CN1136390A - 大量生产属于桉树属木本植物的无性系植物幼苗的方法 - Google Patents
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Abstract
一种大量生产桉树属木本植物无性繁殖系植物幼苗的方法，该方法由几步骤组成：将由无菌培养其器官诱导出大量聚花芽中得到的芽或由其种子无菌培养的芽移植到用含有无机盐而不含任何碳源的人工液体培养基浸润的多孔培养基载体上，并在存在湿度和二氧化碳气体的照射条件下，使其非无菌生根并水土适应。
Description
本发明涉及一种通过组织培养大量生产属于桉树属木本植物的幼苗进行造林的方法。可应用于林业，生物，组织培养，农业等等。
桉树如柠檬桉(下文简称“E.citriodora”)是起源于澳大利亚并属于桃金娘科的木本植物。它们主要被用作纸浆原材，取火木材和建筑材料。已知有600多种桉树属木本植物品种，其中的一些价值很高，因为它们有极好的基本密度和纸浆产量，而这些是生产纸浆和纸的重要因素。也就是说，属于桉树属的木本植物是很好的纸浆原材和森林资源，具有植树造林价值。因此在欧洲，南美和东南亚，这些树已被大量造林。
在那些属于桉树属木本植物中，例如巨桉和赤桉，可容易地通过剪枝繁殖而不需任何设备。因此在巴西和泰国，通过剪枝、增大产量和改进树的质量已生产了有极好特性的这些树的无性系作为造林的植物幼苗，但是也有一些品种很难通过剪枝繁殖，这些品种的例子包括蓝桉(下文简单地称作“E.globulus”)，直杆蓝桉，bi-costata桉和柠檬桉，它们是极好的纸浆原材。因此应当通过种子繁殖进行增殖，应用树苗来造林。
在这种情况下，植物幼苗在遗传上具有较少一致性，这导致个体间生长差异，作为结果引发出的问题是：(1)总体上只能得到较低的产量，(2)很难估计产量，(3)在生长等方面有极好特性的无性繁殖系，如果有的话，不能繁殖。
因此在用剪枝很难繁殖的这些物种中，急需探索一种具有极好遗传性并有同源特征的无性系繁殖方法。和剪枝方法一样，一般都知道所谓的组织培养法可作为树无性系繁殖的方法，其中植物由植物组织器官中再生。除上文提到的桉树外，剪枝繁殖主要被广泛用于针叶树，如雪松，因为这种繁殖以低成本就易实现。
另一方面，组织培养方法具有优点，因为在重复植物再生前，通过由植物组织器官得到的组织的继代培养，可在有限的地域内实现大量繁殖。因此，最近几年，该方法被积极地研究。现在，通过组织培养的无性繁殖系的繁殖方法已被应用到兰花，蔬菜等，一些品种已经投入实际应用。近来也做了努力将这种方法应用于树，据报导有些植物，例如麻栎(Quercus acutissima Carr)和白桦(Bet-ula platyphylla)，Sukatchev Var.，白桦(japonica Hara.)由此成功再生(Propagation and Breeding of Arboreous Plant，Nogyo Tosho，pp.115-129，pp.157-165，1989)。
然而，在这些树品种中，植物只能在现期由植物器官再生。也就是说，在实现大量生产体系之前还有很长的路要走。然而在这里应该指出，除了通过组织培养的无性系繁殖方法外没有方法能提供难以用剪枝繁殖的树的造林用植物幼苗。
通过接着原代培养的组织培养生产植物幼苗的过程包括四个步骤，即芽的繁殖，芽的生长，生根，和水土适应。除外情况是，对于一些植物(例如，烟草，胡罗卜，秋海棠，Saintpaulia)可以在一个步骤中简单实现这些过程，其中繁殖，生长和生根在同种培养基中进行，不需要移植。
