CN113616587B - 一种用于晒后皮肤修复的气雾剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于晒后皮肤修复的气雾剂及其制备方法，属于医疗美容技术领域。为解决现有晒后修复产品难以有效应对紫外线造成的炎症反应和细胞损害的问题，本发明提供了一种用于晒后皮肤修复的气雾剂，主要成分包括脂肪干细胞外泌体、载药纳米脂质体、透明质酸、尿囊素、甘油和去离子水。本发明以脂肪干细胞外泌体与具有消炎镇定、清除自由基功效的载药纳米脂质体作为主要功效成分，帮助受损皮肤细胞快速修复损伤、消除红肿，并为晒伤后期皮肤细胞重建提供营养。本发明气雾剂中各组分相复配后起到协同增效的作用，为受损皮肤补充充足水分，使其恢复细胞功能，促进皮肤组织的代谢，清除氧自由基，同时各组分温和无刺激，安全无毒副作用。

Description

一种用于晒后皮肤修复的气雾剂及其制备方法
技术领域
本发明属于医疗美容技术领域，尤其涉及一种用于晒后皮肤修复的气雾剂及其制备方法。
背景技术
阳光中的UVA和UVB这两种穿透性紫外线会直达皮肤真皮层，使过敏体质人群受照射区皮肤出现红、灼、热、痛，这便是医学上常说的日光性皮炎，即紫外线过敏。同时，紫外线辐射还会导致自由基在体内急剧增加，使局部皮肤产生皱纹、色素沉积和细胞损害。
晒后72小时内是皮肤受伤的修复期，晒后6-8小时则是修复的最佳时间。常见的晒后皮肤修复多为冷敷镇定和水分补充，难以有效应对紫外线造成的炎症反应和细胞损害。而且大部分晒后修复药剂为乳膏剂或面膜，涂抹或敷贴后容易对皮肤造成负担，有效成分也不易被皮肤快速吸收，无法充分发挥晒后修复的效果，不能及时缓解晒伤症状及促进皮肤恢复。
发明内容
为解决现有晒后修复产品难以有效应对紫外线造成的炎症反应和细胞损害的问题，本发明提供了一种用于晒后皮肤修复的气雾剂及其制备方法。
本发明的技术方案：
一种用于晒后皮肤修复的气雾剂，所述气雾剂包括如下重量份的组分：脂肪干细胞外泌体0.1～1份、载药纳米脂质体10～15份、分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.05～0.15份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.01～0.05份、尿囊素0.5～1份、甘油5～10份和去离子水72.8～84.34份。
进一步的，所述气雾剂包括如下重量份的组分：脂肪干细胞外泌体0.5份、载药纳米脂质体12份、分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.10份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.05份、尿囊素1份、甘油10份和去离子水76.35份。
进一步的，所述脂肪干细胞外泌体为人源脂肪干细胞外泌体，粒径为20～200nm。
进一步的，所述载药纳米脂质体含有质量比为65～70：20：10～15的蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇和药物组合物，所述药物组合物包括如下组分：茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油。
进一步的，所述药物组合物中茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油的质量比为1～3：1～2：1～3：1～3：1～2：1。
一种本发明用于晒后皮肤修复的气雾剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、提取脂肪干细胞外泌体：
将脂肪干细胞接种于诱导培养基中进行培养，接种量为50％，培养条件为37℃，5％CO2恒温培养48h，吸除培养基后，加入低糖DMEM培养基继续培养48h后收集上清液；所得上清液依次经300×g离心10min、2000×g离心10min、10000×g高速离心30min和14000×g超速离心90min，收集所述超速离心得到的沉淀即为脂肪干细胞外泌体；
步骤二、制备载药纳米脂质体：
根据配方将蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇、茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油溶于无水乙醇，所有组分完全溶解后减压旋干获得脂膜，将所得脂膜再次用无水乙醇溶解并再次旋干得到二次脂膜，将所得二次脂膜用DEPC生理盐水溶解水化，对水化体系进行超声处理，使脂质体充分均匀分散在水化体系中，然后聚碳酸酯膜对水化体系进行过膜挤出得到载药纳米脂质体；
