CN113648324B - 一种抗猪伪狂犬病病毒的药物、消毒剂、添加剂及其制备方法 - Google Patents
一种抗猪伪狂犬病病毒的药物、消毒剂、添加剂及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗猪伪狂犬病病毒的药物、消毒剂、添加剂及其使用方法，其中，药物、消毒剂，添加剂为槐耳多糖，本发明提供的槐耳多糖对于猪伪狂犬病病毒有着良好的抑制、预防的效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物制剂技术领域，特别是涉及一种抗猪伪狂犬病病毒的药物、消毒剂、添加剂及其使用方法。
背景技术
猪伪狂犬病（Pseudorabies, PR）是由伪狂犬病毒感染猪群引起的猪病，最早由牛传染给猪。随着集约化养猪场的规模扩大，国际动物及其副产品贸易的全球化发展，国内生猪运输流动的需求量增加，该病曾呈爆发性流行。该病通过口鼻感染，进而入侵呼吸道，扁桃体，病猪高热，畏冷，精神沉郁，叫声嘶哑，进食饮水量减少明显，中枢神经受损导致脑沟回出血进而表现行步时共济失调，肺水肿，扁桃体肿大，肝脏，肾脏，脾表面白色坏四点。怀孕母猪流产，产死胎，木乃伊胎，屡配不孕及反情率高。84日龄的架子猪感染后除典型临床症状之外，主要影响猪群的增重，对养殖场造成了巨大的损失。我国对于猪伪狂犬病病毒在1987年从匈牙利引进Bartha-K61疫苗，且在之后的几年国产Bartha-K61疫苗也陆续出现。2011年以前，抗猪伪狂犬病我国使用Bartha-K61疫苗能很好的控制猪群中该疾病的出现，但随着2011年后疫苗免疫过的猪群却爆发新的伪狂犬病疫情，经调查是由于多种变异株的出现，广泛使用的Bartha-K61疫苗对猪群的保护力只有50%~60%,12周龄的猪死亡率接近100%，变异株对猪群的毒力异常增强。抗变异株的出现，我国使用的Bartha-K61疫苗病毒含量的半数致死量是5000，故接种国产Bartha-K61疫苗也不能高质量保护猪群，现今只能通过采购进口Bartha-K61疫苗（病毒含量的半数致死量是105）免疫和“地毯式”免疫猪群为达到野毒株清除，最终净化伪狂犬猪群的效果，尽管非洲猪瘟是现今我国养猪业最亟待解决的问题，但这也不能避免猪伪狂犬病的发生，一旦猪群发生伪狂犬病，这将给我国在非洲猪瘟背景下养猪业的发展带来直接和间接的经济损失。
猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）属疱疹病毒科，甲疱疹病毒亚科，毒力由多个基因协同控制，PRV宿主广，复制周期短，高致病性。在结构上从内到外共分为4层，双链DNA、核衣壳、蛋白质和囊膜。PRV基因组UL区段分布多个毒力基因，如gB、gC等，这些基因与其他基因共同决定病毒的毒力。gB基因全长2742bp,是PRV主要毒力基因，可以诱导机体产生2种中和抗体，可使PRV粒子与宿主细胞融合完成侵入宿主细胞过程。目前国内市场以经典毒株为亲本研制的疫苗有多种，但由于病毒在基因组水平上出现了全新变异，传统疫苗不能使猪群完全抵抗PR的发生，研制一种预防和/或治疗当今流行的变异猪伪狂犬病的生物制剂即为迫切和必要。避免口服给药可能发生的肝首过效应及胃肠灭活，从而避免了许多副作用。
本发明提供了一种抗猪伪狂犬病病毒的药物、消毒剂、添加剂及其应用，相较其他具有抗病毒效果的药物而言，具有以下优点：
1、槐耳多糖是一种药用真菌，用于临床治疗具有悠久的历史，多用于治疗人类癌症和炎症，其主要活性成分是蛋白多糖，可以通过多种途径抑制肿瘤的生长和转移。
2、槐耳多糖经过机体代谢后对环境污染小。
3、槐耳多糖抵抗变异株XJ5株猪伪狂犬病病毒对细胞的感染效果显著，试验发现此药物能够减少所述病毒引起的细胞病变。
4、应用槐耳多糖浓度在25~200μg/ml，可能通过与细胞表面的受体结合达到预防猪伪狂犬病病毒变异株病毒XJ5的感染作用。
5、应用槐耳多糖浓度在25~200 μg/ml，通过影响病毒的吸附作用起到抵抗病毒感染的作用。
6、应用槐耳多糖浓度在25~50 μg/ml，影响病毒的入胞作用。
7、应用槐耳多糖浓度在25~200 μg/ml，影响病毒的复制作用。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为在显微镜下，观察槐耳多糖对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5感染PK-15细胞引起的细胞病变的影响。
图2为槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5感染的影响；
其中，A为Western blot测定槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5感染的影响；B为TCID50测定槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5感染的影响；C为免疫荧光抗体测定（IFA）槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5感染的影响。
图3为槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5吸附和入胞的影响；
图中A为Western blot测定槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5吸附和入胞的影响；B为TCID50测定槐耳多糖在PK-15 细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5吸附和入胞的影响；C为免疫荧光抗体测定（IFA）槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5吸附和入胞的影响。
图4为槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5吸附的影响；
图中，A为Western blot测定槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5吸附的影响；B为TCID50测定槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5吸附的影响；C为免疫荧光抗体测定（IFA）槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5吸附的影响。
