CN113614234A - 肝脏特异性诱导型启动子及其使用方法 - Google Patents

肝脏特异性诱导型启动子及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及诱导型调控元件、启动子和载体，尤其是基因治疗载体，及其使用方法。

Description

肝脏特异性诱导型启动子及其使用方法
技术领域
本发明涉及肝脏特异性诱导型启动子和载体，特别是包含它们的基因治疗载体，以及它们的使用方法。
背景技术
提供以下讨论是为了帮助读者理解本公开，并且不构成对现有技术的内容或相关性的任何承认。
肝微粒体细胞色素P450酶(CYP)的代谢在药物和环境污染物等外源化学物质的解毒中起着重要作用。通过暴露于异种化学物质诱导的基因转录是CYP的特征，这增加了生物体对毒性和致癌性的防御能力。基于对CYP2B基因的PB诱导的发现，PB已经成为诱导CYP2B基因的一大组结构和功能多样的异种化学物质的原型。在小鼠Cyp2b10和大鼠CYP2B1中鉴定出PB响应增强子模块(PBREM)为51bp元件，在大鼠CYP2B2中鉴定出几乎相同的DNA元件。在人类中也发现了PBREM序列，它与CYP2B6相关。核受体异二聚体CAR-RXR已被确定为PBREM的反式激活子。(参见Negishi et al.,“The Repressed Nuclear Receptor CAR Respondsto Phenobarbital in Activating the Human CYP2B6 Gene”；J.Biol.Chem 1999,274:6043-6046)。
在包括基因治疗在内的许多领域中，期望提供能够驱动基因表达的调节核酸序列，以在期望的细胞、组织或器官中产生蛋白质或核酸表达产物。
肝脏中的表达是特别令人感兴趣的，因为它涉及身体中广泛的基本功能，包括参与新陈代谢的许多蛋白质的合成、止血和防止感染。鉴于许多疾病与肝脏中基因表达的破坏有关，人们对开发允许转基因在肝脏中表达以产生治疗性表达产物的基因治疗策略非常感兴趣。与基因异常表达相关的肝脏疾病的例子包括血友病(包括血友病A或B)、家族性高胆固醇血症、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症、α-抗胰蛋白酶缺乏症、肝炎病毒感染、非病毒性肝炎、肝癌和各种其他肝脏疾病(如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和与酒精相关的肝脏疾病(ARLD)。
使用基因治疗治疗肝病的一个重大挑战是提供肝脏特异性(也称为肝特异性)治疗基因表达的能力。已知通过将DNA或病毒载体注射到肝实质、肝动脉或门静脉来靶向哺乳动物肝细胞。据报道，腺病毒载体主要针对小鼠的肝脏。然而，它们也会感染其他组织，特别是肺和骨骼肌，导致“脱靶”效应。某些形式的腺相关病毒载体(AAV)或慢病毒载体优先转导肝细胞，但也会出现脱靶效应。
因此，需要提供以肝脏特异性方式调节基因表达的系统。理想情况下，这种系统对肝脏具有高度特异性(从而避免或最小化非靶组织中的脱靶表达)，并且还功能强大，即它们驱动肝脏中的高表达水平。已经提出使用顺式作用调节元件来提供特异性和活性。典型地，这涉及顺式调节增强子序列，即以顺式作用增加启动子活性的核酸序列。增强子通常是活性的，不管它们的方向如何，在某些情况下，它们可以在离启动子几千个碱基的距离上起作用，尽管它们通常在离启动子更近时也起作用。
还希望提供基因表达的诱导系统，从而可以根据需要诱导基因表达。诱导性是指在需要时可以诱导治疗性基因表达产物的表达。此外，如果诱导是剂量依赖性的，那么治疗性基因表达产物的表达水平可以通过调节施用的诱导剂的量来调节。
因此，在许多情况下需要调控序列来控制基因表达，尤其是在基因治疗等的治疗性基因表达中。特别是，需要提供诱导型基因表达的调节序列。在肝脏中提供诱导型基因表达的调节序列尤其令人感兴趣。
发明内容
在第一方面，本发明提供了包含表达盒的基因治疗载体，该表达盒包含可操作地连接到基因的合成肝特异性诱导型启动子，该合成肝特异性诱导型启动子包含能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的顺式调节元件(CRE)。
组成型雄甾烷受体(CAR)是核受体超家族的成员，是异生物质和内生物质代谢的关键调节因子。与大多数核受体不同，CAR在缺乏配体的情况下具有组成型活性，并受激动剂和反向激动剂的调节。活化导致CAR从细胞质转移到细胞核中，在那里所述蛋白质可以结合到特定的DNA位点(称为反应元件)。结合既作为单体发生，又与类视黄醇X受体(RXR)一起发生，导致靶基因转录的激活或抑制。
类视黄醇X受体(RXR)是核受体超家族的成员，由9-顺式视黄酸和9-顺式-13,14-二氢-视黄酸激活。
当CAR被激活时(通过直接或间接激活)，它转移到细胞核，在那里CAR和RXR形成异二聚体(本文称为“CAR-RXR异二聚体”或“CAR-RXR”)，该异二聚体可以结合到包含适当靶序列的激活基因。
如上所述，CAR-RXR通过所谓的PB响应增强子模块(PBREM)结合并诱导靶基因。因此，在本发明的一些优选实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包含PBREM元件或其功能变体。
小鼠PBREM序列见SEQ ID NO:1。人类PBREM序列见SEQ ID NO:2。在本发明的一些实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的功能变体，或由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、或SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的功能变体组成。因此，在一些实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包含PBREM元件或其功能变体或由PBREM元件或其功能变体组成。
小鼠和人PBREM元件的序列和比对如下所示，所谓的NR1基序用下划线表示，所述NH1基序用斜体表示，所述NR2基序用粗体表示(SEQ ID NO显示在括号中):
Figure BDA0003269993130000031
PBREM是一种51-bp的DNA诱导型增强子，由位于NF1结合位点两侧的两个核受体DR4基序(NR1和NR2)组成。从该比对中可以看出，小鼠和人类PBREM之间的NR1基序具有非常高的序列保守性。人PBREM的16-bp NR1基序与小鼠NR1基序仅1个碱基不同，使得NR1成为人和小鼠PBREM元件之间最保守的序列。文献中提出NR1序列是CAR-RXR异二聚体的结合位点，其余序列部分或完全冗余。NR1的三重重复在Sueyoshi,et al.(J.BIOL.CHEM.Vol.274,10,pp.6043-6046,1999)中被证明是保持和诱导的。然而，据信NR1以外的部分可能在使PBREM元件更具特异性和诱导性方面发挥作用(例如，减少背景、组成型表达和允许更大程度的诱导)。
因此，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE适当地包含至少一个NR1基序。合适地，NR1基序包含序列TGTACT-X-TGACC[C/T](SEQ ID NO:#)或由序列TGTACT-X-TGACC[C/T](SEQ ID NO:#)组成，其中X代表长度为3-6个核苷酸(优选长度为4-5个核苷酸，合适的长度为4个核苷酸)的任何序列。在一些优选实施方案中，X包含序列TTCC，并且合适地包含序列TTCC或TTTCC，或由序列TTCC或TTTCC组成。当核苷酸显示在方括号内时，表示方括号内指示的核苷酸之一存在于该位置。
在一些实施方案中，NR1基序包含序列TGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO:20)(例如，TGTACTTTCCTGACCT(SEQ ID NO:3)或TGTACTTTCCTGACCC(SEQ ID NO:4))或与序列TGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO:20)在不超过2个、优选不超过1个核苷酸位置处不同的序列，或由其组成。优选地，PBREM元件的功能变体包含序列CTGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO:21)(例如，CTGTACTTTCCTGACC[T/C](SEQ ID NO:22)，即CTGTACTTTCCTGACCT(SEQ ID NO:23)或CTGTACTTTCCTGACCC(SEQ ID NO:24))，或与序列SEQ ID NO:21在不超过2个，优选不超过1个核苷酸位置处不同的序列；该序列包括人和小鼠PBREM中位于NR1序列5’的保守C，如上所示。合适地，PBREM序列的功能变体包含序列NCTGTACTTTCCTGACCNTG(SEQ ID NO:25)(例如，[T/A]CTGTACTTTCCTGACC[C/T]TG(SEQ ID NO:26)、TCTGTACTTTCCTGACCTTG(SEQ IDNO:27)或ACTGTACTTTCCTGACCCTG(SEQ ID NO:28))，或与序列SEQ ID NO:25在不超过2个，优选不超过1个核苷酸位置处不同的序列；如上所述，该序列包括位于人和小鼠PBREM NR1序列5’和3’的两个核苷酸。当N存在于本文的核酸序列中时，它代表任何核苷酸。当核苷酸显示在方括号内时，表示方括号内指示的核苷酸之一存在于该位置。
在一些实施方案中，PBREM元件的功能变体合适地包含两个或更多个，合适地三个或更多个，可操作连接的含NR1基序的序列。
因此，在一些实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE合适地包含两个或更多个，合适地三个或更多个，可操作连接的NR1基序。在一些实施方案中，可以提供彼此相邻(例如串联)的NR1基序，并且它们可以彼此紧邻或者被间隔子分开。因此，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE合适地包含一般结构NR1-S-NR1，其中NR1代表本文所讨论的任何NR1基序，并且S代表任选的间隔子。当存在间隔子时，它可以具有任何序列并且具有任何合适的长度，例如长度为2至50、3至40、4至30、5至20、6至10、7至9或8个核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包含PBREM序列的功能变体或由PBREM序列的功能变体组成，所述PBREM序列的功能变体包含以下序列之一:
-[TGTACTTTCCTGACCN-S-]n(SEQ ID NO:29)；
-[CTGTACTTTCCTGACCN-S-]n(SEQ ID NO:30)；
-[NCTGTACTTTCCTGACCNTG-S-]n(SEQ ID NO:31),
其中S是任选的间隔子，n是1-5，任选2-4，合适的是3。因此，PBREM序列的功能变体可以包含含NR1基序序列的多聚体。上面讨论了各种优选的NR1基序，它们当然可以用在该实施方案中。在一些实施方案中，n为1至10、1至6或2至4。在本发明的一些实施方案中，n是3。