另一方面，为生产许多其它植物的，特别是树的植物幼苗，上面提到的每一步骤应该完全实施。而且，每一步骤的条件(例如繁殖的条件)，在品种和品种间经常是不同的，这一点是公认的。所有步骤中，大量生产植物幼苗中的最大障碍是由生根至水土适应阶段，其中生长的芽已经生根，并且幼小植物使它们自身适应外部的环境。这些步骤是复杂和繁琐的并且需要特定设备。因此，实践中通过组织培养大量生产用于造林的植物幼苗的关键点，在于怎样容易且高效地使其生根并水土适应。从这一点出发，已经讨论了通过直接生根方法节省劳力和费用，其中生根和水土适应作为一步来完成。但是，在植物组织培养基中使其生根，也作为各种细菌营养源的蔗糖通常被用作碳源。因此，培养物应由熟练技术人员无菌制备。而且因此需要劳力和设备。偶尔当这些组织是非无菌培养，则产生问题：植物由于细菌污染而枯萎至死。因此不能得到健壮的植物幼苗。
而且在生根培养物中使用了用琼脂或gellan gum固化的培养基，生根步骤后需要通过冲洗去除这种固化剂。这一操作引起了其它问题，根须因此被损伤，导致成活植物幼苗的比例降低，同时需要更多的劳动(量)。特别是以纸浆原材为生产目的的造林，需要马上提供几万至几百万植物幼苗，尽管植物幼苗数目根据要被种植的土地，造林规模等等需要大的改变。为了通过组织培养方法提供植物幼苗用于造林，因而希望迅速建立植物幼苗的大规模生产体系，它能实现极高的繁殖效率，涉及较少步骤并在此方法中不需要繁琐程序。
在这些背景下，本发明人对属于桉树属木本植物的无性系植物幼苗的大量生产方法进行了深入细致的研究。作为结果，本发明人发现通过由属于桉树属木本植物的器官开始，培养，诱生聚花芽(multiple shoots)，并且重复繁殖，在一步中非无菌条件下使其生根并水土适应而不加任何碳源如蔗糖，因而使植物(即组织培养产物)通过光合作用自己提供所需碳原子，而且使用了能使培养产物与培养基载体一起移植的多孔培养基载体(porous medium support)，可实现想要实现的大量生产。本发明是以这一发现为基础完成的。
因此，本发明的一个目的是提供一种属于桉树属木本植物无性系植物幼苗大量生产的方法，它可实现极高繁殖效率，包括较少步骤和不需要繁锁程序。
本发明的另一目的是提供一种属于桉树属木本植物无性系植物幼苗的简便的大量生产法，而常规方法中要求的所有生根，生根后洗去培养基，水土适应，移植步骤和每一步骤的麻烦过程，在不需要任何特殊设备的情况下可被简化或省略。
本发明的这些和其它目的可以通过属桉树属木本植物的无性系植物幼苗的大量生产方法来实现，其中所述方法包括以下步骤：将通过无菌培养其器官产生的大量聚花芽的芽，或者由其种子进行无菌培养的芽，移植到多孔培养基载体上，所述可渗透培养基载体用含有无机盐且不含任何碳源如蔗糖的人工液体培养基浸润，在存在湿度和二氧化碳气体条件下照射，使其非无菌生根和水土适应。
现在将更详细地描述本发明。
首先将要说明怎样由属于桉树属木本植物的器官得到芽。在本发明中，可用常规方法得到芽。例如当使用户外培养或生长的桉树属木本植物个体为起始原料时，由其枝干得到含有腋生芽的组织用杀菌剂如安替佛民(antiformin)消毒。然后接种到固化培养基中(例如，Murashige-Skoog培养基(1962)，T.Murashige和F.Skoog，Physiol.Plant，15：431-497，下文中将称为“MS培养基”)，在照射条件下培养以使腋生芽生长。