步骤三、制备气雾剂：
将步骤一提取得到的脂肪干细胞外泌体、步骤二制备的载药纳米脂质体、分子量为1000～1400kDa的透明质酸、分子量为20～300kDa的透明质酸、尿囊素与甘油混合均匀得到体系1，向体系1中加入去离子水中，混合均匀后得到用于晒后皮肤修复的气雾剂。
进一步的，步骤一所述诱导培养基是以低糖DMEM培养基为基础，添加了如下含量的诱导剂：重组白蛋白50μg/mL、重组表皮生长因子20μg/mL、维生素C 20μg/mL、尼克酰胺8μg/mL、丙酮酸钠12μg/mL、成纤维细胞生长因子30μg/mL、IBMX 0.5μg/mL、维甲酸0.5μg/mL。
进一步的，步骤一所述脂肪干细胞的获得方法为取脂肪组织用PBS缓冲液冲洗3次后剪碎获得1mm3的碎块，加入0.1％胶原蛋白酶I和0.25％胰酶消化30～45min，然后静置分层后吸取上层脂肪细胞液，将所得脂肪细胞液加入等体积DMEM-F12培养基，10％胎牛血清终止消化，300×g离心10min，弃上清，在细胞沉淀中加入20mL无血清细胞培养基，37℃，5％CO2恒温培养48h后换液，之后每5天换液，观察到梭形细胞长出，细胞融合度达到70～80％时即冻存得到脂肪干细胞。
进一步的，步骤二所述超声处理条件为300W超声处理10min。
进一步的，步骤二所述聚碳酸酯膜对水化体系进行过膜挤出是用孔径为200nm的聚碳酸酯膜对水化体系进行过膜挤出，反复挤出3～5次后，再用孔径为100nm的聚碳酸酯膜对体系进行过膜挤出，反复挤出2～3次后，得到粒径为100～150nm的载药纳米脂质体。
本发明的有益效果：
本发明提供的用于晒后皮肤修复的气雾剂，以脂肪干细胞外泌体与具有消炎镇定、清除自由基功效的载药纳米脂质体作为主要功效成分。脂肪干细胞外泌体能够帮助受损的皮肤细胞快速修复损伤，消除红肿症状，加快真皮层胶原蛋白的重构，恢复皮肤功能；载药纳米脂质体所载药物具有消炎镇定的作用，在减轻皮肤灼热肿痛症状的同时提供抗氧化、清除自由基、消炎抗敏的功效，能够快速缓解晒伤初期皮肤症状，并为晒伤后期皮肤细胞重建提供所需营养成分。气雾剂中还复配了不同分子量的透明质酸，其中小分子量的透明质酸穿过角质层渗透到真皮层，为受损皮肤实现补水功能，使晒后受损皮肤细胞保持充足的水分；大分子量的透明质酸则在皮肤表层形成锁水保湿膜，保证补充的水分不流失。气雾剂中还复配了尿囊素和甘油，辅以保湿补水、促进细胞生长、加速恢复的作用。本发明用于晒后皮肤修复的气雾剂各组分相复配，起到协同增效的作用，能使晒伤皮肤快速恢复，促进皮肤组织的代谢，清除氧自由基，同时各组分温和无刺激，安全无毒副作用。
本发明制备方法得到的脂肪干细胞外泌体和载药纳米脂质体均为纳米级粒径，随气雾剂喷于晒伤皮肤后易于被细胞吸收利用，其中脂肪干细胞外泌体纯度高，活性状态稳定，经冻干再水化后仍保持膜完整性，外泌体蛋白测得量恒定，有效延长了气雾剂的保质期。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本实施例提供了一种用于晒后皮肤修复的气雾剂，所述气雾剂包括如下重量份的组分：脂肪干细胞外泌体0.5份、载药纳米脂质体12份、分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.10份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.05份、尿囊素1份、甘油10份和去离子水76.35份。
本实施例中载药纳米脂质体中蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇和药物组合物的质量比为70：20：10，其中药物组合物中茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油的质量比为3：2：1：2：1：1。
实施例2
本实施例提供了一种用于晒后皮肤修复的气雾剂，所述气雾剂包括如下重量份的组分：脂肪干细胞外泌体0.1份、载药纳米脂质体10份、分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.15份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.01份、尿囊素0.5份、甘油5份和去离子水84.24份。