在一些优选的实施方案中，间隔子存在于相邻的含NR1基序的序列之间。当存在间隔子时，它可以是任何合适的长度，例如长度为2至50、3至40、4至30、5至20、6至10、7至9、或8个核苷酸。
在本发明的一些实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包含PBREM序列的功能变体或由PBREM序列的功能变体组成，所述PBREM序列的功能变体包含以下序列之一:
-TGTACTTTCCTGACCN-S-TGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO:32)；
-TGTACTTTCCTGACCN-S-TGTACTTTCCTGACCN-S-TGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO:33)；
-CTGTACTTTCCTGACCN-S-CTGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO:34)；
-CTGTACTTTCCTGACCN-S-CTGTACTTTCCTGACCN-S-CTGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO:35)；
-NCTGTACTTTCCTGACCNTG-S-NCTGTACTTTCCTGACCNTG(SEQ ID NO:36)；和
-NCTGTACTTTCCTGACCNTG-S-NCTGTACTTTCCTGACCNTG-S-NCTGTACTTTCCTGACCNTG(SEQ ID NO:37),
其中S是任选的间隔子。当存在间隔子时，它可以是任何合适的长度，例如长度为2至50、3至40、4至30、5至20、6至10、7至9或8个核苷酸。上面讨论了各种优选的NR1基序，它们当然可以用在该实施方案中。
在本发明的一些实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包含PBREM序列的功能变体或由PBREM序列的功能变体组成，所述PBREM序列的功能变体合适地包含以下序列之一:
-TCTGTACTTTCCTGACCTTG-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTG-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTG(SEQ ID NO:38)；或
-ACTGTACTTTCCTGACCCTG-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTG-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTG(SEQ ID NO:39),
其中如上所述，S是任选的间隔子。
在一些情况下，间隔子可以具有序列GATCGATC(SEQ ID NO:40)，但是可以使用任何其他合适的间隔子序列。
在本发明的其他实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包括NR1元件、NF1元件和NR2元件中的每一种。合适地，它们以NR1-NF1-NR2的顺序存在。NR1元件适当地包含如上所述的序列或由如上所述的序列组成。NF1元件合适地包含序列TGGCACAGTGCCA(SEQ ID NO:55)或TGAAGAGGTGGCA(SEQ ID NO:56)、或与SEQ ID NO:55或56相差7个或更少核苷酸(例如6、5、4、3、2或1个核苷酸)的序列，或者由序列TGGCACAGTGCCA(SEQ ID NO:55)或TGAAGAGGTGGCA(SEQ ID NO:56)、或与SEQ ID NO:55或56相差7个或更少核苷酸(例如6、5、4、3、2或1个核苷酸)的序列组成。NR2元件适当地包含序列TCAACTTGCCTGACAC(SEQ ID NO:57)或TGGACTTTCCTGAACC(SEQ ID NO:58)、或与SEQ ID NO:57或58相差5个或更少核苷酸(例如4、3、2或1个核苷酸)的序列，或者由序列TCAACTTGCCTGACAC(SEQ ID NO:57)或TGGACTTTCCTGAACC(SEQ ID NO:58)、或与SEQ ID NO:57或58相差5个或更少核苷酸(例如4、3、2或1个核苷酸)的序列组成。
在本发明的一些实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包含PBREM序列的功能变体或由PBREM序列的功能变体组成，所述PBREM序列的功能变体包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少60％相同的序列，优选与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的序列。小鼠PBREM(SEQ ID NO:1)和人PBREM(SEQ ID NO:2)在全长(即51个核苷酸)上有71％的同一性。小鼠PBREM在人类细胞中保持功能，而人类PBREM在小鼠细胞中保持功能。因此，至少可以容忍跨PBREM元件的这种总体序列差异水平。
然而，如上所述，在NR1基序中存在非常高水平的保守性，因此通常优选PBREM序列的功能变体包含与序列TCTGTACTTTCCTGACCTTG(SEQ ID NO:27)或ACTGTACTTTCCTGACCC TG(SEQ ID NO:28)至少90％相同、优选至少95％相同、更优选完全相同的序列，以及与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的其余部分至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的序列。优选地，总序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同。
因此，在一个优选实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包含PBREM序列的功能变体或由PBREM序列的功能变体组成，所述PBREM序列的功能变体包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2在跨越核苷酸3至18的区域(优选跨越核苷酸1至20的区域)中至少90％、优选至少95％、更优选完全相同的序列，以及与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的其余部分至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的序列(即核苷酸1、2和19至51，或核苷酸21至51)。核苷酸当然参照SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2编号。优选地，总序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同。
在本发明的一些优选实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包含以下序列或由以下序列组成:
NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN(SEQ ID NO:41)，或与其至少90％，优选9.5％，更优选99％相同的序列。在这种情况下，同一性是相对于特定定义的核苷酸而不是未定义的“Ns”来计算的。PBREM序列的功能变体，其中一个或多个被鉴定为N的核苷酸被删除，被特别考虑作为本发明的此类实施方案的一部分，例如其中多达7、6、5、4、3、2或1个被标记为N的核苷酸被删除。此外，插入一个或多个核苷酸的PBREM序列的功能变体被特别考虑作为本发明这些实施方案的一部分，例如插入多达7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。作为一个具体的例子，来自CYP2B2基因的大鼠PBREM元件包括插入在10-11位的T和C之间的T，即在PBREM元件的NR1内。NR1基序以外区域核苷酸的替换、缺失或插入可能是良好耐受的。
在某些情况下，更类似于野生型小鼠或人PBREM元件(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)的PBREM序列的功能变体是优选的，因为据信它们可能表现出特别理想的低背景表达和高诱导水平的特性。当本发明载体中提供的基因的背景表达保持最少时，即当不发生表达的诱导时，这种性质通常是理想的。
在本发明的一些实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包含来自两种或更多种不同物种(合适地来自两种或更多种不同属的物种(例如两种不同的哺乳动物))中的每一种的PBREM元件的一部分或由其组成。这种元件可以被称为“杂合PBREM元件”。杂合PBREM元件通常包含野生型PBREM元件的所有基序(即NR1、NF1和NR2基序)，但这些基序来自两种或更多种不同的物种。在一些实施方案中，杂合PBREM元件包括来自第一物种的一部分(例如，NR1、NF1和NR2基序)，以及来自第二物种的相应部分(例如，相应的NR1、NF1和NR2基序)。作为非限制性的例子，杂合PBREM元件可以包括灵长类(例如人类)和啮齿类(例如小鼠)PBREM元件的部分(例如NR1、NF1和NR2基序)。例如，杂合PBREM元件可以包含来自灵长类动物(例如人类)的NR1基序和来自啮齿类动物(例如小鼠)的NR2基序，或者来自啮齿类动物(例如小鼠)的NR1基序和来自灵长类动物(例如人类)的NR2基序。灵长类或啮齿类动物的NR1和NR2基序也可以与相应物种的NF1基序结合。
在一些实施方案中，杂合PBREM元件包含以下PBREM基序的组合之一:hNR1-mNF1-hNR2、hNR1-mNF1-mNR2、mNR1-hNF1-mNR2或mNR1-hNF1-hNR2(其中“h”表示人类基序，并且m表示小鼠基序)。示例性的杂合PBREM元件序列在表3的SEQ ID No:61至64中加下划线；当然可以使用这些序列的功能变体，例如与SEQ ID No:61至64中划线的杂合PBREM元件序列具有60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列，任选地在NR1基序中具有更高水平的同一性，如上所述。