图5为槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5入胞的影响；
图中A为Western blot测定槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒入胞的影响；B为图5A结果灰度分析所得结果；C为TCID50测定槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5入胞的影响；D为免疫荧光抗体测定（IFA）槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒变异株XJ5入胞的影响。
图6为Western blot测定槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病变异株XJ5病毒复制的影响；Western blot测定槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒感染后4h的影响。
图7为Western blot测定槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病变异株XJ5病毒复制的影响；Western blot测定槐耳多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒感染后6h的影响。
图8为Western blot检测槐耳多糖在PK-15细胞上可能与细胞表面受体结合起到预防猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株感染作用。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
将从本实验室中复苏的PK-15细胞使用含5%胎牛血清的DMEM至于37℃5%CO2培养箱培养，并传代至第三代后，以每孔5×105个细胞的浓度均匀铺于6孔板中，待培养至对数生长期，约16h后，细胞长至每孔约70%~75%体积时，弃去含有5%胎牛血清的DMEM，PBS缓冲液洗三遍，最后一遍吸尽剩余PBS，加空DMEM 1ml并将溶解的槐耳多糖稀释至25μg、50μg、100μg、 200μg，将PRV XJ5（MOI=0.1）与细胞共同孵育1h，1h后换成含有2%胎牛血清的DMEM溶液2ml，并加入PBS缓冲液或相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg），分别于12h、24h在显微镜下观察细胞形态和病理变化。根据图1结果所示，槐耳多糖可以减少PRV XJ5引起的细胞病变。表明槐耳多糖可减少变异型猪伪狂犬病病毒XJ5的感染。
实施例2
（1）Western blot检测槐耳多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株感染的活性：
PK-15细胞使用胰酶消化后用体积浓度5%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期后（约17h），用PBS缓冲液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清的DMEM稀释到相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg）和猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株，与PK-15细胞37℃，5% CO2培养箱孵育1h后，换成2mL含有2%胎牛血清的DMEM营养液维持且有相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg）存在，放37℃，5%CO2培养箱中培养，感染24h后，收集细胞上清（1mL放-70℃保存为后期TCID50实验做准备），用PBS缓冲液洗三遍后吸尽残液，加入2×蛋白loading收集细胞样品，在金属浴96℃煮15min，进行Western blot检测。发现槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒gB蛋白的表达（图2-A），初步证实槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的感染。
（2）TCID50测定槐耳多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株感染的活性：
Vero细胞胰酶消化后用体积浓度8%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以2×103/孔的浓度滴加到96孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期（约16h）后，用PBS缓冲液洗三遍，吸尽残余液体后，加入用无血清的DMEM稀释的不同浓度的病毒液，每个浓度做4个重复，感染1.5h后，换成含2%胎牛血清的DMEM维持，待感染72h后观察细胞病变的情况。发现槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株感染上清的病毒滴度（图2-B），证实槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的感染。
（3）Indirect Immunofluorescence Assay（IFA）测定槐耳多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的感染的活性：
