7 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
5）加入200 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入9.14 g的Fmoc-Tyr(tBu)-OH，5 ml的DIC和2.7 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
6）加入200 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入12.1 g的Fmoc-Gln(Trt)-OH，5 ml的DIC和2.7 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
7）加入240 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入7.94 g的Fmoc-Thr(tBu)-OH，5 ml的DIC和2.7 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
8）加入240 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入8.22 g的Fmoc-Asp(OtBu)-OH，5 ml的DIC和2.7 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
9）加入240 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入7.06 g的Fmoc-Leu-OH，5 ml的DIC和2.7 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
10）加入240 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入7.66 g的Fmoc-Ser(tBu)-OH，5 ml的DIC和2.7 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
11）加入240 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入10.52 g的Fmoc-Trp(Boc)-OH，5 ml的DIC和2.7 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
12）加入240 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入4.62 g的Boc-Ile-OH，5 ml的DIC和2.7 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min，后茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次，甲醇洗4次，干燥制得肽树脂。
（3）制备寡肽-34肽链片段：
该寡肽-34肽链片段序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr
(tBu)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-OH；
配置体积比为2:98的三氟乙酸（TFA）/二氯甲烷（DCM）混合溶液，将上述制备的寡肽-34片段肽树脂加入300 ml（树脂质量15倍体积）的三氟乙酸/二氯甲烷混合溶液中，置于恒温气浴摇床振荡器摇动反应1 h，过滤掉树脂，并将制得的混合溶液中加入有机碱N,N-二异丙基乙胺（DIEA），调节三氟乙酸（TFA）二氯甲烷（DCM）混合溶液的pH值至中性，使用旋转蒸发仪真空浓缩制得寡肽-34肽链片段。
（4）制备全保护多肽寡肽-34：
序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-
Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-OtBu.HCl；
在2 L单口瓶中加入1 L DMF溶解上述制得的寡肽-34肽链片段，加入8 g的H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl，10.5 g的PyBop，3 g的HOBT及10 ml的DIEA搅拌反应4 h，用2 L乙酸乙酯（EA）和600 ml水萃取出反应完全的全保护多肽寡肽-34，上层用5%柠檬酸水洗2遍，饱和盐水洗2遍后干燥，浓缩后得全保护多肽寡肽-34（油状物）。
（5）制备寡肽-34粗品：在22.58 g油状全保护多肽寡肽-34中加入150 ml（质量4至8倍量体积）切割试剂（三氟乙酸(TFA):三异丙基硅烷(TIS):纯水=95:3:2），置于恒温气浴摇床振荡器摇动反应2.5 h，反应结束后直接加入无水乙醚，有固体析出，用无水乙醚洗涤3遍，抽滤得到干燥固体，该干燥固体即为寡肽-34粗品，称重12.11 g。
性能检测3
将该实施例3制备的寡肽-34进行质谱及HPLC图检测分析，获得的结果如图5和图6所示。通过该图可知，粗品质谱分子量正确，粗品纯度近70%，粗品较好。
对比例
采用现有的固相合成制得寡肽-34，同时对该寡肽-34进行性能检测，获得的结果如图7和图8所示，通过该图可知，粗品质谱显示有正确分子量，存在非目标分子量，纯度仅为50%不到，粗品纯度差。
实施例4
该实施例寡肽-34的合成方法包括如下步骤：
（1）制备Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂：
在夹套层析柱中加入10 g取代度为0.4-0.6 mmol/g的2-ChlorotritylCholoride Resin树脂，加入100 ml的有机溶剂二氯甲烷(DCM)浸泡树脂5 min，使树脂充分溶胀，加入1.31 g的Fmoc-Gly-OH待充分溶解后加入10 ml有机碱N,N-二异丙基乙胺（DIEA），之后通入氮气鼓动的方式反应2 h后加入16 ml甲醇继续1 h后抽掉反应液，分别采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2进行洗涤，制得Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂。
（2）制备寡肽-34片段肽树脂：
该树脂的序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)