如上所述，并且不希望被理论所束缚，通过PBREM元件或其变体诱导基因表达被认为依赖于CAR-RXR异二聚体与其的结合。能够被CAR-RXR异二聚体(例如PBREM元件的变体)结合和激活的任何给定CRE如所期望地起作用的能力，即以与野生型小鼠或人类PBREM元件相同的方式被诱导的能力，尽管不一定达到相同的程度，可以容易地通过实验确定。例如，变体CRE可以被插入到如下实施例所述的构建体中来代替SEQ ID NO:1，并且当包含SEQ IDNO:1时，该构建体被诱导的能力可以被比较。例如，如实施例2中所述，可以提供变体CRE来代替PB1-MinTK构建体中的SEQ ID NO:1，并在肝细胞，优选原代肝细胞中进行测试，例如通过1μM CITCO诱导的AXOL assay-ready expanded(ARE)肝细胞(Axol,ax3701)。或者，如实施例4所述，可以将变体插入到pAAV-PB1-MinTk构建体中。或者，可以使用在Sueyoshi,etal.(J.BIOL.CHEM.Vol.274,10,pp.6043-6046,1999)中使用的实验方法，即可以在含有萤火虫荧光素酶报告基因(Promega)的pGL3-基础载体中的tk启动子(BglII位点)前克隆相关推定的PBREM变体序列，得到PBREM VARIANT-tk-荧光素酶和报告基因质粒。通常，当与包含野生型PBREM元件的等同构建体(例如SEQ ID NO:1)相比时，CRE的功能变体应提供至少50％、优选75％、更优选80％、85％、90％或95％的诱导性水平(根据诱导导致的表达倍数增加来测量，即，在诱导时报道的基因表达增加2倍被认为是诱导性增加4倍的50％)。通常，期望功能变体应提供至少2倍的诱导，更优选3倍、4倍、5倍、6倍或7倍的诱导，当在上述PB1-MinTK构建体中代替小鼠野生型PBREM提供并在肝细胞，优选原代肝细胞中测试时，例如通过1μM CITCO诱导的AXOL assay-ready expanded(ARE)肝细胞(AXOL，ax3701)，如下实施例2所述。与包含野生型小鼠PBREM元件的等同构建体(例如，再次在PB1-MinTK构建体中并在ARE肝细胞中测试)相比，功能变体优选导致不超过三倍、优选不超过两倍、更优选不超过1.5倍的背景表达水平。
应当注意，PBREM元件或其功能变体可以以任一方向存在。因此，上述PBREM元件的反向互补构成了本发明的一部分。值得注意的是，与小鼠PBREM元件相比，人PBREM元件自然以相反的方向存在，并且在Sueyoshi,et al.(J.BIOL.CHEM.Vol.274,10,pp.6043-6046,1999)的研究中，人PBREM元件被证明在“相反”方向(即与小鼠PBREM相同的方向)保持功能。
在本发明的一些实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子适当地包含多个CRE，每个CRE能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活。因此，在一些实施方案中，本发明提供了合成肝特异性诱导型启动子，其包含CRE的多聚体，每个多聚体能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活。从另一个角度来看，合成肝特异性诱导型启动子适当地包含顺式调节模块(CRM)，该模块包含多个CRE，每个CRE能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活。能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的CRE可以是相同的，也可以是彼此不同的。
在这样的实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子合适地包含2-10个CRE，每个CRE能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活。诱导型启动子合适地包含2-7个CRE，2-5个CRE，2-4个CRE，任选地2或3个CRE，并且在一些实施方案中，优选有3个CRE各自能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活。
如上所述，能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的CRE优选是PBREM元件或其功能变体。因此，在一个优选的实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子合适地包含2至5个，还更优选2至4个，还更优选3个包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其功能变体的PBREM元件。上面详细讨论了各种PBREM元件及其功能变体。
在本发明的一些优选实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子包含2至4个、任选2或3个可操作连接的CRE拷贝，所述CRE拷贝包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的功能变体。
能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的CRE可以被间隔子序列分开。间隔子可以具有任何合适的长度，例如2至100个核苷酸、3至50个核苷酸、5至30个核苷酸和10至25个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子的长度是5的倍数。已经发现长度约为20个核苷酸的间隔子是合适的(例如长度为18-22个核苷酸)。
在本发明的一些优选实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子包含CRM，该CRM包含以下序列之一或由以下序列之一组成:
-NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN-S-NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN(SEQ ID NO:42)；或
-NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN-S-NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN-S-NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN(SEQ ID NO:43),
其中S是任选的间隔子。间隔子分隔相邻的PBREM元件或其功能变体。间隔子的选择如上所述。在一些实施方案中，间隔子的长度约为20个核苷酸。包含与PBREM元件NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN(SEQ ID NO：41)至少90％、优选95％、更优选99％相同的序列的变体也构成本发明的一部分。在这种情况下，同一性是相对于特定定义的核苷酸而不是未定义的“Ns”来计算的。PBREM序列的功能变体，其中一个或多个被鉴定为N的核苷酸被删除，被特别考虑作为本发明的此类实施方案的一部分，例如其中多达7、6、5、4、3、2或1个被标记为N的核苷酸被删除。此外，插入一个或多个核苷酸的PBREM序列的功能变体被特别考虑作为本发明这些实施方案的一部分，例如插入多达7、6、5、4、3、2或1个核苷酸。作为一个具体的例子，来自CYP2B2基因的大鼠PBREM元件包括插入在10-11位的T和C之间的T，即在PBREM元件的NR1内。NR1基序以外区域核苷酸的替换、缺失或插入可能是良好耐受的。
在本发明的一些优选实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子包含CRM，该CRM包含以下序列之一或由以下序列之一组成:
-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC(SEQ ID NO:44)；
-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC(SEQ ID NO:45)；
-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA(SEQ ID NO:46)；或
-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA(SEQ ID NO:47),
其中S是任选的间隔子。间隔子的选择如上所述。在一些实施方案中，间隔子的长度约为20个核苷酸。
本发明的合成肝特异性诱导型启动子适宜地不包含或仅包含最小的将导致组成型表达或在非肝细胞(或者视情况而定，在不表达CAR和RXR的细胞中)中表达的核酸序列。因此，背景表达和在非肝细胞(或不表达CAR和RXR的细胞)中的表达被最小化或完全避免。
合成肝特异性诱导型启动子通常包含CRE，该CRE能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活，该异二聚体可操作地连接到最小启动子或近端启动子，优选最小启动子。当使用近端启动子时，它优选是肝脏特异性的。一般来说，最小启动子是优选的，因为近端启动子倾向于驱动至少某种程度的背景表达。然而，在某些情况下可能需要一定量的背景表达。
最小启动子可以是任何合适的最小启动子。广泛的最小启动子在本领域是已知的。合适的最小启动子包括但不限于HSV胸苷激酶最小启动子(MinTK)、CMV最小启动子(CMVmp)和SV40最小启动子(SV40mp)。最小启动子可以是合成的最小启动子。
在本发明的一些优选实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子包含CRE，该CRE能够被CAR和RXR的异二聚体结合并激活，该异二聚体与MinTK最小启动子可操作地连接。这种组合已被证明提供了低背景表达和诱导性的理想组合。一些特别优选的实施方案包含两个或三个CRE，所述CRE能够被与MinTK可操作连接的CAR和RXR的异二聚体结合和激活，此类启动子具有特别强的诱导性和低背景。
在本发明的一些优选实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子包含CRE，该CRE能够被CAR和RXR的异二聚体结合并激活，该异二聚体与SV40最小启动子可操作地连接。这种组合已被证明提供了高水平的诱导性，尽管背景表达水平有所增加。一些特别优选的实施方案包含两个或三个CRE，所述CRE能够被与最小启动子可操作连接的CAR和RXR的异二聚体结合和激活，此类启动子具有特别强的诱导性。
在一些优选的实施方案中，能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的CRE通过间隔子序列与最小启动子或近端启动子分离。间隔子序列可以具有任何合适的长度。例如，能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的CRE(或者，当存在多个CRE时，最接近的CRE)和最小或最接近的启动子之间的间隔子可以具有10至200个核苷酸的长度。各种长度(例如包括20、46、80和100个核苷酸)的间隔子在下面列出的实施例中被成功使用。
在本发明的一些实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子包含根据SEQ ID NO:7至18中任一项的序列，或其任一项的功能变体。该功能变体合适地与SEQ ID NO:7至18中的任何一个至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同。如上所述，在对应于NR1基序的区域中，90％、95％或99％或更高的序列同一性是优选的。