本实施例中载药纳米脂质体中蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇和药物组合物的质量比为68：20：12，其中药物组合物中茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油的质量比为2：1：3：1：2：1。
实施例3
本实施例提供了一种用于晒后皮肤修复的气雾剂，所述气雾剂包括如下重量份的组分：脂肪干细胞外泌体1份、载药纳米脂质体15份、分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.05份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.03份、尿囊素0.8份、甘油8份和去离子水75.12份。
本实施例中载药纳米脂质体中蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇和药物组合物的质量比为65：20：15，其中药物组合物中茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油的质量比为1：2：2：3：1：1。
实施例1-3中使用的脂肪干细胞外泌体为人源脂肪干细胞外泌体，粒径为20～200nm，是细胞在生理活动过程中分泌出来的生理活性物质，主要功效成分包括蛋白质类物质及micRNA类核酸物质。脂肪干细胞外泌体是一种外层为脂质双分子层结构的囊泡，其纳米级的体积非常易于被皮肤细胞吸收，帮助皮肤细胞修复因紫外线照射、及因紫外线照射产生的自由基引起的基因损伤，促进胶原重构、加速皮肤细胞的增殖，从而加速皮肤受损创面的愈合。
实施例1-3中使用的载药纳米脂质体含有茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油。其中茶多酚具有抗氧化性能，能清除紫外线诱导的自由基，抑制黑色素的形成；虾青素是强抗氧化剂，能有效清除细胞内的氧自由基，增强皮肤细胞再生能力；红没药醇具有消炎、抗过敏的作用；神经酰胺-3具有补水保湿修复的作用，能提升皮肤屏障，减少水分流失；维生素E的抗氧化作用能保护细胞免受自由基的毒害，减少色素沉积；薄荷油则具有镇痛、缓解面部肿痛症状的作用。
载药纳米脂质体药物有效成分包裹在脂质膜内，其粒径仅为100～150nm，非常易于通过细胞吞噬和融合作用而进入皮肤细胞，继而将药物释放，更快速高效的发挥药效。
脂肪干细胞外泌体和载药纳米脂质体作为主要功效成分，均能够快速被表皮细胞吸收，帮助受损的皮肤细胞快速修复损伤，消除红肿症状，在减轻皮肤灼热肿痛症状的同时提供抗氧化、清除自由基、消炎抗敏的功效，能够快速缓解晒伤初期皮肤症状，并为晒伤后期皮肤细胞重建提供所需营养成分。实施例1-3均复配了不同分子量的透明质酸，其中小分子量的透明质酸穿过角质层渗透到真皮层，为受损皮肤实现补水功能，使晒后受损皮肤细胞保持充足的水分；大分子量的透明质酸则在皮肤表层形成锁水保湿膜，保证补充的水分不流失。实施例1-3均复配了尿囊素和甘油，辅以保湿补水、促进细胞生长、加速恢复的作用。实施例1-3提供的气雾剂各组分相复配，起到协同增效的作用，能使晒伤皮肤快速恢复，促进皮肤组织的代谢，清除氧自由基，同时各组分温和无刺激，安全无毒副作用。
实施例4
本实施例提供了一种脂肪干细胞外泌体的提取方法，具体包括如下步骤：
步骤1、获得脂肪干细胞：
取脂肪组织用PBS缓冲液冲洗3次后剪碎获得1mm3的碎块，加入0.1％胶原蛋白酶I和0.25％胰酶消化30～45min，然后静置分层后吸取上层脂肪细胞液，将所得脂肪细胞液加入等体积DMEM-F12培养基，10％胎牛血清终止消化，300×g离心10min，弃上清，在细胞沉淀中加入20mL无血清细胞培养基，37℃，5％CO2恒温培养48h后换液，之后每5天换液，观察到梭形细胞长出，细胞融合度达到70～80％时即可冻存得到脂肪干细胞；
本实施例脂肪组织取自健康人体抽脂术后的脂肪组织。
本实施例使用的诱导培养基是以低糖DMEM培养基为基础，添加了如下含量的诱导剂：重组白蛋白50μg/mL、重组表皮生长因子20μg/mL、维生素C 20μg/mL、尼克酰胺8μg/mL、丙酮酸钠12μg/mL、成纤维细胞生长因子30μg/mL、IBMX 0.5μg/mL、维甲酸0.5μg/mL。
步骤2、脂肪干细胞的培养：