PK-15细胞使用胰酶消化后用体积浓度10%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期后（约17h），用PBS缓冲液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清的DMEM稀释到相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg）和猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株，与PK-15细胞37℃，5%CO2培养箱孵育1h后，换成2mL含有2%胎牛血清的DMEM营养液维持且有相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg）存在，放37℃，5%CO2培养箱中培养，感染24h后，弃去上清，使用PBS缓冲液洗三遍，最后一遍吸尽残留的PBS，加入可覆盖住细胞表面即可的4%多聚甲醛至于37℃固定15分钟，随后使用0.1% TritonX-100 穿透细胞 10分钟，再用PBS缓冲液洗三遍，最后一遍吸干尽，加入5%BSA 封闭液37℃ 1.5h 或者 4℃过夜后用PBS洗三遍，最后一遍吸干尽，与一抗PRV猪阳性血清1：200稀释共同置于37℃孵育2h，使用PBST洗三遍，最后一遍吸干尽，在避光条件下与1:200稀释的二抗山羊抗猪的IgG共同在37℃下孵育 1h，避光条件下，DAPI染色5min，PBST洗三遍，最后一遍吸干尽，置于荧光显微镜下观察细胞形态和病变，（图2-C），证实槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的感染。
实施例3
（1）Western blot检测槐耳多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株吸附和入胞：
PK-15细胞使用胰酶消化后用体积浓度5%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5% CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期后（约17h），用4℃ PBS缓冲液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清4℃的DMEM稀释到相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg）和猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株，与PK-15细胞4℃孵育1h后，换成2mL含有2%胎牛血清的DMEM营养液置于37℃，5%CO2培养箱孵育1h且有相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg）存在，放37℃，5%CO2培养箱中培养，用柠檬酸洗三遍后，用PBS缓冲液洗三遍，吸尽残留液体，换成含2%胎牛血清的DMEM，感染24h后，收集细胞上清（1mL放-70℃保存为后期TCID50实验做准备），用PBS缓冲液清洗细胞三遍后吸尽残液，加入2×蛋白loading收集细胞样品，在金属浴96℃煮15min，进行Westernblot检测。发现槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5 gB蛋白的表达（图3-A），证实槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的吸附和入胞。
（2）TCID50测定槐耳多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株吸附和入胞：
Vero细胞胰酶消化后用体积浓度8%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以2×103/孔的浓度滴加到96孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期（约16h）后，用PBS缓冲液洗三遍，吸尽残余液体后，加入用无血清的DMEM稀释的不同浓度的病毒液，每个浓度做4个重复，感染1.5h后，换成含2%胎牛血清的DMEM维持，待感染72h后观察细胞病变的情况。发现槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株感染上清的病毒滴度（图3-B），证实槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的吸附和入胞。
（3）Indirect Immunofluorescence Assay（IFA）测定槐耳多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株吸附和入胞：
PK-15细胞使用胰酶消化后用体积浓度10%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期后（约17h），用4℃PBS缓冲液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清4℃的DMEM稀释到相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg）和猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株，与PK-15细胞4℃孵育1h后，换成2mL含有2%胎牛血清的DMEM营养液置于37℃，5%CO2培养箱孵育1h且有相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg）存在，放37℃，5% CO2培养箱中培养，用柠檬酸洗三遍后，用PBS缓冲液洗三遍，吸尽残留液体，换成含2%胎牛血清的DMEM，感染24h后，弃去上清，使用PBS缓冲液洗三遍，最后一遍吸尽残留的PBS缓冲液，加入可覆盖住细胞表面即可的4%多聚甲醛至于37℃固定15分钟，随后使用0.1% TritonX-100穿透细胞 10分钟，再用PBS缓冲液洗三遍，最后一遍吸干尽，加入5% BSA 封闭液37℃ 1.5h 或者 4℃过夜后用PBS缓冲液洗三遍，最后一遍吸干尽，与一抗PRV猪阳性血清1:200稀释共同置于37℃孵育2h，使用PBST洗三遍，最后一遍吸干尽，在避光条件下与1:200稀释的二抗山羊抗猪的IgG共同在37℃下孵育 1h，避光条件下，DAPI染色5min，PBST洗三遍，最后一遍吸干尽，置于荧光显微镜下观察细胞形态和病变（图3-C），证实槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的吸附和入胞。
实施例4
（1）Western blot检测槐耳多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株吸附：