在本发明的一些优选实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子包含根据SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的序列，或其任何一个的功能变体。该功能变体合适地与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同。如上所述，在对应于NR1基序的区域中，90％、95％或99％或更高的序列同一性是优选的。这些启动子分别包含1、2、3和4个与MinTK最小启动子相连的小鼠PBREM的拷贝。鉴于其在高诱导性和低背景表达水平方面的特别理想的性质，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11或其功能变体是本发明特别优选的实施方案。
在本发明的一些实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子包含根据SEQ ID NO:59至71中任一项的序列或其功能变体或由根据SEQ ID NO:59至71中任一项的序列或其功能变体组成。该功能变体合适地与SEQ ID NO:59至71中的任何一个至少60％、70％、80％、90％、95％或99％相同。如上所述，在对应于NR1基序的区域中，90％、95％或99％或更高的序列同一性是优选的。
在本发明的一些优选实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子包含根据SEQ IDNO:68、69、70或71中任一项的序列，或其任一项的功能变体。该功能变体合适地与SEQ IDNO:60或61中的任何一个至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同。如上所述，在对应于NR1基序的区域中，90％、95％或99％或更高的序列同一性是优选的。这些启动子包含2x MHM或3x人PBREM元件。
合适地，表达盒包含提供或编码一个或多个、优选所有核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子和转录终止序列的序列。合适地，表达盒包含编码转录后调节元件的核酸。合适地，表达盒包含编码polyA元件的核酸。
用于本发明的基因通常编码所需的基因表达产物，例如多肽(蛋白质)或RNA。该基因可以是全长的cDNA或基因组DNA序列，或其任何片段、亚单位或突变体，其具有至少一些期望的生物活性。
当基因编码蛋白质时，它基本上可以是任何类型的蛋白质。作为非限制性实例，所述蛋白质可以是酶、抗体或抗体片段(例如单克隆抗体)、病毒蛋白质(例如REP、CAP、REV、VSV-G或RD114)、治疗性蛋白质或毒性蛋白质(例如半胱天冬酶3、8或9)。
在本发明的一些优选实施方案中，基因编码治疗性表达产物，优选适用于治疗与肝脏相关的疾病或病症的治疗性蛋白质。这种基因可以被称为“治疗基因”。治疗性表达产物可以是蛋白质，例如可分泌的蛋白质，例如凝血因子(例如因子IX或因子VIII)、细胞因子、生长因子、抗体或纳米体、趋化因子、血浆因子、胰岛素、促红细胞生成素、脂蛋白脂酶或毒性蛋白质。或者，治疗表达产物可以是RNA，如siRNA或miRNA。设想用于本发明的治疗性表达产物(和编码它们的序列)的非穷尽列举包括：因子VIII、因子IX、因子VII、因子X、血管性血友病因子(von Willebrand factor)、促红细胞生成素(EPO)、干扰素-a、干扰素-B、干扰素-y、白细胞介素1(IL-1)、白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素3(IL-3)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素8(IL-8)、白细胞介素9(IL-9)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素11(IL-11)、白细胞介素12(IL-12)、趋化因子(C-X-C基序)配体5(CXCL5)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子(SCF)、角质细胞生长因子(KGF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、afamin(AFM)、a1-抗胰蛋白酶、a-半乳糖苷酶A、α-L-艾杜糖苷酶、ATP7b、鸟氨酸转氨甲酰酶、苯丙氨酸羟化酶、脂蛋白脂肪酶、芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)、ATPase肌浆/内质网Ca2+转运2(ATP2A2)、囊性纤维化跨膜传导调节因子(CTFR)、谷氨酸脱羧酶65kDa蛋白(GAD65)、谷氨酸脱羧酶67kDa蛋白(GAD67)、脂蛋白脂酶(LPL)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子(NTN)、卟啉原脱氨酶(PBGD)、肌聚糖α(SGCA)、可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFLT-1)、载脂蛋白、低密度脂蛋白受体(LDL-R)、白蛋白、葡萄糖-6-磷酸酶、抗体、纳米体、适配体、抗病毒显性-阴性蛋白质及其功能片段、亚单位或突变体。优选地，蛋白质是灵长类动物蛋白质，更优选人蛋白质。
感兴趣的蛋白或多肽可以是，例如，抗体、酶或其片段、病毒蛋白、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段、蛋白抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白缀合物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗和疫苗样蛋白或颗粒、加工酶、生长因子、激素和任何其他可用作激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途的多肽。根据一个优选实施方案，蛋白质是免疫球蛋白，优选抗体或抗体片段，最优选Fab或scFv抗体。根据另一个优选实施方案，蛋白质是病毒蛋白质。
在本发明的一些实施方案中，合成肝特异性表达盒包含用于基因编辑的基因，例如编码位点特异性核酸酶的基因，如巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)或聚集的规则间隔短回文重复系统(CRISPR-Cas)。合适地，位点特异性核酸酶适于通过切割(通常是位点特异性双链断裂)来编辑期望的目标基因组位点，然后通过非同源末端连接(NHEJ)或同源依赖修复(HDR)来修复切割，从而产生期望的编辑。编辑可以是功能失调基因的部分或完全修复，也可以是功能基因的敲落(knock-down)或敲除。
感兴趣的产物也可以是核酸，例如RNA，例如反义RNA、microRNA、siRNA、tRNA、rRNA、向导RNA或任何其他调节、治疗或其他有用的RNA。
在本发明的一些优选实施方案中，基因治疗载体是病毒载体，例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(AAV)载体，但是也考虑了其他形式的基因治疗载体。在一些优选实施方案中，载体是AAV载体。在一些优选的实施方案中，AAV具有适合肝转导的血清型。在一些实施方案中，AAV选自由如下组成的组:AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或其衍生物。为了克服AAV转导中的一个限制性步骤(即单链到双链AAV转化)，AAV载体适合用作自身互补的双链AAV载体(scAAV)，尽管单链AAV载体(ssAAV)的使用也包含在本文中。在本发明的一些实施方案中，AAV载体是嵌合的，意味着它包含来自至少两种AAV血清型的组分，例如AAV2的ITRs和AAV5的衣壳蛋白。
在本发明的一些实施方案中，载体是质粒。这种质粒可以包括多种其他功能性核酸序列，例如一个或多个选择性标记、一个或多个复制起点、多克隆位点等。
另一方面，本发明提供了一种表达盒，其包含与基因可操作连接的合成肝特异性诱导型启动子，该合成肝特异性诱导型启动子包含能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的CRE。上文在基因治疗载体的背景下讨论了各种合成诱导型启动子，它们可用于本发明的这一方面。因此，本发明还包括在基因治疗载体(上文详述)和其他情况下的表达盒中的如第一方面所述的合成肝特异性启动子。
在本发明的一些实施方案中，表达盒存在于真核细胞中表达的表达载体中。真核表达载体的例子包括，但不限于，可从Stratagene获得的pW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl和pSG；可从Amersham Pharmacia Biotech获得的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL；和可从Clontech获得的pCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito、pCMV-EGFP。许多其他载体是众所周知的，并且是商业上可获得的。对于哺乳动物细胞腺病毒载体，pSV和pCMV系列载体是特别众所周知的非限制性例子。有许多众所周知的酵母表达载体，包括但不限于酵母整合质粒(YIp)和酵母复制质粒(YRp)。对于植物，农杆菌的Ti质粒是一种典型的表达载体，植物病毒也提供合适的表达载体，例如烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯X病毒和豇豆花叶病毒。
在本发明这一方面的实施方案中，基因优选不是报告基因。合适地，该基因编码治疗性表达产物(例如如上所述)或在工业或研究中有用的另一种表达产物。因此，在本发明的一些优选实施方案中，表达盒用于表达不是报道蛋白(如荧光蛋白、发光蛋白或显色蛋白)的产物，并且优选用于表达治疗性表达产物。上面讨论了各种合适的表达产物。其他有用的表达产物对技术人员来说是显而易见的。
另一方面，本发明还提供了一种合成肝特异性诱导型启动子，其包含能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的CRE。在基因治疗载体的上下文中讨论的各种合成诱导型启动子被认为是本发明这一方面的实施方案。换句话说，上述各种启动子被认为是本发明这方面的实施方案，与它们是否在基因治疗载体的环境中无关。具体而言，公开了各种合成的肝特异性诱导型启动子，其具有有益的特性，并且在本领域中没有公开。这些启动子在基因治疗中有用，但是在其他环境中也有广泛的用途，例如细胞培养和生物加工，如下文进一步讨论的。
特别地，但不排他地，本发明这方面的实施方案包括合成肝特异性诱导型启动子，其包含根据SEQ ID NO:7至18中任一项的序列，或其任一项的功能变体。该功能变体合适地与SEQ ID NO:7至18中的任何一个至少60％、70％、80％、90％、95％或99％相同。如上所述，在对应于NR1基序的区域中，90％、95％或99％或更高的序列同一性是优选的。