配制诱导培养基，所述诱导培养基以低糖DMEM培养基为基础，添加了如下含量的诱导剂：重组白蛋白50μg/mL、重组表皮生长因子20μg/mL、维生素C 20μg/mL、尼克酰胺8μg/mL、丙酮酸钠12μg/mL、成纤维细胞生长因子30μg/mL、IBMX 0.5μg/mL、维甲酸0.5μg/mL。
将步骤1获得的脂肪干细胞接种于诱导培养基中进行培养，接种量为50％，培养条件为37℃，5％CO2恒温培养48h，吸除培养基，加入低糖DMEM培养基培养48h后收集上清液；
步骤3、收集脂肪干细胞外泌体：
将步骤2收集得到的上清液300×g离心10min，收集上清，将所得上清2000×g离心10min，收集上清，将所得上清10000×g高速离心30min，收集上清，将所得上清14000×g超速离心90min，收集沉淀得到外泌体，用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬，14000×g超速离心90min，收集沉淀，生理盐水重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
本实施例提取得到的脂肪干细胞外泌体直径为20～200nm。
含有本实施例制备的脂肪干细胞外泌体的气雾剂在15℃下储存1个月、2个月、3个月、6个月后检测其外泌体蛋白测得量，相比于本实施例制备的脂肪干细胞外泌体原始外泌体蛋白测得量，储存后的气雾剂中外泌体蛋白测得量依次为99％、96％、95％、92％。这说明本发明制备的脂肪干细胞外泌体活性状态稳定，经冻干再水化后仍保持膜完整性，外泌体蛋白测得量恒定，有效延长了气雾剂的保质期。
实施例5
本实施例提供了一种载药纳米脂质体的制备方法，具体方法如下：
将蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇、茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油溶于无水乙醇，所有组分完全溶解后减压旋干获得脂膜，将所得脂膜再次用无水乙醇溶解并再次旋干得到二次脂膜，将所得二次脂膜用DEPC生理盐水溶解水化，对水化体系进行300W超声处理，超声处理10min使脂质体充分均匀分散在水化体系中，用孔径为200nm的聚碳酸酯膜对水化体系进行过膜挤出，反复挤出3～5次后，再用孔径为100nm的聚碳酸酯膜对体系进行过膜挤出，反复挤出2～3次后，得到粒径为100～150nm的载药纳米脂质体。
本实施例制备的载药纳米脂质体药物包封率不低于80％，且粒径均匀，在气雾剂中能够保持结构稳定，有效延长了气雾剂的保质期。
实施例6
本实施例为实施例1提供的用于晒后皮肤修复的气雾剂的制备方法，具体步骤如下：
步骤一、按实施例4提供的方法提取脂肪干细胞外泌体：
将脂肪干细胞接种于诱导培养基中进行培养，接种量为50％，培养条件为37℃，5％CO2恒温培养48h，吸除培养基后，加入低糖DMEM培养基继续培养48h后收集上清液；所得上清液依次经300×g离心10min、2000×g离心10min、10000×g高速离心30min和14000×g超速离心90min，收集所述超速离心得到的沉淀即为脂肪干细胞外泌体。
步骤二、按实施例5提供的方法制备载药纳米脂质体：
按药物组合物中茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油的质量比为3：2：1：2：1：1准备药物组合物；按蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇和药物组合物的质量比为70：20：10准备蛋黄磷脂酰胆碱和胆固醇。将蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇、茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油溶于无水乙醇，所有组分完全溶解后减压旋干获得脂膜，将所得脂膜再次用无水乙醇溶解并再次旋干得到二次脂膜，将所得二次脂膜用DEPC生理盐水溶解水化，对水化体系进行300W超声处理10min，使脂质体充分均匀分散在水化体系中，然后用200nm的聚碳酸酯膜对水化体系进行过膜挤出，反复挤出3～5次后，再用孔径为100nm的聚碳酸酯膜对体系进行过膜挤出，反复挤出2～3次后，得到粒径为100～150nm的载药纳米脂质体。
步骤三、制备气雾剂：
准备如下重量份的组分：脂肪干细胞外泌体0.5份、载药纳米脂质体12份、分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.10份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.05份、尿囊素1份、甘油10份和去离子水76.35份；