-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-2CTC Resin；
1）将反应制得的Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂浸泡在80 ml（树脂质量8至15倍量体积）有机溶剂二氯甲烷中，通入氮气鼓动使其充分溶胀，抽掉，用DMF洗涤三次，抽掉；
2）加入80 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2进行洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入4.67 g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，1.85 ml的DIC和0.97 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
3）加入80 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入2.14 g的Fmoc-Gly –OH，1.85 ml的DIC和0.97 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
4）加入80 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入2.14 g的Fmoc-Gly–OH，1.85 ml的DIC和0.97 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
5）加入80 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入3.31 g的Fmoc-Tyr(tBu)-OH，1.85 ml的DIC和0.97 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
6）加入80 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入4.39 g的Fmoc-Gln(Trt)-OH，1.85 ml的DIC和0.97 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
7）加入100 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入2.87 g的Fmoc-Thr(tBu)-OH，1.85 ml的DIC和0.97 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
8）加入100 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入2.96 g的Fmoc-Asp(OtBu)-OH，1.85 ml的DIC和0.97 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
9）加入100 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入2.54 g的Fmoc-Leu-OH，1.85 ml的DIC和0.97 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
10）加入100 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入2.76 g的Fmoc-Ser(tBu)-OH，1.85 ml的DIC和0.97 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
11）加入100 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入3.79 g的Fmoc-Trp(Boc)-OH，1.85 ml的DIC和0.97 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
12）加入100 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入1.67 g的Boc-Ile-OH，1.85 ml的DIC和0.97 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min，后茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次，甲醇洗4次，干燥制得肽树脂。
（3）制备寡肽-34肽链片段：
该寡肽-34肽链片段序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr
(tBu)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-OH；
配置体积比为2:98的三氟乙酸（TFA）/二氯甲烷（DCM）混合溶液，将上述制备的寡肽-34片段肽树脂加入100 ml（树脂质量10倍体积）的三氟乙酸/二氯甲烷混合溶液中，置于恒温气浴摇床振荡器摇动反应1 h，过滤掉树脂，并将制得的混合溶液中加入有机碱N,N-二异丙基乙胺（DIEA），调节三氟乙酸（TFA）二氯甲烷（DCM）混合溶液的pH值至中性，使用旋转蒸发仪真空浓缩制得寡肽-34肽链片段。
（4）制备全保护多肽寡肽-34：
序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-
Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-OtBu.HCl
在1 L单口瓶中加入500 mlDMF溶解上述制得的寡肽-34肽链片段，加入2.25 g的H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl，3.75 g的PyBop，0.97 g的HOBT及1.98mlDIEA搅拌反应4 h，用1 L乙酸乙酯（EA）和300 ml水萃取出反应完全的全保护多肽寡肽-34，上层用5%柠檬酸水洗2遍，饱和盐水洗2遍后干燥，浓缩后得全保护多肽寡肽-34（油状物）。
（5）制备寡肽-34粗品：在13.74 g油状全保护多肽寡肽-34中加入55 ml（质量4至8倍量体积）切割试剂（三氟乙酸(TFA):三异丙基硅烷(TIS):纯水=95:3:2），置于恒温气浴摇床振荡器摇动反应2.5 h，反应结束后直接加入无水乙醚，有固体析出，用无水乙醚洗涤3遍，抽滤得到干燥固体，该干燥固体即为寡肽-34粗品，称重5.26 g。