在一些优选的实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子包含根据SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的序列，或其任何一个的功能变体。该功能变体合适地与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12中的任何一个至少60％、70％、80％、90％、95％或99％相同。这些启动子分别包含1、2、3和4个拷贝的小鼠PBREM，它们与MinTK最小启动子相连。
在本发明的一些实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子包含根据SEQ ID NO:59至71中任一项的序列或其功能变体或由根据SEQ ID NO:59至71中任一项的序列或其功能变体组成。该功能变体合适地与SEQ ID NO:59至71中的任何一个至少60％、70％、80％、90％、95％或99％相同。如上所述，在对应于NR1基序的区域中，90％、95％或99％或更高的序列同一性是优选的。
在本发明的一些优选实施方案中，合成肝特异性诱导型启动子包含根据SEQ IDNO:68、69、70或71中任一项的序列，或其任一项的功能变体。功能变体合适地与SEQ ID NO:68、69、70或71中的任一个至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同。如上所述，在对应于NR1基序的区域中90％、95％或99％或更高的序列同一性是优选的。这些启动子包含2x MHM或3x人类PBREM元件。
在本发明的另一方面，提供了一种CRE，其能够被包含PBREM元件的功能变体或由PBREM元件的功能变体组成的CAR-RXR异二聚体结合和激活。合适地，变体PBREM是PBREM非天然存在的变体，即它包含自然界中不存在的序列。例如，该变体不包含人、小鼠或大鼠PBREM元件的序列(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)。上文关于本发明的第一方面描述了能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的各种非天然CRE，并且这些提供了本方面的示例性实施方案。
在一些实施方案中，如上所述，本发明的CRE包含杂合PBREM元件或由杂合PBREM元件组成。作为非限制性实施例，杂合PBREM元件可以包括灵长类动物(例如人类)和啮齿类动物(例如小鼠)PBREM元件的部分。例如，杂合PBREM元件可以包含来自人的NR1基序和来自小鼠的NR2基序，或者来自小鼠的NR1基序和来自人的NR2基序。小鼠或人类NR1和NR2基序也可以与相应物种的NR1基序结合。在一些实施方案中，杂合PBREM元件包含以下PBREM基序的组合之一:hNR1-mNF1-hNR2、hNR1-mNF1-mNR2、mNR1-hNF1-mNR2或mNR1-hNF1-hNR2(其中“h”表示人类基序，m表示小鼠基序)。示例性的杂合PBREM元件序列在表3的SEQ ID NO:61至64中加下划线；当然可以使用这些序列的功能变体，例如与SEQ ID NO:61至64中加下划线的杂合PBREM元件序列具有60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包含以下序列之一或由以下序列之一组成:
ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAG(SEQ ID NO:#；人NR1x3)；
ACTGTACTTTCCTGACCCTGGCACAGTGCCACCATGGACTTTCCTGAACCA(SEQ ID NO:72；HMH杂合)；
ACTGTACTTTCCTGACCCTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC(SEQ ID NO:73；HMM杂合)；
TCTGTACTTTCCTGACCTTGAAGAGGTGGCACCATCAACTTGCCTGACACC(SEQ ID NO:74；MHM杂合)；或
TCTGTACTTTCCTGACCTTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA(SEQ ID NO:75；MHH杂合)，
或其功能变体。功能变体合适地包含与任何所述序列80％、85％、90％、95％或99％相同的序列。
在本发明的另一方面，提供了包含两个或更多个CRE的CRM，所述CRE能够被包含PBREM元件的功能变体或由PBREM元件的功能变体组成的CAR-RXR异二聚体结合和激活。包括两个或多个能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE的各种CRM在上文以及关于本发明的第一方面进行了描述，并且这些提供了本方面的示例性实施方案。在一些实施方案中，CRM包括至少一种如上所述的非天然CRE，例如至少一种杂合CRE。
在一些实施方案中，CRM包括以下序列之一:
TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC-S-CTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC(SEQ ID NO:76；2x鼠PBREM CREs)；
TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC(SEQ IDNO:77；3x鼠PBREM CREs)；
CTGTACTTTCCTGACCTTGAAGAGGTGGCACCATCAACTTGCCTGACACC-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTGAAGAGGTGGCACCATCAACTTGCCTGACACC(SEQ ID NO:78；2x MHM杂合CREs)；
ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA(SEQ ID NO:79；2x人PBREM CREs)；
ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA(SEQ ID NO:80；3x人PBREM CREs)；
或其任何功能变体。功能变体合适地包含与任何所述序列80％、90％、95％或99％相同的序列，并且其中S是任选的间隔子。当存在时，所述间隔子可以具有任何合适的长度，例如2至100个核苷酸、3至50个核苷酸、5至30个核苷酸和10至25个核苷酸。在一些实施方案中，提到的间隔子的长度是5的倍数。已经发现长度约为20个核苷酸的间隔子是合适的(例如长度为18-22个核苷酸)。
在一些实施方案中，CRM包括以下序列之一:
TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACCCATTACTCGCATCCATTCTCTCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC(SEQ ID NO:81；2x小鼠PBREM CREs)；
TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACCCATTACTCGCATCCATTCTCTCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACCGCACTGAAGGTCCTCAATCGTCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACCCTGACCTCCTGCCAGCAATATCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC(SEQ ID NO:82；3x小鼠PBREM)CTGTACTTTCCTGACCTTGAAGAGGTGGCACCATCAACTTGCCTGACACCCATTACTCGCATCCATTCTCTCTGTACTTTCCTGACCTTGAAGAGGTGGCACCATCAACTTGCCTGACACC(SEQ ID NO:83；2xMHM杂合)；
ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCACATTACTCGCATCCATTCTCACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA(SEQ ID NO:84；2x人PBREM)；或
ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCACATTACTCGCATCCATTCTCACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCAGCACTGAAGGTCCTCAATCGACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA(SEQ ID NO:85；3x人PBREM)，
或其任何功能变体。功能变体合适地包含与任何所述序列80％、90％、95％或99％相同的序列。
在一个实施方案中，本文提供的顺式调节元件、顺式调节模块或启动子或其变体可以增强或驱动基因在非肝脏或非肝脏来源的组织(例如脾、肌肉、心脏、肺和脑)中的表达。非肝组织中的基因表达可以是排他性的，或者除了在肝细胞中的表达之外。当基因的表达在非肝组织和肝组织中都被驱动时，非肝组织中的表达水平可以等于或大于肝组织中的表达水平。例如，本文提供的启动子或其变体可以驱动基因在肝脏和心脏中的同等表达。
在另一个方面，本发明提供了包含根据本发明的基因治疗载体的重组病毒颗粒(病毒粒子)。病毒粒子可以是例如AAV粒子、逆转录病毒粒子、慢病毒粒子或某种其他形式的基因治疗病毒粒子。
本发明的基因治疗载体或病毒体可以与药学上可接受的赋形剂(即一种或多种药学上可接受的载体物质和/或添加剂，例如缓冲剂、载体、赋形剂、稳定剂等)一起配制成药物组合物。药物组合物可以以试剂盒的形式提供。
因此，在另一方面，本发明提供了包含如上所述的基因治疗载体或病毒颗粒的药物组合物。本发明的基因治疗载体或病毒体可以与药学上可接受的赋形剂(即一种或多种药学上可接受的载体物质和/或添加剂，例如缓冲剂、载体、赋形剂、稳定剂等)一起配制成药物组合物。药物组合物可以以试剂盒的形式提供。
根据本发明的另一方面，提供了一种细胞，其包含根据本发明各个方面的基因治疗载体、表达盒、启动子、CRE或CRM。
合适的细胞是真核细胞。所述真核细胞可以合适地是真菌细胞(例如酵母细胞)、动物(后生动物)细胞(例如哺乳动物细胞)或植物细胞。或者，细胞可以是原核细胞。
在本发明的一些实施方案中，细胞是离体的，例如在细胞培养物中。在本发明的其他实施方案中，细胞可以是组织或多细胞生物的一部分。