将步骤一提取得到的脂肪干细胞外泌体、步骤二制备的载药纳米脂质体、分子量为1000～1400kDa的透明质酸、分子量为20～300kDa的透明质酸、尿囊素与甘油混合均匀得到体系1，向体系1中加入去离子水中，混合均匀后得到用于晒后皮肤修复的气雾剂。
本实施例的气雾剂优选罐装在真空气雾剂铝瓶中，还可罐装在普通塑料喷雾瓶中。优选在晒伤后6～8h以内，在距离晒伤皮肤部位25～30cm的位置按下气雾剂铝瓶的喷头，将气雾剂均匀喷洒在晒伤皮肤部位，每天可喷涂3～4次，至症状缓解。
实施例7
本实施例为实施例2提供的用于晒后皮肤修复的气雾剂的制备方法，具体步骤如下：
步骤一、按实施例4提供的方法提取脂肪干细胞外泌体：
将脂肪干细胞接种于诱导培养基中进行培养，接种量为50％，培养条件为37℃，5％CO2恒温培养48h，吸除培养基后，加入低糖DMEM培养基继续培养48h后收集上清液；所得上清液依次经300×g离心10min、2000×g离心10min、10000×g高速离心30min和14000×g超速离心90min，收集所述超速离心得到的沉淀即为脂肪干细胞外泌体。
步骤二、按实施例5提供的方法制备载药纳米脂质体：
按药物组合物中茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油的质量比为2：1：3：1：2：1准备药物组合物；按蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇和药物组合物的质量比为68：20：12准备蛋黄磷脂酰胆碱和胆固醇。将蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇、茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油溶于无水乙醇，所有组分完全溶解后减压旋干获得脂膜，将所得脂膜再次用无水乙醇溶解并再次旋干得到二次脂膜，将所得二次脂膜用DEPC生理盐水溶解水化，对水化体系进行300W超声处理10min，使脂质体充分均匀分散在水化体系中，然后用200nm的聚碳酸酯膜对水化体系进行过膜挤出，反复挤出3～5次后，再用孔径为100nm的聚碳酸酯膜对体系进行过膜挤出，反复挤出2～3次后，得到粒径为100～150nm的载药纳米脂质体。
步骤三、制备气雾剂：
准备如下重量份的组分：脂肪干细胞外泌体0.1份、载药纳米脂质体10份、分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.15份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.01份、尿囊素0.5份、甘油5份和去离子水84.24份；
将步骤一提取得到的脂肪干细胞外泌体、步骤二制备的载药纳米脂质体、分子量为1000～1400kDa的透明质酸、分子量为20～300kDa的透明质酸、尿囊素与甘油混合均匀得到体系1，向体系1中加入去离子水中，混合均匀后得到用于晒后皮肤修复的气雾剂。
本实施例的气雾剂优选罐装在真空气雾剂铝瓶中，还可罐装在普通塑料喷雾瓶中。优选在晒伤后6～8h以内，在距离晒伤皮肤部位25～30cm的位置按下气雾剂铝瓶的喷头，将气雾剂均匀喷洒在晒伤皮肤部位，每天可喷涂3～4次，至症状缓解。
实施例8
本实施例为实施例3提供的用于晒后皮肤修复的气雾剂的制备方法，具体步骤如下：
步骤一、按实施例4提供的方法提取脂肪干细胞外泌体：
将脂肪干细胞接种于诱导培养基中进行培养，接种量为50％，培养条件为37℃，5％CO2恒温培养48h，吸除培养基后，加入低糖DMEM培养基继续培养48h后收集上清液；所得上清液依次经300×g离心10min、2000×g离心10min、10000×g高速离心30min和14000×g超速离心90min，收集所述超速离心得到的沉淀即为脂肪干细胞外泌体。
步骤二、按实施例5提供的方法制备载药纳米脂质体：