实施例5
该实施例寡肽-34的合成方法包括如下步骤：
（1）制备Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂：
在夹套层析柱中加入10 g取代度为0.4-0.6 mmol/g的2-ChlorotritylCholoride Resin树脂，加入150 ml的有机溶剂二氯甲烷(DCM)浸泡树脂5 min，使树脂充分溶胀，加入2.68 g的Fmoc-Gly-OH待充分溶解后加入30 ml有机碱N,N-二异丙基乙胺（DIEA），之后通入氮气鼓动的方式反应2.5 h后加入100 ml甲醇继续1.5 h后抽掉反应液，分别采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2进行洗涤，制得Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl CholorideResin树脂。
（2）制备寡肽-34片段肽树脂：
该树脂的序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)
-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-2CTC Resin；
1）将反应制得的Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Choloride Resin树脂浸泡在130 ml（树脂质量8至15倍量体积）有机溶剂二氯甲烷中，通入氮气鼓动使其充分溶胀，抽掉，用DMF洗涤三次，抽掉；
2）加入130 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2进行洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入9.73 g的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，5.57 ml的DIC和2.02 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
3）加入130 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入4.46 g的Fmoc-Gly –OH，5.57 ml的DIC和2.02 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
4）加入130 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入4.46 g的Fmoc-Gly–OH，5.57 ml的DIC和2.02 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
5）加入130 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入6.89 g的Fmoc-Tyr(tBu)-OH，5.57ml的DIC和2.02 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
6）加入130 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入9.16 g的Fmoc-Gln(Trt)-OH，5.57 ml的DIC和2.02 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
7）加入150 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入5.98 g的Fmoc-Thr(tBu)-OH，5.57 ml的DIC和2.02 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
8）加入150 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入6.17 g的Fmoc-Asp(OtBu)-OH，5.57 ml的DIC和2.02 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
9）加入150 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；随后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入5.30 g的Fmoc-Leu-OH，5.57 ml的DIC和2.02 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
10）加入150 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入5.75 g的Fmoc-Ser(tBu)-OH，5.57 ml的DIC和2.02 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
11）加入150 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入7.89 g的Fmoc-Trp(Boc)-OH，5.57 ml的DIC和2.02 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45 min后，茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次；
12）加入150 ml脱帽试剂（20%哌啶+80%DMF，树脂质量8至15倍量体积），通入氮气鼓动反应20 min以去除Fmoc保护基团；然后采用DMF×2、甲醇×2及DMF×2洗涤，抽干；以DMF为溶剂，加入3.48 g的Boc-Ile-OH，5.57 ml的DIC和2.02 g的HOBT，水浴38 ℃下反应45min，后茚三酮检测反应是否完成，反应完成则抽掉反应液，DMF洗涤3次，甲醇洗4次，干燥制得肽树脂。
（3）制备寡肽-34肽链片段：
该寡肽-34肽链片段序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr
(tBu)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-OH；