在优选的实施方案中，细胞是肝细胞(肝细胞)，其可以是离体的或体内的。肝细胞可以是原代肝细胞或肝来源细胞系的细胞，例如永生化细胞系。该细胞可以存在于肝组织环境中(例如，在肝中)，或者可以从肝组织中分离，例如，它可以在细胞培养物中。合适的细胞是人类细胞。通常肝细胞同时表达CAR和RXR。然而，一些肝源性细胞系不表达CAR(例如Huh7细胞系)，在这种情况下，有必要提供外源性CAR。这可以通过向细胞提供合适的表达构建体来实现，该表达构建体包含编码CAR的核酸，该核酸可操作地连接到启动子，例如组成型活性启动子。合适的方法是本领域已知的，并在实施例中描述。
在一些实施方案中，该细胞已经被修饰为表达CAR和/或RXR。在这样的实施方案中，合适的细胞是通常不表达CAR、RXR或CAR和RXR的细胞。合适的细胞不是肝细胞。因此，在本发明的一些实施方案中，本发明的启动子、表达盒和载体用于非肝细胞，其通常(即，在其自然状态下)不表达CAR和/或RXR；因此本发明的启动子在这种细胞中通常不具有活性。然而，所述细胞已经被修饰，使得其能够表达CAR和RXR，因此启动子可以被诱导。作为非限制性实例，细胞可以是任何类型的动物原代细胞或动物细胞系。
根据本发明各个方面的基因治疗载体、表达盒、启动子、CRE或CRM可以被插入到细胞的基因组中，或者它可以存在于附加体载体中。
适用于本发明的细胞包括但不限于真核细胞(如酵母)、植物、昆虫或哺乳动物细胞。例如，所述细胞可以是任何类型的分化细胞，或者可以是卵母细胞、胚胎干细胞、造血干细胞或其他形式。在一些实施方案中，细胞是动物(后生动物)细胞(例如哺乳动物细胞)。在一些优选的实施方案中，细胞是肝细胞(例如Huh7细胞、HepaRG细胞、HEPG2细胞等；可从ATCC、DSMZ和其他来源获得各种肝细胞)。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是人、猿、鼠、大鼠、兔、仓鼠、山羊、牛、羊或猪细胞。一些生产感兴趣产品的细胞或“宿主细胞”是人、小鼠、大鼠、猴或啮齿动物细胞系。在一些实施方案中，仓鼠细胞是优选的，例如BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1、CHO-S和CHO-DG44细胞，或任何此类细胞系的衍生物/后代。在替代实施方案中，细胞可以是人类细胞。在一些优选的实施方案中，人细胞可以是人胚胎肾(HEK)细胞，优选HEK 293细胞。在本发明的另一个优选实施方案中，细胞可以是视网膜细胞，例如视网膜色素上皮细胞，例如ARPE-19(ATCC CRL-2302)。此外，鼠骨髓瘤细胞，优选NS0和Sp2/0细胞或任何此类细胞系的衍生物/后代也是众所周知的生物制药蛋白生产细胞系。可用于本发明的细胞系及其来源的非限制性实例总结于表1中。合适的宿主细胞可商购获得，例如，来自培养物保藏中心，如DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zeilkuituren GmbH,Braunschweig，德国)或美国类型培养物保藏中心(ATCC)。
对于生物加工应用，可能优选的是细胞在无血清条件下建立、适应和完全培养，并且任选地在不含任何动物来源的蛋白质/肽的培养基中培养。市售培养基，例如Ham's F12(Sigma,Deisenhofen,德国)、RPMI-1640(Sigma)、Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM；Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM；Sigma)、Iscove's Modified Dulbecco'sMedium(IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen,Carlsbad,CA)、CHO-S-SFMII(Invitrogen)、无血清CHO培养基(Sigma)、无蛋白CHO培养基(Sigma)、EX-CELL培养基(SAFC)、CDM4CHO和SFM4CHO(HyClone)是示例性的合适营养液。任何培养基都可以根据需要补充各种化合物，例如激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、胰岛素样生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁、磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷(如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其他等效能源、抗生素、微量元素。在本发明中，优选使用无血清培养基，但是补充有适量血清的培养基也可以用于培养宿主细胞。为了表达可选择基因的遗传修饰细胞的生长和选择，将合适的选择剂添加到培养基中。
细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞。在本发明的一些实施方案中，细胞可以是原核细胞；尽管原核细胞不具备与本发明相关的CAR/RXR系统，但原核细胞仍可用于生产载体或载体处理、运输或储存的其他步骤。
在一些实施方案中，细胞是用于生产病毒载体的包装或生产细胞。例如，细胞可以是用于生产AAV载体的包装或生产细胞。各种包装或生产细胞系是本领域已知的。在包装或生产细胞系中，优选本发明的启动子可操作地连接到病毒蛋白，例如Rep或Cap或其他病毒结构或非结构基因。
在本发明的另一方面，本发明的启动子可以与编码病毒蛋白的基因或RNA可操作地关联。病毒蛋白可以是结构蛋白或非结构蛋白。作为非限制性实例，病毒蛋白可以是AAV蛋白，例如Rep或Cap蛋白，或者它可以是病毒辅助蛋白，例如E1A、E1B、E2A或E4。在其他实施方案中，病毒蛋白可以是REV、VSV-G或RD114。
在本发明的另一方面，提供了根据本发明各个方面的基因治疗载体、表达盒、启动子、病毒体或药物组合物，用于治疗疾病，优选与异常基因表达相关的疾病，任选在肝脏中(例如遗传性肝病)。
肝脏中的表达是特别令人感兴趣的，因为它涉及身体中广泛的基本功能，包括参与新陈代谢的许多蛋白质的合成、止血和防止感染。鉴于许多疾病与肝脏中基因表达的破坏有关，人们对开发允许转基因在肝脏中表达以产生治疗性表达产物的基因治疗策略非常感兴趣。与异常基因表达相关的疾病包括但不限于血友病(包括血友病A或B)、家族性高胆固醇血症、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症、苯丙酮尿症、鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症、糖原累积病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、遗传性血色病、酪氨酸血症1型、精氨酸琥珀酸尿症、肝炎病毒感染、非病毒性肝炎、肝癌、遗传性胆汁淤积、威尔逊氏病和各种其他肝病(如非酒精性脂肪肝(NAFLD)和酒精相关的肝脏疾病(ARLD))。用于治疗血友病A或B代表本发明各个方面的优选实施方案。
另一方面，本发明提供了一种在细胞中，合适地在肝细胞中产生表达产物，合适地为治疗性表达产物的方法，该方法包括:
-提供包含表达盒的细胞，所述表达盒包含可操作地连接到基因的合成肝特异性诱导型启动子，该合成肝特异性诱导型启动子包含能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的顺式调节元件(CRE)；和
-给所述细胞施用诱导剂，所述诱导剂能够诱导与所述表达盒中的诱导型启动子可操作连接的基因的表达产物的表达。
该方法合适地包括将所述细胞维持在合适的条件下，以表达来自基因的表达产物。在培养中，这可以包括在合适的培养条件下温育细胞或包含细胞的组织。该细胞当然可以在体内，例如在受试者肝脏的一个或多个细胞中。因此，本发明的这一方面尤其提供了用于在细胞培养物中(例如在生物加工应用中)生产感兴趣的产品或表达治疗产物(例如在受试者中或离体)的方法。上文讨论了适用于这方面的各种细胞。
合适地，该方法包括将表达盒导入肝脏的步骤。多种转染肝细胞的方法是本领域公知的。转染肝细胞的优选方法是用包含合成肝特异性表达盒的病毒载体(例如AAV载体)转导细胞。用于本发明的各种载体的细节描述如下。
该方法可以包括收集或分离表达产物。收集或分离各种表达产物(例如蛋白质或核酸)的合适方法是技术人员熟知的。
在一些实施方案中，细胞是肝细胞。通常肝细胞同时表达CAR和RXR。然而，一些肝源性细胞系不表达CAR(例如Huh7细胞系)，在这种情况下，有必要提供外源性CAR。这可以通过提供合适的表达构建体以在细胞中表达CAR来实现，例如包含可操作地连接到合适启动子的编码CAR的核酸。用于在任何给定细胞中表达CAR的合适的表达载体和其他方法是本领域公知的。
CAR的自然表达一般局限于肝细胞。因此，在不表达CAR的细胞(这对于非肝细胞是典型的)，通常需要向细胞提供外源性CAR。如上所述，这可以通过提供合适的表达构建体以在细胞中表达CAR来实现，例如包含与合适的启动子可操作连接的编码CAR的核酸。用于在任何给定细胞中表达CAR的合适的表达载体和其他方法是本领域公知的。
用于本发明的诱导剂可以是任何适于诱导CAR活化和CAR-RXR异二聚体形成的试剂。这种诱导剂可以在存在表达盒的细胞中诱导来自PBREM元件的表达。现有技术中已知多种来自小鼠和人PBREM元件的表达诱导剂(例如，参见HONKAKOSKI,et al.,MolecularPharmacology,53:597-601(1998),和Cherian et al.“Small-molecule modulators ofthe constitutive androstane receptor”,Expert Opin Drug Metab Toxicol.2015July；11(7):1099–1114；Banerjee et al.“Targeting xenobiotic receptors PXR andCAR in human diseases”,Drug Discov.Today.2015 May；20(5):618–628；Omiecinski etal.,“Multi-species Analyses of Direct Activators of the ConstitutiveAndrostane Receptor”Toxicological Sciences,123(2),550–562(2011))。通常，这些诱导剂是CAR的活化配体。CAR的特点是对具有不同化学结构的各种内源性和外源性配体具有广泛的特异性，这使其成为异生传感器。Cherian等人的表1列出了各种物种中CAR激活剂的各种激活剂，它们可以在本发明的任何方面用作诱导剂。
例如，但不限于，诱导剂合适地包含选自以下列表的一种或多种试剂:
苯巴比妥(PB)；黄酮类化合物，例如黄酮、白杨素、黄芩素或高良姜素；1,4-双[2-(3,5-二氯吡啶氧基)]苯(TCPOBOP)；6-(4氯苯基)咪唑并[2,1-b][1,3]噻唑-5-甲醛-O-(3,4-二氯苄基)肟(CITCO)；对乙酰氨基酚；丁丙诺啡；苯妥英；卡马西平；丙戊酸；青蒿素及其衍生物；氯丙嗪；依法韦仑；奈韦拉平；利匹维林；依曲韦林；地西泮；环磷酰胺；异环磷酰胺；西利伐他汀；辛伐他汀；洛伐他汀；取代的磺酰胺；噻唑烷-4-酮；雌二醇；雌酮及其类似物；17α-乙炔基-3；17β-雌二醇(EE2)；脱氢表雄酮(DHEA)；5β-孕烷-3，20-二酮；己烯雌酚；银杏提取物；高良姜素；白杨素；黄芩素；二烯丙基硫化物；鞣花酸；白藜芦醇；角鲨烷素-1；白果内酯；三氯卡班；三氯生；二氯二苯三氯乙烷(DDT)；狄氏剂；甲氧氯；美托氟汀；氯菊酯；除虫菊素；砜虫啶；邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)；环丙唑醇；氟康唑；丙环唑；FL81；三对甲基苯基磷酸酯(TMPP)；UM104和UM145。
