CN113621521A - 一种同时具有抗氧化、抗发炎功效及促进胆固醇抑制剂生成的红曲菌培养方法 - Google Patents

一种同时具有抗氧化、抗发炎功效及促进胆固醇抑制剂生成的红曲菌培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时具有抗氧化、抗发炎功效及促进胆固醇抑制剂生成的红曲菌培养方法，将甘草及红曲菌以液态培养的方式于室温静置培养55‑65天后，收取培养液，即可获得具有多功效的发酵产物。本发明的甘草红曲菌发酵产物，具有良好的去除DPPH自由基的能力及去除ATBS自由基的抗氧化能力。在浓度为0.5mg/mL的条件下，相对于中药对照组，第60天的发酵产物能有效抑制约22％一氧化氮的产生，达到抗发炎的效果，并且能有效提升总酚含量达23mg/g‑发酵物，此外，第60天的发酵产物能产生22μg/mL‑培养液的胆固醇抑制剂，相较于传统利用白米培养的发酵产物，第60天的胆固醇抑制剂提升约42倍，而甘草红曲菌发酵产物还具有多种化合物。

Description

一种同时具有抗氧化、抗发炎功效及促进胆固醇抑制剂生成 的红曲菌培养方法
技术领域
本发明涉及一种同时具有抗氧化、抗发炎功效及促进胆固醇抑制剂(MonacolinK)生成的红曲菌培养方法。
背景技术
红曲菌具有多种不同的代谢产物及酵素，例如胆固醇合成抑制剂(monacolin K)，γ-氨基丁酸(GABA)，红色及黄色色素，蛋白酶，淀粉酶及几丁质合成酶等，其中在药物开发及工业用途上最具潜力发展的是红曲菌会产生多样的聚酮化合物(polyketides)，包含应用在食品上的各种不同色素及临床医学上的降血脂药物lovastatin(Lovacal)，此药物与红曲菌的 monacolin K为相同的化学结构，主要为抑制胆固醇合成过程中的HMG-CoA还原酶(HMG-CoA redustase)，使HMG-CoA无法进一步被催化形成Mevolonate，有效达到降低胆固醇的目的。红曲菌参与胆固醇合成抑制剂(monacolin K)的基因共有9个，包含两个polyketide synthase 基因，其中之一为合成nonaketide之基因(mokA)，另一个为合成diketide的基因(mokB)，另外还有相关修饰胆固醇合成抑制剂的基因，monooxygenase(mokC)，oxidoreductase (mokD)，dehydrogenase(mokE)，transesterase(mokF)，此外也有作为调控胆固醇合成抑制剂的基因，HMG-CoA reductase(mokG)，transcription factor(mokH)及efflux pump (mokI)。其中当transcription factor(mokH)过量表达时，可以促进胆固醇合成抑制剂 (monacolin K)的产量增加。红曲菌除了明确的降低胆固醇功效之外，在许多不同的临床实验上也发现红曲发酵物对于高血脂病患(hypercholesterolaemia)也能有效降低低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoproteincholesterol)，但对于高血压病患则无明显的改善。
过去研究也发现陈皮粉红曲和山楂汁红曲在固态发酵条件下胆固醇抑制剂(Monacolin K) 及色价的含量最高(车鑫等，2016年，食品科学，37：114-119)，但固态培养存在生产效率低、劳动量大、不易自动化、发酵不均匀等天热缺陷。
发明内容
本发明的主要目的，在于提供一种同时具有抗氧化、抗发炎功效及促进胆固醇抑制剂 (Monacolin K)生成的红曲菌培养方法。
本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：
一种同时具有抗氧化、抗发炎功效及促进胆固醇抑制剂生成的红曲菌培养方法，其特征在于：将甘草以1/40-60的中药重量g/蒸馏水体积ml的方式进行高温高压灭菌,120-125℃， 28-32分钟，再将红曲菌接种进去，红曲霉的接种量为约105-7孢子/ml待接种发酵液，于室温静置培养55-65天后，收取培养液，获得具有多功效的发酵产物；或所述的培养液过滤之后，冷冻干燥获得具有多功效的发酵产物。
优选地，本发明所述的红曲霉为ATCC18199，可商业购买得到。