按药物组合物中茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油的质量比为1：2：2：3：1：1准备药物组合物；按蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇和药物组合物的质量比为65：20：15准备蛋黄磷脂酰胆碱和胆固醇。将蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇、茶多酚、虾青素、红没药醇、精神酰胺-3、维生素E和薄荷油溶于无水乙醇，所有组分完全溶解后减压旋干获得脂膜，将所得脂膜再次用无水乙醇溶解并再次旋干得到二次脂膜，将所得二次脂膜用DEPC生理盐水溶解水化，对水化体系进行300W超声处理10min，使脂质体充分均匀分散在水化体系中，然后用200nm的聚碳酸酯膜对水化体系进行过膜挤出，反复挤出3～5次后，再用孔径为100nm的聚碳酸酯膜对体系进行过膜挤出，反复挤出2～3次后，得到粒径为100～150nm的载药纳米脂质体。
步骤三、制备气雾剂：
准备如下重量份的组分：脂肪干细胞外泌体1份、载药纳米脂质体15份、分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.05份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.03份、尿囊素0.8份、甘油8份和去离子水75.12份；
将步骤一提取得到的脂肪干细胞外泌体、步骤二制备的载药纳米脂质体、分子量为1000～1400kDa的透明质酸、分子量为20～300kDa的透明质酸、尿囊素与甘油混合均匀得到体系1，向体系1中加入去离子水中，混合均匀后得到用于晒后皮肤修复的气雾剂。
本实施例的气雾剂优选罐装在真空气雾剂铝瓶中，还可罐装在普通塑料喷雾瓶中。优选在晒伤后6～8h以内，在距离晒伤皮肤部位25～30cm的位置按下气雾剂铝瓶的喷头，将气雾剂均匀喷洒在晒伤皮肤部位，每天可喷涂3～4次，至症状缓解。
对比例1
本对比例提供了一种仅添加脂肪干细胞外泌体的气雾剂及其制备方法。
将按实施例4提供的方法提取的脂肪干细胞外泌体0.5份、分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.10份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.05份、尿囊素1份与甘油10份混合均匀得到体系1，向体系1中加入去离子水88.35份中，混合均匀后得到用于晒后皮肤修复的气雾剂a。
对比例2
本对比例提供了一种仅添加载药纳米脂质体的气雾剂及其制备方法。
将按实施例5提供的方法制备的载药纳米脂质体12份、分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.10份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.05份、尿囊素1份与甘油10份混合均匀得到体系1，向体系1中加入去离子水76.85份中，混合均匀后得到用于晒后皮肤修复的气雾剂b。
对比例3
本对比例提供了一种不含脂肪干细胞外泌体和载药纳米脂质体的气雾剂及其制备方法。
将分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.10份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.05份、尿囊素1份、甘油10份均匀得到体系1，向体系1中加入去离子水88.85份中，混合均匀后得到用于晒后皮肤修复的气雾剂c。
晒后皮肤修复气雾剂效果对比实验：
20～30岁、男女志愿者若干，选取小臂和小腿裸露皮肤作为日晒部位，经6小时日晒后，选取皮肤出现灼热感、红肿、紫外线过敏症状且晒伤程度接近的志愿者随机分为七组，每组10人，在晒伤后6h开始分别做如下处理：
第一组：小臂晒伤部位喷涂实施例1提供的气雾剂，连续5天，每天早午晚各一次；
第二组：小臂晒伤部位喷涂实施例2提供的气雾剂，连续5天，每天早午晚各一次；
第三组：小臂晒伤部位喷涂实施例3提供的气雾剂，连续5天，每天早午晚各一次；
第四组：小臂晒伤部位喷涂对比例1提供的气雾剂a，连续5天，每天早午晚各一次；
第五组：小臂晒伤部位喷涂对比例2提供的气雾剂b，连续5天，每天早午晚各一次；
第六组：小臂晒伤部位喷涂对比例3提供的气雾剂c，连续5天，每天早午晚各一次；
第七组：小臂晒伤部位仅做冷敷处理，连续5天，每天早午晚各一次；
以上第一组至第七组志愿者的小腿晒伤部位自然恢复，不做处理。
喷涂气雾剂处理一天后观察，第一组至第七组志愿者小臂晒伤部位的灼热感均得到缓解，第一组、第二组和第三组小臂晒伤部位红肿症状和紫外线过敏症状得到一定程度的缓解，出现小面积红斑，第四组、第五组、第六组和第七组小臂晒伤部位红肿症状和紫外线过敏症状未见缓解，出现小面积红斑。第一组至第七组志愿者小腿晒伤部位灼热感均未得到缓解，且部分志愿者小腿晒伤部位出现弥漫性红斑、大小不等的水泡，及红肿加重的症状。