在一些优选的实施方案中，诱导剂是药物(药剂)，例如在至少一个国家(优选美国或欧盟成员)获得监管批准的用于人类或动物(优选人类)以治疗至少一种医学病症的药物。或者，可以优选诱导物在至少一个国家(优选美国或欧盟成员)具有公认无害(GRAS)状态。在一些优选的实施方案中，诱导剂包含一种或多种选自下列的试剂:
苯巴比妥；黄酮类化合物，如黄酮、白杨素、黄芩素或高良姜素；对乙酰氨基酚；丁丙诺啡；苯巴比妥；苯妥英；卡马西平；丙戊酸；青蒿素及其衍生物；氯丙嗪；依法韦仑；奈韦拉平；利匹维林；依曲韦林；地西泮；环磷酰胺；异环磷酰胺；西利伐他汀；辛伐他汀；洛伐他汀；取代的磺酰胺；和噻唑烷-4-酮。
这些化合物都是已知的药物或被认为对于用于人类是GRAS，因此通常可以用于诱导人类表达，具有适当的安全性。
在本发明的一些实施方案中，诱导剂是苯巴比妥。在一些其他实施方案中，诱导剂是CITCO或TCPOBOP。在一些其他实施方案中，诱导剂是类黄酮，例如黄酮。
诱导剂可以以任何合适的方式施用于细胞。例如，在细胞培养中，诱导剂可以添加到培养基中。当细胞在体内时，例如细胞在动物的肝脏中，诱导剂可以通过对动物的全身施用或通过对靶组织(例如肝脏)的局部施用而施用于细胞。本领域技术人员可以容易地确定任何给定诱导物的合适剂量率。因此，本领域技术人员可以容易地为任何诱导剂确定将诱导剂递送至细胞的合适方式和合适的使用浓度。在CITCO的情况下，在下面的实施例中已经证明对细胞施用0.5μM至3μM的浓度(例如大约1μM)适合于诱导表达。在TCPOBOP的情况下，在下面的实施例中已经证明对细胞施用50nM至150nM的浓度适合于诱导表达。在黄酮的情况下，在下面的实施例中已经证明对细胞施用30μM的浓度适合于诱导表达。然而，可以使用其他合适的浓度，并且技术人员可以确定给予患者的必要剂量。因此，在一些实施方案中，本发明考虑将包含表达盒的细胞暴露于0.1μM至15μM的CITCO以诱导表达，例如0.25μM至6μM，0.5μM至3μM。在一些实施方案中，本发明考虑将包含表达盒的细胞暴露于10nM或750nM的TCPOBOP以诱导表达，例如25nM至300nM，或50nM至150nM。在一些实施方案中，本发明考虑将包含表达盒的细胞暴露于6μM至150μM的黄酮以诱导表达，例如15至150μM，或25至35μM。
该方法可以适当地包括停止施用诱导剂。停止施用诱导剂将导致表达产物的表达至少减少。通常，表达产物的表达将随时间恢复到基线水平。
该方法可以合适地包括随时间改变施用于细胞的诱导剂的浓度。这可用于调节表达产物的表达水平。
在本发明的一些实施方案中，随着时间的推移，给予细胞的诱导剂的浓度是变化的，以便调节在受试者中提供的治疗性基因产物的剂量或改变细胞培养物中表达产物的产生。在对受试者进行治疗的情况下(在下文中更详细地讨论)，诱导剂的浓度可以响应于受试者状况的改变、受试者中生物标志物的水平或任何其他原因而变化。
在一些实施方案中，该方法包括给细胞施用抑制剂。抑制剂可以是任何适于抑制或减少CAR活化和CAR-RXR异二聚体形成的试剂。添加抑制剂可用于减少或消除表达产物的表达(即下调或关闭表达)。作为非限制性实例，二甲双胍是已知的CAR拮抗剂，其可用作抑制剂。此外，雄甾烷醇和雄甾烷醇的几种异构体，雄甾烷，已知是CAR的内源性拮抗剂，并且这些可以作为抑制剂施用。CAR的各种抑制剂在Cherian et al.“Small-moleculemodulators of the constitutive androstane receptor”,Expert Opin Drug MetabToxicol.2015 July；11(7):1099–1114(参见图1)中有所讨论，其公开了各种人、小鼠和大鼠CAR抑制剂。本领域技术人员当然可以确定适用于抑制或减少可用于本发明的CAR-RXR异二聚体形成的其他CAR(或RXR)抑制剂。本领域技术人员可以容易地确定任何给定抑制剂的合适剂量率。
另一方面，本发明提供了一种在肝细胞中表达治疗性转基因的方法，该方法包括将根据本发明的基因治疗载体导入肝细胞，然后给细胞施用诱导剂。合适的诱导剂如上所述。肝细胞可以是体内的，也可以是离体的。如上所述，给予细胞的诱导剂的浓度可以随时间变化。用于这方面的示例性治疗基因已经在上面讨论过。
对于本领域技术人员来说显而易见的是，根据本发明各个方面的基因治疗载体、表达盒、病毒体或药物组合物可用于基因治疗。因此，这种基因治疗载体、表达盒、病毒体或药物组合物在基因治疗中的应用构成了本发明的一部分。因此，本发明的一个方面提供了如本文所述的基因治疗载体、表达盒、病毒体或药物组合物，用于基因治疗，优选通过治疗基因的肝脏特异性表达的基因治疗，适用于治疗涉及肝脏中异常基因表达的疾病。
在另一方面，本发明提供了一种对有需要的受试者，优选人，进行基因治疗的方法，该方法包括:
-向受试者的肝脏中引入本发明的基因治疗载体、表达盒或病毒体，其包含编码治疗产物的基因；和
-给受试者施用诱导剂，使得治疗有效量的治疗产物在受试者中表达。
合适的治疗基因也在上面讨论过。上面也讨论了可以治疗的病症，包括但不限于血友病(包括血友病A或B)、家族性高胆固醇血症、鸟氨酸经氨甲酰化酶缺乏症、苯丙酮尿症、鸟氨酸经氨甲酰化酶缺乏症、糖原累积病、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、遗传性血色病、酪氨酸血症1型、精氨酰尿症、肝炎病毒感染、非病毒性肝炎、肝癌、遗传性胆汁淤积、威尔逊氏病和各种其他肝病(如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、酒精相关性肝病(ARLD)和溶酶体贮积症)。
该方法适当地包括在所述受试者的肝脏中表达治疗有效量的来自该基因的治疗产物。治疗产物可以在肝脏或受试者的其他部位具有治疗效果。例如，治疗产物可以释放到血流中。
上面列出了合适的诱导剂，以及诱导剂的施用方法。如上所述，诱导物的施用可以在一段时间后停止，例如在获得合适的治疗效果后。或者，给予受试者的诱导剂的量可以随时间变化。可以调节给予受试者的诱导剂的量，以获得所需量(剂量)的治疗产物的表达。因此，当临床需要增加治疗产物的量时(例如，由于受试者的反应不足)，给予受试者的诱导剂的量可以增加，反之亦然(例如，由于过度反应或不希望的副作用)。
在一些实施方案中，该方法可以包括以下步骤:
-确定在受试者中表达的治疗产物的量或评估受试者对治疗产物的反应；
a)当在受试者体内需要更高量的治疗产物时，增加施用于受试者的诱导剂的量，或
b)当在受试者体内需要更低量的治疗产物时，减少施用于受试者的诱导剂的量。
标准实验室技术可用于确定受试者体内治疗产物的量。
当考虑到给予受试者的诱导剂的量可能随时间变化时，当然应该理解诱导剂通常不会连续给予患者，而是通常在给定的时间间隔以给定的剂量水平给予。因此，本发明考虑通过调节剂量、调整剂量之间的时间间隔或两者来随着时间改变给予受试者的诱导剂的量。因此，例如，为了增加给予受试者的诱导剂的量，剂量可以增加，同时剂量之间的时间周期保持恒定，剂量可以保持恒定，同时剂量之间的时间周期减少，或者剂量可以增加，并且剂量之间的时间周期减少。为了减少给予受试者的诱导剂的量，可以在剂量之间的时间周期保持恒定的同时减少剂量，在剂量之间的时间周期减少的同时保持剂量恒定，或者可以减少剂量并增加剂量之间的时间周期。
替代地或附加地，该方法可以包括改变诱导剂以改变受试者中治疗产物的量。例如，弱诱导剂可以用强诱导剂代替，反之亦然。
该方法还可以包括，例如，如果受试者对诱导剂有不良反应，或者发现诱导剂对受试者无效，则改变诱导剂。
该方法还可以包括给受试者施用抑制剂。适用于本发明的合适的抑制剂已经在上面讨论过。可以加入抑制剂以减少或停止受试者体内治疗产物的产生。可以调节给予受试者的抑制剂的量，以获得所需量(剂量)的治疗产物的表达。
编码合适的治疗性基因产物的基因已在上面讨论过。然而，可以特别提及治疗性蛋白质，例如用于治疗血友病的因子VIII和IX。
该方法适当地包括给受试者施用根据本发明的载体或病毒体。合适的载体是病毒基因治疗载体，优选AAV载体。
在一些实施方案中，该方法包括全身性施用病毒基因治疗载体。全身施用可以是肠内(如口服、舌下和直肠)或胃肠外(如注射)。优选的注射途径包括静脉内、肌肉内、皮下、动脉内、关节内、鞘内和皮内注射。
在一些实施方案中，病毒基因治疗载体可以与一种或多种额外的治疗剂或一种或多种饱和剂同时或依次施用，所述饱和剂被设计成防止载体被网状内皮系统清除。
当载体是AAV载体时，载体的剂量可以是1x1010gc/kg至1x1015gc/kg或更高，合适的是1x1012gc/kg至1x1014gc/kg，合适的是5x1012gc/kg至5x1013gc/kg。
一般来说，需要的受试者将是哺乳动物，优选灵长类动物，更优选人类。典型地，有此需要的受试者将表现出疾病特有的症状。该方法通常包括通过表达治疗量的治疗产物来改善有需要的受试者表现出的症状。
用于体外和体内靶细胞中治疗性基因表达的基因治疗方案在本领域是众所周知的，在此不再详细讨论。简而言之，它们包括肌内注射、间质注射、气道滴注、应用于内皮、肝内实质和质粒DNA载体(裸的或在脂质体中)或病毒载体的静脉内或动脉内施用(例如肝内动脉、肝内静脉)。已经开发了各种装置来增强靶细胞对DNA的利用。虽然一种简单的方法是将靶细胞与含有相关载体的导管或可植入材料物理接触，但更复杂的方法可以使用喷射注射装置等。已经使用离体和体内程序将基因转移到哺乳动物肝细胞中。离体方法通常需要收获肝细胞，用合适的表达载体进行体外转导，然后将转导的肝细胞重新引入肝脏。体内基因转移是通过将DNA或病毒载体注射到肝实质、肝动脉或门静脉来实现的。
在本发明的另一方面，提供了根据本发明各个方面的合成诱导型启动子、合成表达盒、载体或病毒体在制备用于治疗本文提及的任何病况或疾病的药物组合物中的用途。
另一方面，本发明提供了一种生产表达产物的方法，该方法包括以下步骤:
(a)提供真核细胞群，优选动物细胞，更优选哺乳动物细胞，更优选肝细胞，所述真核细胞群包含表达盒，所述表达盒包含可操作地连接到基因的合成肝特异性诱导型启动子，所述合成肝特异性诱导型启动子包含能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的顺式调节元件(CRE)；
(b)培养所述细胞群；和
(c)给所述细胞施用诱导剂，所述诱导剂能够诱导与所述表达盒中的诱导型启动子可操作连接的基因的表达产物的表达；和
(d)回收表达产物。
该方法优选为生物加工方法，即使用活细胞获得所需表达产物的过程。上面讨论了优选的转基因及其编码的感兴趣的产物。表达产物可用于治疗、美容、研究或其他工业过程。适用于这方面的诱导剂和细胞已在上面讨论过。
步骤(b)通常包括将所述细胞群保持在适合细胞增殖的条件下。在步骤(c)中诱导时，这些条件通常使细胞准备好表达来自转基因的表达产物。本领域技术人员应该知道各种类型细胞的合适条件。因此，该方法合适地包括在步骤(c)处理所述细胞群以诱导表达之前，在适合细胞生长的条件下温育所述细胞群。