接着将如此生长的腋生芽移植到含有植物生长调节剂，例如0.1至1mg/l 6-苄基氨基嘌呤(一种细胞分裂素)的固体培养基中(例如，MS培养基)，在其中培养诱导生成聚花芽。或者，摇动下在液体培养基(例如，含有0.1至1mg/l 6-苄基氨基嘌呤的MS培养基)中培养如此生长的腋生芽以诱导形成大量分生组织(即芽原基)，该组织通过移植到例如，含0.1至1mg/l 6-苄基氨基嘌呤的固体培养基中并静态培养，能分化并生成芽。当使用种子为起始材料时，将其接种到合适的固体培养基上，如MS培养基，然后在照射的条件下培养使其萌芽而得到芽株。这样得到的芽上取下芽尖或含芽尖的组织。通过使用这一组织，用上文描述的相同方法可以生成大量的聚花芽。
下面将详细说明本发明的生根/水土适应步骤。将如此得到的芽移植到多孔培养基载体上，该多孔培养基载体被含有无机盐且不含任何碳源如蔗糖的人工液体培养基浸润，然后可在其中进行生根和水土适应。
植物固有地不需要蔗糖作为碳源，因为它们独立地光合成它。但是，培养组织或培养细胞一般具有较差的或不具有光合成能力。因此向培养基中加入蔗糖作为所需的碳源以生成在这种组织培养方法中细胞生长和代谢所必需的碳骨架和能量。然而在本发明中通过提供二氧化碳(CO2)气体促进了培养组织的光合成，因此不需要蔗糖作碳源。也就是说，本发明的生根/水土适应步骤是在只含有无机盐和优选至少一种维生素的液体培养基中进行的。例如，用含主要基本元素(H，O，N，P，K，S，Ca和Mg)试剂和含7种微量元素(Fe，Mn，Cu，Zn，Mo，B和Cl)的试剂一起适当制备人工液体培养基。在本发明中也能使用由已知成份(例如，MS培养基，Gamborg B5培养基)组成的培养基或将这些培养基稀释2倍制得的培养基。
无机盐的例子包括NH4NO3，(NH4)2SO4，KNO3，KCl，K2SO4，CaCl2·2H2O，Ca(NO3)2·4H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4，NaH2PO4·H2O，NaH2PO4·2H2O，FeSO4·7H2O，Na2-EDTA，FeNa-EDTA，Fe-EDTA，MnSO4·H2O，MnSO4·4H2O，Na2SO4，ZnSO4·4H2O，ZnSO4·7H2O，CoCl2·6H2O，CuSO4·5H2O，Na2MoO4·2H2O，KI，H3BO3，和MoO3。(EDTA为乙二胺四乙酸)
维生素的例子包括烟酸，盐酸吡哆素，盐酸硫胺素，肌醇，L-甘氨酸，L-谷氨酰胺，L-天冬酰胺，L-精氨酸，和L-蛋氨酸。
而且下面给出不含蔗糖的MS培养基和Gamborg B5培养基的组成。
培养基组成(mg/l)成份 MS培养基 Gamborg B5培养基NH4NO3 1,650 0(NH4)2SO4 0 134KNO3 1,900 3,000CaCl2·2H2O 440 150MgSO4·7H2O 370 250KH2PO4 170 0NaH2PO4·2H2O 0 169.6FeSO4·7H2O 27.8 0Na2-EDTA 37.3 0FeNa-EDTA 0 40MnSO4·4H2O 22.3 13.2ZnSO4·4H2O 8.6 0ZnSO4·7H2O 0 2CoCl2·6H2O 0.025 0.025CuSO4·5H2O 0.025 0.025Na2MoO4·2H2O 0.25 0.25KI 0.83 0.75H3BO3 6.2 3烟酸 0.5 1盐酸吡哆素 0.5 1盐酸硫胺素 0.1 10肌醇 100 100L-甘氨酸 2 0