本发明的另一目的，在于提供一种发酵产物，其是根据前述的一种同时具有抗氧化、抗发炎及促进胆固醇抑制剂(Monacolin K)生成的红曲菌培养方法得到。
本发明的另一目的，在于提供所述的一种发酵产物在制备抗发炎药物中的用途，其中，抗发炎药物中，发酵产物的浓度为0.4-1.0mg/mL，所述的发酵产物为培养液过滤之后，冷冻干燥获得具有多功效的发酵产物。
本发明的另一目的，在于提供所述的一种发酵产物在制备抗氧化药物中的用途，其中，抗氧化药物中，发酵产物的浓度为0.1-0.5mg/mL，所述的发酵产物为培养液过滤之后，冷冻干燥获得具有多功效的发酵产物。
本发明的另一目的，在于提供一种高浓度胆固醇抑制剂(monacolin K)的制备方法，其特征在于：将甘草以1/40-60的中药重量g/蒸馏水体积ml的方式进行高温高压灭菌,120-125℃， 28-32分钟，再将红曲菌接种进去，于室温静置培养60-120天后，收取培养液，获得含胆固醇抑制剂22-27μg/mL-培养液的发酵产物。
本发明的另一目的，在于提供高浓度11β-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮 (11beta-Hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione)的制备方法，其特征在于：将甘草以1/40-60的中药重量g/蒸馏水体积ml的方式进行高温高压灭菌,120-125℃，28-32分钟，再将红曲菌接种进去，于室温静置培养55-65天后，收取培养液，获得具有高浓度11b-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的发酵产物。
本发明的另一目的，在于提供高浓度3,4-二羟基苯基二醇(3,4-Dihydroxyphenylglycol)的制备方法，其特征在于：将甘草以1/40-60的中药重量g/蒸馏水体积ml的方式进行高温高压灭菌,120-125℃，28-32分钟，再将红曲菌接种进去，于室温静置培养55-65天后，收取培养液，获得具有高浓度3,4-二羟基苯基二醇的发酵产物。
本发明的另一目的，在于提供高浓度儿茶酸(2-Pyrocatechuic acid)的制备方法，其特征在于：将甘草以1/40-60的中药重量g/蒸馏水体积ml的方式进行高温高压灭菌,120-125℃，28-32分钟，再将红曲菌接种进去，于室温静置培养55-65天后，收取培养液，获得具有高浓度儿茶酸的发酵产物。
本发明的另一目的，在于提供高浓度3-氨基-4-羟基苯甲酸乙酯 (3-Amino-4-hydroxybenzoate)的制备方法，其特征在于：将甘草以1/40-60的中药重量 g/蒸馏水体积ml的方式进行高温高压灭菌,120-125℃，28-32分钟，再将红曲菌接种进去，于室温静置培养55-65天后，收取培养液，获得具有高浓度3-氨基-4-羟基苯甲酸乙酯的发酵产物。
本发明提供一种同时具有抗氧化、抗发炎及促进胆固醇抑制剂(Monacolin K)生成的红曲菌培养方法，将中药甘草及红曲菌以液态培养的方式于室温静置培养55-65天(优选为60天) 后，收取培养液，经冷冻干燥后，即可获得具有多功效的发酵产物。本发明的甘草红曲菌发酵产物，在浓度为0.5mg/mL及0.125mg/mL的条件下，相对于中药对照组，第60天的发酵产物能提升约30％去除DPPH自由基的能力及39％去除ATBS自由基的抗氧化能力。在浓度为 0.5mg/mL的条件下，相对于中药对照组，第60天的发酵产物能有效抑制约22％一氧化氮的产生，达到抗发炎的效果，并且能有效提升总酚含量达23mg/g-发酵物，此外，第60天的发酵产物能产生22μg/mL-培养液的胆固醇抑制剂，相较于传统利用白米培养的发酵产物，第60天的胆固醇抑制剂提升约42倍，而甘草红曲菌发酵产物还含有高浓度的 11beta-Hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione、3,4-Dihydroxyphenylglycol、Leucine、 2-Pyrocatechuic acid及3-Amino-4-hydroxybenzoate等化合物。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为红曲菌发酵物(0.5mg/mL)对巨噬细胞的存活率分析。