喷涂气雾剂处理三天后观察，第一组、第二组和第三组小臂晒伤部位红肿症状和紫外线过敏症状明显减弱，红斑消退；第四组、第五组和第六组小臂晒伤部位红肿症状和紫外线过敏症状得到一定程度的缓解，红斑减少；但效果不如第一组、第二组和第三组小臂晒伤部位效果显著。第七组小臂晒伤部位红肿症状和紫外线过敏症状稍见缓解，红斑未见消退。第一组至第七组志愿者小腿晒伤部位灼热感已消失，红肿稍见缓解，皮肤颜色加深，部分志愿者仍有水泡。
喷涂气雾剂处理七天后观察，第一组、第二组和第三组小臂晒伤部位红肿症状和紫外线过敏症状基本消失，皮肤未出现红斑、水泡、脱皮现象，皮肤颜色稍见加深；第四组小臂皮肤稍有发红，未见红斑、水泡、脱皮现象，皮肤颜色稍见加深；第五组小臂皮肤红肿已消失，稍有红斑、脱皮现象，皮肤颜色明显加深；第六组小臂皮肤仍稍有红肿、红斑，出现脱皮现象，皮肤颜色明显加深；第七组小臂皮肤仍有红肿，出现红斑、脱皮现象，皮肤颜色明显加深。第一组至第七组志愿者小腿晒伤部位红肿消退，皮肤颜色明显加深，出现大面积脱皮现象。
喷涂气雾剂处理十天后继续观察发现，第一组、第二组和第三组小臂晒伤部位基本恢复正常，虽然皮肤颜色稍见加深，但皮肤恢复状态良好。经检测，皮肤最外层角质层含水量能够达到10～20％，皮肤柔润、光滑、有弹性。
喷涂气雾剂处理十三天后继续观察发现，第四组、第五组小臂晒伤部位基本恢复正常，但皮肤颜色加深。经检测，皮肤最外层角质层含水量能够达到10～15％，皮肤柔润、光滑。
喷涂气雾剂处理二十天后继续观察发现，第六组小臂晒伤部位基本恢复正常，皮肤颜色加深。经检测，皮肤最外层角质层含水量能够达到10～15％，皮肤柔润、光滑。
喷涂气雾剂处理三十天后继续观察发现，第七组小臂晒伤部位基本恢复正常，皮肤颜色显著加深。经检测，皮肤最外层角质层含水量能够达到8～12％。
各组志愿者小腿晒伤部位三十天后基本恢复正常，皮肤颜色显著加深，经检测，皮肤最外层角质层含水量能够达到8～12％。
效果实验结果证明了脂肪干细胞能够促进因晒伤受损的皮肤细胞快速修复损伤，减轻紫外线过敏症状，在晒伤后期促进皮肤细胞功能重建。载药纳米脂质体所载药物具有消炎镇定的作用，在早期快速缓解晒伤皮肤初期症状。脂肪干细胞外泌体和载药脂质体相复配后能在快速减轻皮肤灼热肿痛症状的同时提供抗氧化、清除自由基、消炎抗敏的功效，即能够快速缓解晒伤初期皮肤症状，又能在晒伤后期促进皮肤细胞重建，显著减轻晒后细胞色素沉着。本发明用于晒后皮肤修复的气雾剂各组分相复配，起到协同增效的作用，显著缩短晒后修复时间，能使晒伤皮肤快速恢复，促进皮肤组织的代谢，清除氧自由基，使皮肤细胞含水量能够达到10～20％，皮肤恢复柔润、光滑、有弹性。

Claims (8)

1.一种用于晒后皮肤修复的气雾剂，其特征在于，所述气雾剂包括如下重量份的组分：脂肪干细胞外泌体0.1～1份、载药纳米脂质体10～15份、分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.05～0.15份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.01～0.05份、尿囊素0.5～1份、甘油5～10份和去离子水72.8～84.34份；
所述载药纳米脂质体含有质量比为65～70：20：10～15的蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇和药物组合物，所述药物组合物包括如下组分：茶多酚、虾青素、红没药醇、神经酰胺-3、维生素E和薄荷油；所述药物组合物中茶多酚、虾青素、红没药醇、神经酰胺-3、维生素E和薄荷油的质量比为1～3：1～2：1～3：1～3：1～2：1；
所述脂肪干细胞外泌体的制备方法包括如下步骤：
步骤1、获得脂肪干细胞：
取脂肪组织用PBS缓冲液冲洗3次后剪碎获得1mm3的碎块，加入0.1％胶原蛋白酶I和0.25％胰酶消化30～45min，然后静置分层后吸取上层脂肪细胞液，将所得脂肪细胞液加入等体积DMEM-F12培养基，10％胎牛血清终止消化，300×g离心10min，弃上清，在细胞沉淀中加入20mL无血清细胞培养基，37℃，5％CO2恒温培养48h后换液，之后每5天换液，观察到梭形细胞长出，细胞融合度达到70～80％时即可冻存得到脂肪干细胞；
所述脂肪组织取自健康人体抽脂术后的脂肪组织；
步骤2、脂肪干细胞的培养：