在本发明中，由于不需要在培养基中有蔗糖为碳源，因此不向其中加入蔗糖。作为结果，有可能使用本领域通常使用的工具进行非无菌生根和水土适应。本发明生根步骤使用生长素作为植物生长调节剂的例子包括吲哚丁酸(IBA)，萘乙酸，吲哚乙酸(IAA)和二氯吲哚乙酸。为了促使生根，以0.01至10mg/l的量向培养基中加入这种物质。
用含有无机盐的人工液体培养基浸润的多孔培养基载体的例子包括渣棉，果肉，酚醛树脂，泥炭苔藓，蛭石和陶瓷纤维。
在植物的组织培养中，一般使用琼脂，gellan gum等类似物固化的培养基。但在这些培养基中只能得到非常不理想的根生成比。而且由于这些培养基没有中空，其中，属于桉树属木本植物的小根的生成显著低劣。而且，当这样生成的植物幼苗被移植入小盆或类似器皿中进行水土适应时，需要洗掉固化剂如琼脂，而这一程序会损伤根茎。作为结果，在这一水土适应过程中许多植物枯萎而死。而另一方面，本发明生根/水土适应步骤中，在供有CO2气体的多孔培养基载体上培养组织，不加入任何蔗糖，因此实现了光自养。所以生成了强健的根和叶上的正常气孔。而且，这样得到的植物幼苗可处理成所谓的插入式植物幼苗，它可与培养基载体一起被移植。因此这些植物幼苗可容易地移植到小盆或类似器皿中。而且这样得到的无性系植物幼苗能极好生长，最后可得到坚硬的桉树属木本植物的无性繁殖系植物幼苗。
优选生根/水土适应步骤是在照明度为1000至6000勒克司的照射条件下进行的。当照明度小于1000勒克司时，光合成不能充分进行，并且发现有胼胝体生成。另一方面，当照明度超过6000勒克司时，生长受到抑制，另外增加了经济损失。另外照射优选通过16小时光照期和8小时黑暗期重复进行。因为光合成是在光照期进行的，因此优选只在光照期将CO2气体浓度调节在下述水平上。因此可加速光合成，并经济地得到壮实的植物幼苗。也优选控制温度至22至26℃，因为桉树属木本植物喜好温和气候，并且在18至28℃温度范围内生长良好。
优选控制CO2气体浓度至200至3500ppm。当CO2气体浓度低于200ppm时，没有充分的光合作用进行。另一方面，当CO2气体浓度超过3500ppm，不能再提高光合成水平。偶然，当在生根一步中使用了密封培养容器，随着培养组织生长，容器中CO2气体浓度低于100ppm或更少，将导致降低光合成能力。因此，通常在称为异养生物条件下进行该步骤，如同时加入碳源如蔗糖。
在生根/水土适应步骤中，优选调节湿度至70至100％高水平。当湿度低于70％时，由于旺盛的蒸腾作用，植物常常枯萎至死。它可在70％或更高湿度下很好生长。
通过下面的实施例可更详细地解释本发明，但应该认为本发明并不局限于此。
实施例1
从柠檬桉成树(8年)上取当年生成的枝，并由其制备含腋生芽的组织。用1％有效氯气浓度进行消毒处理15分钟后，将这些组织接种到含0.1mg/l 6-苄基氨基嘌呤(BAP)的MS固体培养基中(ge-llan gum＝0.25％)。大约一个月后，腋生芽长长，且在一些组织中，长出了新的腋生芽并长长。
将如此长长的这些腋生芽接种到含0.2mg/l BAP的MS固体培养基中(见上述)，然后，大约一个月后，生成了聚花芽。以一个月的间期继代培养繁殖这样生成的聚花芽。同时这些聚花芽的每一芽继续长长。接连剪下这些长长的芽，并种植到用液体培养基湿润的渣棉块上，所述液体培养基是用于生根和水土适应的，通过将不含蔗糖的MS培养基稀释2倍，并向其中加入0，0.01，0.02或0.2mg/lIBA而制得的。