PK-15细胞使用胰酶消化后用体积浓度5%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5% CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期后（约17h），用4℃ PBS缓冲液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清4℃的DMEM稀释到相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg）和猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株，与PK-15细胞4℃孵育1h后，换成2mL含有2%胎牛血清的DMEM营养液置于37℃，5% CO2培养箱培养，感染24h后，收集细胞上清（1mL放-70℃保存为后期TCID50实验做准备），用PBS缓冲液清洗细胞三遍后吸尽残液，加入2×蛋白loading收集细胞样品，在金属浴96℃煮15min，进行Western blot检测。发现槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5 gB蛋白的表达（图4-A），证实槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的吸附。
（2）TCID50测定槐耳多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株吸附：
Vero细胞胰酶消化后用体积浓度8%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以2×103/孔的浓度滴加到96孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期（约16h）后，用PBS缓冲液洗三遍，吸尽残余液体后，加入用无血清的DMEM稀释的不同浓度的病毒液，每个浓度做4个重复，感染1.5h后，换成含2%胎牛血清的DMEM维持，待感染72h后观察细胞病变的情况。发现槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株感染上清的病毒滴度（图4-B），证实槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的吸附。
（3）Indirect Immunofluorescence Assay（IFA）测定槐耳多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株吸附：
PK-15细胞使用胰酶消化后用体积浓度5%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期后（约17h），用4℃PBS缓冲液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS后，加入用1mL无血清4℃的DMEM稀释到相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg）和猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株，与PK-15细胞4℃孵育1h后，换成2mL含有2%胎牛血清的DMEM营养液置于37℃，5%CO2培养箱培养，感染24h后，用PBS缓冲液洗三遍后吸尽残液，加入可覆盖住细胞表面即可的4%多聚甲醛至于37℃固定15分钟，随后使用0.1% TritonX-100穿透细胞 10分钟，再用PBS缓冲液洗三遍，最后一遍吸干尽，加入5%BSA 封闭液37℃ 1.5h 或者 4℃过夜后用PBS缓冲液洗三遍，最后一遍吸干尽，与一抗PRV猪阳性血清1：200稀释共同置于37℃孵育2h，使用PBST洗三遍，最后一遍吸干尽，在避光条件下与1:200稀释的二抗山羊抗猪的IgG共同在37℃下孵育 1h，避光条件下，DAPI染色5min，PBST洗三遍，最后一遍吸干净，置于荧光显微镜下观察细胞形态和病变（图4-C），证实槐耳多糖降低猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的吸附。
实施例5
（1）Western blot检测槐耳多糖在PK-15细胞上影响猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株入胞。
PK-15细胞使用胰酶消化后用体积浓度10%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5% CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期后（约17h），用4℃ PBS缓冲液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS缓冲液后，加入1ml无血清4℃DMEM和猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株，与PK-15细胞4℃孵育1h后，用PBS洗三遍，加入用1mL无血清的DMEM稀释到相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg）与PK-15细胞37℃，5% CO2孵育1h后，用柠檬酸洗三遍后用PBS缓冲液洗三遍，吸尽残液，换成2mL含有2%胎牛血清的DMEM营养液置于37℃，5% CO2培养箱培养，感染24h后，收集细胞上清（1mL放-70℃保存为后期TCID50实验做准备），加入2×蛋白loading收集细胞样品，在金属浴96℃煮15min，进行Westernblot检测。发现槐耳多糖不影响猪伪狂犬病病毒变异株XJ5 gB蛋白的表达（图5-A），且对图5-A所得的结果进行灰度分析（图5-B），证实槐耳多糖在25μg/ml和50μg/ml影响猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的入胞。
（2）TCID50测定槐耳多糖在PK-15细胞上影响猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株入胞