图2为红曲菌发酵物(0.5mg/mL)去除DPPH自由基的分析。
图3为红曲菌发酵物(0.125mg/mL)去除ABTS自由基的分析。
图4为红曲菌发酵物(0.5mg/mL)抗发炎能力分析。
图5为红曲菌发酵物中对应五倍子酸的总酚含量。
图6为红曲菌培养液中胆固醇抑制剂(Monacolin K)的含量。
图7为比较红曲菌利用白米及甘草发酵后，在第60天及120天参与胆固醇抑制剂生合成基因表达差异倍数。
具体实施方式
实施例1
红曲菌与甘草发酵培养：利用红曲菌株(ATCC18199)于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中室温培养12天后，将孢子刮取收集，再与接种至甘草培养液中(2g甘草/50mL蒸馏水，121℃，30 分钟灭菌)进行室温静置培养，接种量为反应体积的1/100(约106孢子/ml培养液)，分别在第 60天及120天收集培养液，将培养液过滤后，进行冷冻干燥，所得的冷冻干燥粉末即作为后续分析测试。
红曲菌与白米发酵培养：利用红曲菌株(ATCC18199)于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中室温培养12天后，将孢子刮取收集，再与接种至白米培养液中(2g白米/50mL蒸馏水，121℃，30 分钟灭菌)进行室温静置培养，接种量为反应体积的1/100(约106孢子/ml培养液)，分别在第 60天及120天收集培养液，将培养液过滤后，进行冷冻干燥，所得的冷冻干燥粉末即作为后续分析测试。
红曲菌与中药发酵培养：利用红曲菌株(ATCC18199)于马铃薯葡萄糖琼脂培养基中室温培养12天后，将孢子刮取收集，再与接种至中药培养液中(2g中药/50mL蒸馏水，121℃，30 分钟灭菌)进行室温静置培养，接种量为反应体积的1/100(约106孢子/ml培养液)，分别在第 60天及120天收集培养液，将培养液过滤后，进行冷冻干燥，所得的冷冻干燥粉末即作为后续分析测试。
其中，所述的中药分别为独活、广藿香、白芍。
实施例2细胞毒性分析
利用MTT检测进行安全评估。于37℃及5％CO2培养箱中进行人类纤维母细胞株化细胞培养24小时，评估不同浓度提取物对细胞是否具细胞毒性，加入不同浓度提取物，待反应时间完成后，移除上清液，并利用PBS清洗及换上新的培养液，加入10μL的MTT溶液反应，于37℃及5％CO2反应4小时后移除培养液，加入100μL的DMSO溶解沉淀物，以分光光度计分析570nm吸光值。
实施例3抗氧化分析
3.1抑制DPPH自由基评估:定量瓶中加入0.3943g DPPH及100mL乙醇，配成10mMDPPH 的乙醇溶液，此溶液再稀释成0.5mM DPPH溶液。取20μL不同浓度红曲发酵物，加入180μL DPPH溶液，震荡混合，并于室温静置30分钟。使用分光光度计分析517nm吸光值。以不同稀释浓度抗坏血酸(维生素C)(ascorbic acid)作为样品的对照组。计算清除率(scavenging effects)(％)＝[控制组于517nm吸光值-样品反应后于517nm吸光值/控制组于517nm吸光值]*100。
3.2抑制ABST自由基评估:根据总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)(碧云天生物公司) 进行ABST自由基清除分析，将配置好的的ABTS工作母液在室温避光放置12-16小时，之后用PBS稀释成ABTS工作液，取不同浓度的红曲发酵发酵物加入200μL的工作母液，使用分光光度计分析405nm吸光值。ABTS清除率(scavenging effects)(％)＝[控制组于405nm吸光值-样品反应后于405nm吸光值/控制组于405nm吸光值]*100
实施例4抗发炎分析
将巨噬细胞(RAW 264.7)置于37℃及5％CO2培养箱中培养24小时，加入不同浓度红曲发酵发酵物反应1小时，再用LPS(1μg/mL)刺激24小时后离心并收集培养基，利用一氧化氮检测试剂盒(碧云天生物公司)进行一氧化氮的测定，使用分光光度计分析540nm吸光值。计算清除率(％)＝[控制组于540nm吸光值-样品反应后于540nm吸光值/控制组于540nm吸光值]*100。
实施例5总酚分析