在大约2000勒克司(光照期：每天16小时)的照射，湿度为80±10％，温度为24±1℃的条件下，同时调节CO2气体浓度至300±100ppm，非无菌条件进行生根和水土适应。为了对照，使用含0.02mg/l IBA作为植物生长调节剂，除用培养基载体中的gellan gum代替渣棉，或除了不调节CO2气体浓度外，用相同方法进行了该过程。
大约2至3星期后，在其中使用了渣棉并调节了CO2气体浓度的试验地片，发现生根的比例至少为90％。特别是，在其中使用了含0.1至0.2mg/l IBA液体培养基的地片得到了形态极好的植物幼苗。大约4周后(从为生根和适应水土而培植芽算起)，出现根生成的植物幼苗与培养基载体一起移植到装有土壤的苗圃小盆中，用常规方法使其在温室中生长。大约1个月后，这些植物幼苗长至15cm高，可用于造林。
结果可见下面表1。
表1
植物小苗成活比例IBA 培养基载体 被试验外 生根的植 成活的植物
植体数目 物幼苗数 幼苗比例**(mg/l)
(％)0 渣棉 50 36 720.01 渣棉 50 45 900.02 渣棉 50 49 980.2 渣棉 50 48 960.02* 渣棉 50 0 00.02 gellan gum 50 6 12*：没有调节CO2气体浓度
如表1所示，在其中调节CO2气体浓度且使用渣棉的被试地块中，无论加入IBA与否，都可得到超过70％的存活植物幼苗的最终比例。相反，在使用gellan gum培养基的对比地块中，只能得到大约10％的低的成活植物幼苗比例。而且，在其中未调节CO2气体浓度的对照地块，发现没有根生成，即成活植物幼苗比例为0％。这里所用的术语“成活植物幼苗比例”是指在生根/水土适应这步中，在根生成后移植到苗圃小盆，并使其在温室中正常生长的植物幼苗(表1中称为“生根植物幼苗”)与用于生根/水土适应步骤的芽(表1中称为“被试验外植体”)之间的比率。
当如此再生用于造林的植物幼苗在户外种植时，与籽苗相比，它们更均匀而茁壮地成长。
实施例2
将长长的芽从按照实施例1相同的方法得到的聚花芽上剪切下来，并接种到用不含蔗糖的MS培养基浸润的果肉上，所述MS培养基已被稀释2倍，含有0.2mg/l IBA。
然后在大约2000勒克司的照射条件下(光照时间：每天16小时)，并且湿度80±10％，同时调节CO2气体浓度为300±100ppm，在24±1℃温度下非无菌进行生根和水土适应。作为结果，大约2至3周后发现根生成。生根/水土适应步骤开始后大约4周，这些生根的植物幼苗和培养基载体一起移植到苗圃小盆中以常规方式生长。一个月后，得到15cm高用于造林的植物幼苗。在这种情况下，可得到高达95％的成活植物幼苗比例。
实施例3
从蓝桉成树(6年)上取当年生成的枝，并由其制备含腋生芽的组织。用有效氯气浓度为1％进行消毒处理20分钟后，将这些组织接种到含0.1mg/l BAP的MS固体培养基中(琼脂＝0.85％)。然后大约一个月后，得到长长的腋生芽。
将这些腋生芽接种到含0.1mg/l BAP的MS固体培养基中(gell-an gum＝0.25％)。大约一个月后，由这些芽的基部生出了新鲜的芽，因而形成聚花芽。然后将这样生成的聚花芽移植到含0.2至1.0mg/l N6-呋喃甲基腺嘌呤的MS固体培养基中(见上文)。以一个月的间隔断代培养繁殖，同时这些聚花芽的每一芽继续长长。随后，剪切下这些长长的芽，并在泡沫酚醛树脂块上(OASISTM，由Ni-ppon Soda Co.Ltd.制造)种植。所述酚醛树脂块被向用于生根和水土适应的四倍稀释的不含蔗糖的MS培养基中加入1.0mg/l IBA，0.2，0.5或1.0mg/l 5，6-二氯吲哚乙酸(Cl2-IAA)；或10mg/l IAA而制得的液体培养基润湿而成。