配制诱导培养基，所述诱导培养基以低糖DMEM培养基为基础，添加了如下含量的诱导剂：重组白蛋白50μg/mL、重组表皮生长因子20μg/mL、维生素C 20μg/mL、尼克酰胺8μg/mL、丙酮酸钠12μg/mL、成纤维细胞生长因子30μg/mL、IBMX 0.5μg/mL、维甲酸0.5μg/mL；
将步骤1获得的脂肪干细胞接种于诱导培养基中进行培养，接种量为50％，培养条件为37℃，5％CO2恒温培养48h，吸除培养基，加入低糖DMEM培养基培养48h后收集上清液；
步骤3、收集脂肪干细胞外泌体：
将步骤2收集得到的上清液300×g离心10min，收集上清，将所得上清2000×g离心10min，收集上清，将所得上清10000×g高速离心30min，收集上清，将所得上清14000×g超速离心90min，收集沉淀得到外泌体，用PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬，14000×g超速离心90min，收集沉淀，生理盐水重悬沉淀，冻存于-80℃备用。
2.根据权利要求1所述一种用于晒后皮肤修复的气雾剂，其特征在于，所述气雾剂包括如下重量份的组分：脂肪干细胞外泌体0.5份、载药纳米脂质体12份、分子量为1000～1400kDa的透明质酸0.10份、分子量为20～300kDa的透明质酸0.05份、尿囊素1份、甘油10份和去离子水76.35份。
3.根据权利要求1或2所述一种用于晒后皮肤修复的气雾剂，其特征在于，所述脂肪干细胞外泌体粒径为20～200nm。
4.一种如权利要求1-3任一所述用于晒后皮肤修复的气雾剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、提取脂肪干细胞外泌体：
将脂肪干细胞接种于诱导培养基中进行培养，接种量为50％，培养条件为37℃，5％CO2恒温培养48h，吸除培养基后，加入低糖DMEM培养基继续培养48h后收集上清液；所得上清液依次经300×g离心10min、2000×g离心10min、10000×g高速离心30min和14000×g超速离心90min，收集所述超速离心得到的沉淀即为脂肪干细胞外泌体；
步骤二、制备载药纳米脂质体：
根据配方将蛋黄磷脂酰胆碱、胆固醇、茶多酚、虾青素、红没药醇、神经酰胺-3、维生素E和薄荷油溶于无水乙醇，所有组分完全溶解后减压旋干获得脂膜，将所得脂膜再次用无水乙醇溶解并再次旋干得到二次脂膜，将所得二次脂膜用DEPC生理盐水溶解水化，对水化体系进行超声处理，使脂质体充分均匀分散在水化体系中，然后聚碳酸酯膜对水化体系进行过膜挤出得到载药纳米脂质体；
步骤三、制备气雾剂：
将步骤一提取得到的脂肪干细胞外泌体、步骤二制备的载药纳米脂质体、分子量为1000～1400kDa的透明质酸、分子量为20～300kDa的透明质酸、尿囊素与甘油混合均匀得到体系1，向体系1中加入去离子水中，混合均匀后得到用于晒后皮肤修复的气雾剂。
5.根据权利要求4所述用于晒后皮肤修复的气雾剂的制备方法，其特征在于，步骤一所述诱导培养基是以低糖DMEM培养基为基础，添加了如下含量的诱导剂：重组白蛋白50μg/mL、重组表皮生长因子20μg/mL、维生素C 20μg/mL、尼克酰胺8μg/mL、丙酮酸钠12μg/mL、成纤维细胞生长因子30μg/mL、IBMX 0.5μg/mL、维甲酸0.5μg/mL。
6.根据权利要求5所述用于晒后皮肤修复的气雾剂的制备方法，其特征在于，步骤一所述脂肪干细胞的获得方法为取脂肪组织用PBS缓冲液冲洗3次后剪碎获得1mm3的碎块，加入0.1％胶原蛋白酶I和0.25％胰酶消化30～45min，然后静置分层后吸取上层脂肪细胞液，将所得脂肪细胞液加入等体积DMEM-F12培养基，10％胎牛血清终止消化，300×g离心10min，弃上清，在细胞沉淀中加入20mL无血清细胞培养基，37℃，5％CO2恒温培养48h后换液，之后每5天换液，观察到梭形细胞长出，细胞融合度达到70～80％时即冻存得到脂肪干细胞。
7.根据权利要求6所述用于晒后皮肤修复的气雾剂的制备方法，其特征在于，步骤二所述超声处理条件为300W超声处理10min。
8.根据权利要求7所述用于晒后皮肤修复的气雾剂的制备方法，其特征在于，步骤二所述聚碳酸酯膜对水化体系进行过膜挤出是用孔径为200nm的聚碳酸酯膜对水化体系进行过膜挤出，反复挤出3～5次后，再用孔径为100nm的聚碳酸酯膜对体系进行过膜挤出，反复挤出2～3次后，得到粒径为100～150nm的载药纳米脂质体。
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