根据Folin-Ciocalteus方法进行总酚分析，取20μL不同浓度红曲发酵物，加入200μL Folin-Ciocalteus试剂，震荡混合，并于室温静置10分钟，加入180μL 20％的碳酸钠。使用分光光度计分析735nm吸光值。以不同稀释浓度五倍子酸(Gallic acid)作为样品分析的标准曲线。
实施例6胆固醇合成抑制剂(monacolin K)分析
将红曲培养液以0.22μm过滤后，注射到反相HPLC系统(岛津，日本)，使用InertSustain C18液相色谱柱(150×4.6mm，5μm)，以紫外检测仪在237nm条件下分析，并按下列参数进行洗脱，0.1％磷酸及甲醇以20:80(v/v)比列洗脱30分钟，洗脱速度为1.5mL/min。 Monacolin K(Sigma)标准品作为浓度定量依据，Monacolin K的吸收波峰有230，237及246nm。
实施例7Real-time qPCR分析:
将收集得到的红曲菌利用研钵磨碎后，加入TRIzol试剂(Invitrogen)，再用氯仿进行提取，获得的RNA以电泳及分光光度计进行品质分析。采用反转录系统,在42℃温度下用随机及poly-A引物合成第一链cDNA，使用SYBR混合物以25μl为最终体积进行qPCR。热循环参数包括95℃初始加热15分钟，95℃变性10秒，60℃退火延伸1分钟，放大40个循环。18SrRNA引物组作为阳性对照，进行标准化，再以2-ΔΔCT计算基因表达水平。引物设计如下:
Figure RE-GDA0003299996920000071
Figure RE-GDA0003299996920000081
实施例8代谢物分析
委托苏州金唯智生物科技有限公司利用LC-MS鉴定不同的代谢物，色谱仪器采用Thermo Vanquish，使用ACQUITY
Figure RE-GDA0003299996920000082
HSS T3 1.8μm(2.1×150mm)色谱柱，流动相正离子分析为0.1％甲酸水(A)-0.1％甲酸乙腈(B)；负离子分析为5mM甲酸铵水(C)-乙腈(D)，梯度洗脱程序为0～1min，2％B2/B3；1～9min，2％～50％B2/B3；9～12min，50％～98％B2/B3； 12～13.5min，98％B2/B3；13.5～14min，98％～2％B2/B3；14～20min，2％B2-正模式(14～17min，2％B3-负模式)。质谱仪器使用Thermo Q Exactive Plus，电喷雾离子源(ESI)，正负离子电离模式，正离子喷雾电压为3.50kV，负离子喷雾电压为2.50kV，以分辨率70 000 进行全扫描，扫描范围81～1 000，并采用HCD进行二级裂解，碰撞电压为30eV，同时采用动态排除去除无必要的MS/MS信息，根据MS/MS碎片模式对 Metlin(http://metlin.scripps.edu)，MoNA(https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu//)，以及苏州金唯智生物科技有限公司自建标准品数据库经行分析。
结果：
1.本发明的甘草红曲菌发酵产物，在浓度为0.5mg/mL的条件下，第60天的发酵物对巨噬细胞(RAW 264.7)的存活率约为96％，第120天的发酵物对巨噬细胞(RAW 264.7)的存活率为89.5％，显示此发酵物对巨噬细胞不具有毒性影响(图1)。
2.本发明的甘草红曲菌发酵产物，在浓度为0.5mg/mL的条件下，相对于中药对照组，第60天的发酵产物能提升约30％去除DPPH自由基的能力(图2)。
3.本发明的甘草红曲菌发酵产物，在浓度为0.125mg/mL的条件下，相对于中药对照组，第60天的发酵产物能提升约39％去除ATBS自由基的能力(图3)。
4.本发明的甘草红曲菌发酵产物，在浓度为0.5mg/mL的条件下，相对于中药对照组，第60天的发酵产物能有效抑制约22％一氧化氮的产生，达到抗发炎的效果(图4)。
5.本发明的甘草红曲菌发酵产物，相对于中药对照组，第60天的发酵产物能有效提升总酚含量达23mg/g-发酵物(图5)。
6.本发明的甘草红曲菌发酵产物，第60天的发酵产物能产生22μg/mL-培养液的胆固醇抑制剂，第120天的发酵产物能产生27μg/mL-培养液的胆固醇抑制剂，相较于传统利用白米培养的发酵产物，第60天的胆固醇抑制剂提升约42倍(图6)。
7.比较红曲菌利用白米及甘草发酵后，第60天的甘草发酵红曲菌，其参与生成胆固醇抑制剂的基因表达皆比白米发酵红曲菌的高(图7)。