配置体积比为2:98的三氟乙酸（TFA）/二氯甲烷（DCM）混合溶液，将上述制备的寡肽-34片段肽树脂加入100 ml（树脂质量10倍体积）的三氟乙酸/二氯甲烷混合溶液中，置于恒温气浴摇床振荡器摇动反应1 h，过滤掉树脂，并将制得的混合溶液中加入有机碱N,N-二异丙基乙胺（DIEA），调节三氟乙酸（TFA）二氯甲烷（DCM）混合溶液的pH值至中性，使用旋转蒸发仪真空浓缩制得寡肽-34肽链片段。
（4）制备全保护多肽寡肽-34：
序列为Boc-Ile-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Leu-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Gln(Trt)-Tyr(tBu)-
Gly-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-OtBu.HCl
在1 L单口瓶中加入500mlDMF溶解上述制得的寡肽-34肽链片段，加入5.07 g的H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl，7.81 g的PyBop，2.03 g的HOBT及5.94 ml的DIEA搅拌反应5 h，用1 L乙酸乙酯（EA）和300 ml水萃取出反应完全的全保护多肽寡肽-34，上层用5%柠檬酸水洗2遍，饱和盐水洗2遍后干燥，浓缩后得全保护多肽寡肽-34（油状物）。
（5）制备寡肽-34粗品：在19.11 g油状全保护多肽寡肽-34中加入150 ml（质量8倍量体积）切割试剂（三氟乙酸(TFA):三异丙基硅烷(TIS):纯水=95:3:2），置于恒温气浴摇床振荡器摇动反应2.5 h，反应结束后直接加入无水乙醚，有固体析出，用无水乙醚洗涤3遍，抽滤得到干燥固体，该干燥固体即为寡肽-34粗品，称重6.93 g。
将该实施例4和实施例5进行性能检测可知，该寡肽-34粗品分子量正确，粗品纯度近75%，粗品较好。
Claims (7)
1.一种寡肽-34的合成方法，其特征在于：该合成方法包括如下步骤：
（1）制备Fmoc-Gly-二氯三苯甲基树脂：按摩尔比1:1.1-1.5将二氯三苯甲基树脂与Fmoc-Gly-OH混合反应制得Fmoc-Gly-二氯三苯甲基树脂；
（2）固相合成寡肽-34片段肽树脂：基于Fmoc-Gly-二氯三苯甲基树脂，偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly–OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH及Boc-Ile-OH，制得寡肽-34片段肽树脂；其中，所述Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly–OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH及Boc-Ile-OH与二氯三苯甲基树脂的摩尔比均为1.8-2.5:1；
（3）制备寡肽-34肽链片段：将寡肽-34片段肽树脂加入三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中，反应后过滤掉树脂并调节其pH至中性，旋干制得寡肽-34肽链片段；其中，所述三氟乙酸和二氯甲烷的混合液与二氯三苯甲基树脂的体积质量比为8-15:1；
（4）液相合成制备全保护多肽寡肽-34：溶解寡肽-34肽链片段后，加入H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl、PyBop、1-羟基苯并三唑及N,N-二异丙基乙胺，搅拌反应4-5 h，经萃取、洗涤、干燥浓缩制得油状的全保护多肽寡肽-34；其中，所述H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl与二氯三苯甲基树脂的摩尔比为2-3:1，PyBop与二氯三苯甲基树脂的摩尔比为1.8-2.5:1，1-羟基苯并三唑与二氯三苯甲基树脂的摩尔比为1.8-2.5:1，N,N-二异丙基乙胺与二氯三苯甲基树脂的摩尔比为3-6:1；
（5）制备寡肽-34：切除全保护多肽寡肽-34上的侧链保护基团，制得寡肽-34。
2.根据权利要求1所述寡肽-34的合成方法，其特征在于：步骤（1）中，所述Fmoc-Gly-二氯三苯甲基树脂具体由如下步骤制得：将取代度为0.4-0.6 mmol/g的二氯三苯甲基树脂浸泡于二氯甲烷中充分溶胀，加入Fmoc-Gly-OH充分溶解后，加入N,N-二异丙基乙胺，采用氮气鼓动的方式反应2-2.5 h后，加入甲醇继续反应1-1.5 h，洗涤制得Fmoc-Gly-二氯三苯甲基树脂。
3.根据权利要求2所述寡肽-34的合成方法，其特征在于：所述二氯甲烷与二氯三苯甲基树脂的体积质量比为10-15:1，N,N-二异丙基乙胺与二氯三苯甲基树脂的体积质量比为1-3:1，甲醇与二氯三苯甲基树脂的体积质量比为1.6-10:1。
4.根据权利要求1所述寡肽-34的合成方法，其特征在于：步骤（2）中，所述偶联时还加入二氯三苯甲基树脂摩尔量3-6倍的1,3-二异丙基碳二亚胺，二氯三苯甲基树脂摩尔量1.8-2.5倍的1-羟基苯并三唑。
5.根据权利要求1所述寡肽-34的合成方法，其特征在于：步骤（3）中，所述三氟乙酸和二氯甲烷的混合液中三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为2:98。
6.根据权利要求1所述寡肽-34的合成方法，其特征在于：步骤（5）中，采用切割试剂进行切除，该切割试剂与全保护多肽寡肽-34的体积质量比为4-8:1。
7.根据权利要求6所述寡肽-34的合成方法，其特征在于：所述切割试剂为体积比95:3:2的三氟乙酸、三异丙基硅烷及纯水混合物。
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Denomination of invention: A synthesis method of oligopeptide-34 Effective date of registration: 20231227 Granted publication date: 20220128 Pledgee: Nanjing Bank Co.,Ltd. Nanjing North Branch Pledgor: Nanjing Lyon Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2023980074655 |