Vero细胞胰酶消化后用体积浓度8%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以2×103/孔的浓度滴加到96孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期（约16h）后，用PBS缓冲液洗三遍，吸尽残余液体后，加入用无血清的DMEM稀释的不同浓度的病毒液，每个浓度做4个重复，感染1.5h后，换成含2%胎牛血清的DMEM维持，待感染72h后观察细胞病变的情况。发现槐耳多糖在25μg/ml和50μg/ml影响猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株感染上清的病毒滴度（图5-C），证实槐耳多糖在25μg/ml和50μg/ml影响猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的入胞。
(3）Indirect Immunofluorescence Assay（IFA）测定槐耳多糖在PK-15细胞上不影响猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株入胞
PK-15细胞使用胰酶消化后用体积浓度10%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5%CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期后（约17h），用4℃ PBS缓冲液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS缓冲液后，加入1ml无血清4℃的DMEM和猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株，与PK-15细胞4℃孵育1h后，用PBS洗三遍，加入用1mL无血清的DMEM稀释到相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg）与PK-15细胞37℃，5% CO2孵育1h后，用柠檬酸洗三遍后用PBS缓冲液洗三遍，吸尽残液，换成2mL含有2%胎牛血清的DMEM营养液置于37℃，5% CO2培养箱培养，感染24h后，弃去上清，使用PBS缓冲液洗三遍，最后一遍吸尽残留的PBS缓冲液，加入可覆盖住细胞表面即可的4%多聚甲醛至于37℃固定15分钟，随后使用0.1% TritonX-100 穿透细胞 10分钟，再用PBS缓冲液洗三遍，最后一遍吸干尽，加入5% BSA 封闭液37℃ 1.5h 或者 4℃过夜后用PBS缓冲液洗三遍，最后一遍吸干尽，与一抗PRV猪阳性血清1:200稀释共同置于37℃孵育2h，使用PBST洗三遍，最后一遍吸干尽，在避光条件下与1:200稀释的二抗山羊抗猪的IgG共同在37℃下孵育 1h，避光条件下，DAPI染色5min，PBST洗三遍，最后一遍吸干尽，置于荧光显微镜下观察细胞形态和病变（图5-D）,证实槐耳多糖在25μg/ml和50μg/ml影响猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的入胞。
实施例6
PK-15细胞使用胰酶消化后用体积浓度10%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5% CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期后（约17h），用PBS缓冲液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS缓冲液后，加入用1mL无血清的DMEM并感染猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株，置于37℃，5% CO2培养箱中孵育1h后，用PBS缓冲液洗三遍并将残液吸尽，加入含2%胎牛血清的DMEM 2mL并有相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg）存在，在感染后4h、6h收取细胞样品，然后进行Western blot检测。结果如图6和图7所示，发现槐耳多糖影响猪伪狂犬病病毒gB蛋白的表达，证实槐耳多糖影响猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株的复制。
实施例7
（1）Western blot检测槐耳多糖在PK-15细胞上可能与细胞表面受体结合起到预防猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株感染作用
PK-15细胞使用胰酶消化后用体积浓度10%胎牛血清的DMEM营养液稀释，以5×105/孔的浓度滴加到6孔板，置于37℃，5% CO2培养箱中待细胞贴壁成单层处于对数生长期后（约17h），用PBS缓冲液将细胞洗三遍，吸尽残留PBS缓冲液后，加入空的DMEM 1mL并有相应浓度的槐耳多糖（25μg、50μg、100μg、200μg），置于37℃，5%CO2培养箱中培养，1h后感染猪伪狂犬病病毒变异株XJ5株，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育1h后，换成含有2%胎牛血清的DMEM 2ml，感染24h后收取细胞样品，进行Western blot检测。结果如图8所示，发现槐耳多糖抑制猪伪狂犬病病毒gB蛋白的表达，证实槐耳多糖可能与细胞表面受体结合起到预防作用。
根据槐耳多糖的毒性和相关性能，优选200μg/ml为优选的用量。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.槐耳多糖在制备抗猪伪狂犬病病毒感染制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗猪伪狂犬病病毒感染制剂为抑制猪伪狂犬病病毒吸附和/或抑制猪伪狂犬病病毒入胞和/或抑制猪伪狂犬病病毒复制的制剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述制剂为药物制剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述制剂为消毒剂。
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