在大约5000勒克司照射下(光照期：每天16小时)，湿度为80％或更高，同时调节CO2气体浓度至300，1000或3000±100ppm，在24±1℃温度下非无菌进行生根和水土适应。为了对照，除不调节CO2气体浓度外，用含有0.2或0.5mg/l Cl2-IAA作为植物生长调节剂的培养基以相同方法进行这些程序。
大约4周后，除对照地块以外的植物芽都生了根。然后将这些植物幼苗与培养基载体一起被移植到含土壤的苗圃盒中并以常规方式在温室中生长，一个半月后，其长至20cm高可用于造林。
下面的表2给出结果。成活植物幼苗比例的含义与实施例1相同。
表2
成活植物幼苗比例植物生长调 CO2 被试外 生根植 成活植物节剂 浓度 植体数 物幼苗数 幼苗比例**(mg/l) (ppm) (％)IBA 1.0 300 36 13 36IBA 1.0 1000 36 18 50IBA 1.0 3000 36 15 42Cl2-IAA 0.2 300 36 19 53Cl2-IAA 0.2 1000 36 33 92Cl2-IAA 0.2 3000 36 28 78Cl2-IAA 0.5 300 36 18 50Cl2-IAA 0.5 1000 36 35 97Cl2-IAA 0.5 3000 36 26 72Cl2-IAA 1.0 300 36 14 39Cl2-IAA 1.0 1000 36 24 67Cl2-IAA 1.0 3000 36 20 56Cl2-IAA 0.2 * 36 0 0Cl2-IAA 0.5 * 36 0 0IAA 10 300 36 21 58IAA 10 1000 36 27 75IAA 10 3000 36 22 61*：没有调节CO2气体浓度
从表2可清楚地看出，在CO2气体浓度被调节的试验地块可得到超过35％的成活植物幼苗比例。与之相反，与上面提到的实施例1相似，在二氧化碳浓度未被调节的对照地块，没有发现出根(即成活植物幼苗比例＝0％)。
当在户外种植这样再生的用于造林的植物幼苗时，与籽苗相比，它们更均匀、茁壮地成长。
如上文所讨论的，本发明提供了一种非常方便的桉树属树无性繁殖系植物幼苗的生产方法，简化或省略了常规方法中全部需要做的生根，生根后洗去培养基，水土适应，移植步骤和每一步骤中存在的繁锁程序，而不需要任何特定设备。而且，在本发明中，出现根生成的植物幼苗可容易地与培养基载体一起被移植到苗圃小盆中，在合适的土壤中用与籽苗相同的方法(培养)生长。因此，能大量提供具有极好性能的纸浆原材，使本发明方法从造林角度看具有很高价值。
Claims (3)
1、一种大量生产属于桉树属木本植物无性繁植系植物幼苗的方法，其中所述方法包括下面步骤：
将由无菌培养其器官诱导的大量聚花芽中得到的芽，或由其种子无菌培养的芽，移植到用含有无机盐而不含任何碳源的人工液体培养基浸润的多孔培养基载体上，并且
在存在湿度和二氧化碳气体下照射，使其非无菌生根并水土适应。
2、权利要求1的方法，其中所述多孔培养基载体选自渣棉，酚醛树脂，果肉，炭碳苔藓，蛭石和陶瓷纤维组成的组。
3、权利要求1或2的方法，其中所述生根和水土适应是在湿度70至100％，二氧化碳气体浓度为200至3500ppm下进行的。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20040728 Termination date: 20100120 |