8.鉴定并比较红曲菌发酵物与中药对照组差异倍数较大的化合物，甘草红曲菌发酵产物可以促进11beta-Hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione、3,4-Dihydroxyphenylglycol、 Leucine、2-Pyrocatechuic acid及3-Amino-4-hydroxybenzoate等化合物的产生(表1)
表1、鉴定并比较红曲菌发酵物与中药对照组差异倍数较大的化合物
Figure RE-GDA0003299996920000091
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 厦门医学院
<120> 一种同时具有抗氧化、抗发炎及促进胆固醇抑制剂生成的红曲菌培养方法
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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gcactttttc accccgttga 20
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Claims (10)

1.一种同时具有抗氧化、抗发炎功效及促进胆固醇抑制剂生成的红曲菌培养方法，其特征在于：将甘草以1/40-60的中药重量g/蒸馏水体积ml的方式进行高温高压灭菌,120-125℃，28-32分钟，再将红曲菌接种进去，红曲霉的接种量为105-7孢子/ml待接种发酵液，于室温静置培养55-65天后，收取培养液，获得具有多功效的发酵产物；或所述的培养液过滤之后，冷冻干燥获得具有多功效的发酵产物。
2.根据权利要求1所述的一种同时具有抗氧化、抗发炎功效及促进胆固醇抑制剂生成的红曲菌培养方法，其特征在于：所述的红曲霉为ATCC18199。
3.一种发酵产物，其特征在于，是根据权利要求1至2任一项所述的红曲菌培养方法得到。
4.根据权利要求3所述的一种发酵产物在制备抗发炎药物中的用途，其中，抗发炎药物中，发酵产物的浓度为0.4-1.0mg/mL，所述的发酵产物为培养液过滤之后，冷冻干燥获得的具有多功效的发酵产物。
5.根据权利要求3所述的一种发酵产物在制备抗氧化药物中的用途，其中，抗氧化药物中，发酵产物的浓度为0.1-0.5mg/mL，所述的发酵产物为培养液过滤之后，冷冻干燥获得具有多功效的发酵产物。
6.一种高浓度胆固醇抑制剂的制备方法，其特征在于：将甘草以1/40-60的中药重量g/蒸馏水体积ml的方式进行高温高压灭菌,120-125℃，28-32分钟，再将红曲菌接种进去，于室温静置培养60-120天后，收取培养液，获得含胆固醇抑制剂22-27μg/mL-培养液的发酵产物。
7.高浓度11b-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的制备方法，其特征在于：将甘草以1/40-60的中药重量g/蒸馏水体积ml的方式进行高温高压灭菌,120-125℃，28-32分钟，再将红曲菌接种进去，于室温静置培养55-65天后，收取培养液，获得具有高浓度11b-羟基-雄甾-4-烯-3,17-二酮的发酵产物。
8.高浓度3,4-二羟基苯基二醇的制备方法，其特征在于：将甘草以1/40-60的中药重量g/蒸馏水体积ml的方式进行高温高压灭菌,120-125℃，28-32分钟，再将红曲菌接种进去，于室温静置培养55-65天后，收取培养液，获得具有高浓度3,4-二羟基苯基二醇的发酵产物。
9.高浓度儿茶酸的制备方法，其特征在于：将甘草以1/40-60的中药重量g/蒸馏水体积ml的方式进行高温高压灭菌,120-125℃，28-32分钟，再将红曲菌接种进去，于室温静置培养55-65天后，收取培养液，获得具有高浓度儿茶酸的发酵产物。
10.高浓度3-氨基-4-羟基苯甲酸乙酯的制备方法，其特征在于：将甘草以1/40-60的中药重量g/蒸馏水体积ml的方式进行高温高压灭菌,120-125℃，28-32分钟，再将红曲菌接种进去，于室温静置培养55-65天后，收取培养液，获得具有高浓度3-氨基-4-羟基苯甲酸乙酯的发酵产物。
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