回收表达产物的步骤通常包括从所述细胞群中分离表达产物，并且在某些情况下从细胞培养基的其它组分中分离。该方法优选包括纯化表达产物的步骤。回收和/或纯化表达产物的合适方法在本领域是常规的，并且取决于表达产物的具体性质。
显而易见，本发明允许表达产物的生产延迟到细胞培养过程中的所需时间点。例如，这可以允许细胞群扩增，直到达到所需的细胞数量或浓度，或者达到所需的生长阶段。出于许多原因，这可能是所希望的，例如，在表达转基因之前，允许细胞在最佳条件下生长，表达转基因可能抑制生长。例如，在有毒蛋白质的情况下，可以避免有毒表达产物的产生，直到细胞培养系统处于所需阶段。一旦有毒蛋白质被表达，细胞当然会受到不利影响或被杀死。然而，即使对于无毒的表达产物，在将转基因的表达延迟到所需的时间点方面也可能有相当大的效率优势。
这些方法可以在任何合适的反应器中进行，包括但不限于搅拌罐、气升式反应器、纤维、微纤维、中空纤维、陶瓷基质、流化床、固定床和/或喷动床生物反应器。如本文所用，“反应器”可包括发酵罐或发酵单元，或任何其它反应容器，术语“反应器”可与“发酵罐”互换使用。例如，在一些方面，示例性生物反应器单元可以执行以下一项或多项或全部:营养物和/或碳源的供给、合适气体(例如氧气)的注入、发酵或细胞培养基的进出流、气相和液相的分离、温度的保持、氧气和CO2水平的保持、pH水平的保持、搅动(例如搅拌)和/或清洁/消毒。例如发酵单元的示例性反应器单元可以在该单元内包含多个反应器，例如该单元在每个单元中可以具有1至10个或更多个生物反应器。在各种实施方案中，生物反应器可适用于分批、半分批补料、分批补料、灌注和/或连续发酵过程。在一些实施方案中，生物反应器可以具有约100ml至约50,000升，优选10升或更高的体积。另外，合适的反应器可以是多用途的、单一用途的、一次性的或非一次性的，并且可以由任何合适的材料形成。美国专利公开号2013/0280797、2012/0077429、2011/0280797、2009/0305626和美国专利号8,298,054、7,629,167和5,656,491(以引用的方式整体并入本文)描述了可用于本发明的示例系统。
在本发明的一些优选实施方案中，该方法用于生产基因治疗病毒载体，例如rAAV病毒颗粒。在该实施方案中，细胞合适地是包装细胞或生产细胞，并且辅助功能之一在诱导型启动子的控制下。作为非限制性实例，Rep、Cap、E1A、E1B、E2A、E4和VA RNA基因可以置于诱导型启动子的控制之下。由于其毒性，控制Rep的表达特别有意义。因此，在本发明的另一个方面，提供了如本文所述的启动子在生产病毒基因治疗产物，优选病毒辅助蛋白，更优选Rep基因的方法中控制病毒蛋白表达的用途。
另一方面，本发明提供了一种反应器容器，其包含含有本发明细胞的细胞培养物和足以支持细胞生长的培养基。上文描述了适用于本发明的各种反应器。
在本发明的另一方面，提供了本发明的生物加工载体或细胞在用于制造目的产品(例如治疗产物)的生物加工方法中的用途。
附图说明
图1A显示了转染入Huh7细胞并用DMSO、50nM、150nM和250nM TCPOBOP处理后，来自PB1-MinTK构建体的荧光素酶表达的测量。
图1B显示了转染到Huh7细胞后来自PB1-MinTK构建体的荧光素酶表达的测量，其中Huh7细胞用CAR转染或未用CAR转染。
图1C显示了来自图1A的数据，表示为强病毒启动子CMV-IE的比率。图1C还显示，在没有CAR的情况下，没有荧光素酶表达。一个PBREM元件与MinTK启动子结合，驱动表达达到CMV-IE基因表达的最大40％。
图1D显示了转染到Huh7细胞中并用DMSO、0.5μM、1μM、2μM和3μM CITCO处理后，来自PB1-MinTK构建体的EPO表达的测量。该图还表明，添加CITCO不会改变启动子CMV-MP的EPO表达。
图2A显示了在转染入AXOL ARE-肝细胞并用DMSO(左)或1μM CITCO(右)处理后，来自PB1-MinTK、PB1-CMV-MP和PB1-SV40-MP构建体的荧光素酶表达的测量结果。
图2B显示了来自图2A的数据，表示为强病毒启动子CMV-IE的比率。
图3A显示了来自PB1-SV40、PB1-1-SV40、PB1-2-SV40和PB1-3-SV40构建体的荧光素酶表达，这些构建体分别含有1、2、3和4个PBREM元件。PBREM多聚体与SV40启动子的组合是可诱导的并提高了表达水平，但最多只能有3个PBREM元件。
图3B显示了来自PB1-CMV、PB1-1-CMV、PB1-2-CMV和PB1-3-CMV构建体的荧光素酶表达，这些构建体分别含有1、2、3和4个PBREM元件。PBREM多聚体与CMV启动子的组合是可诱导的并提高了表达水平，但最多只能有3个PBREM元件的拷贝。
图3C显示了来自PB1-MinTK、PB1-1-MinTK、PB1-2-MinTK和PB1-3-MinTK构建体的荧光素酶表达，这些构建体分别含有1、2、3和4个PBREM元件。PBREM多聚体与MinTK启动子的组合是可诱导的并提高了表达水平，但最多只能有3个PBREM元件的拷贝。
图4A显示了在AXOL ARE-肝细胞中的pGL4.10载体中的PB1-MinTK构建体、在Huh7细胞中的pAAV载体中的PB1-MinTK构建体和在AXOL ARE-肝细胞中的pAAV载体中的PB1-MinTK构建体的荧光素酶表达。从PB1-MinTK构建体诱导荧光素酶表达在不同载体和细胞类型中具有可比性。
图4B显示了在AXOL ARE-肝细胞中的pGL4.10载体中的PB1-2-MinTK构建体、在Huh7细胞中的pAAV载体中的PB1-2-MinTK构建体和在AXOL ARE-肝细胞中的pAAV载体中的PB1-2-MinTK构建体的荧光素酶表达。从PB1-2-MinTK构建体诱导荧光素酶表达在不同载体和细胞类型中具有可比性。
图5显示了PB1-MinTK和PB1-2-MinTK构建体在无CITCO、CITCO(1μM)诱导和CITCO撤除后AXOL ARE-肝细胞中pAAV载体的荧光素酶表达。
图6显示了鼠PBREM元件。
图7显示了pGL4.10载体的质粒图谱。
图8显示了PB1和PB1-2构建体的体内结果。a)诱导后0至48小时对代表性小鼠的生物发光成像，B)绘制生物发光图以显示不同的诱导动力学，C)对每个构建体观察到的折叠诱导(n＝5)。
图9显示了CITCO和黄酮对稳定表达人CAR的HUH7细胞系中PBREM杂合体的诱导的影响。
图10显示了CITCO和黄酮对原代肝细胞中PBREM杂合体的诱导的影响。
图11显示了CITCO和黄酮对稳定表达人CAR的Huh7细胞系中PBREM杂合体的多聚体的诱导的影响。
图12显示了CITCO和黄酮对原代肝细胞中PBREM杂合体的多聚体的诱导的影响。
具体实施方式
虽然下面详细讨论了本发明的各种实施方案的制备和使用，但是应当理解，本发明提供了许多可应用的发明概念，这些概念可以在各种各样的具体环境中体现。这里讨论的具体实施方案仅仅是制造和使用本发明的具体方式的说明，并不限定本发明的范围。
除非另有说明，本发明的实践将采用本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术在文献中有充分的解释。例如，见Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel,2000,Wileyand son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,(Sambrook et al,2001,Cold Spring Harbor,New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.,1984)；U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(Harries and Higginseds.1984)；Transcription and Translation(Hames and Higgins eds.1984)；Cultureof Animal Cells(Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press,1986)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；theseries,Methods in Enzymology(Abelson and Simon,eds.-in-chief,Academic Press,Inc.,New York),specifically,Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)and Vol.185,"GeneExpression Technology"(Goeddel,ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(Miller and Calos eds.,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular Biology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV(Weir andBlackwell,eds.,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)。
本文包括对本发明背景的讨论以解释本发明的上下文。这不应被视为承认所提及的任何材料在任何权利要求的优先权日之前已在任何国家公开、已知或成为公知常识的一部分。
在本公开中，各种出版物、专利和公开的专利说明书通过识别引文来引用。本说明书中引用的所有文件均通过引用整体并入本文。特别地，本文特别提及的此类文件的教导或章节通过引用并入。
为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。这里定义的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一”、“一个”和“该”的术语不旨在仅指单一实体，而是包括其特定示例可用于说明的一般类别。本文的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是它们的使用不限定本发明，除非在权利要求中概述。
术语“顺式调节元件”或“CRE”是本领域技术人员熟知的术语，是指能够调控或调节相邻基因(即顺式)转录的核酸序列，例如增强子、启动子、绝缘子或沉默子。CRE在它们调节的基因附近被发现。CRE通常通过与TF结合来调节基因转录，即它们包括TFBS。一个单一的TF可以结合许多CRE，从而控制许多基因的表达(多效性)。CRE通常但不总是位于它们所调控基因的转录起始位点(TSS)的上游。“增强子”是增强(即上调)与其可操作连接的基因转录的CRE，可在它们所调控的基因的上游、下游甚至内含子中发现。多个增强子可以协同作用来调节一个基因的转录。本文中的“沉默子”与结合被称为阻遏子的TF的CRE有关，阻遏子的作用是阻止或下调基因的转录。术语“沉默子”也可以指信使RNA的3’非翻译区中的一个区域，它结合抑制该mRNA分子翻译的蛋白质，但这种用法不同于它在描述CRE时的用法。通常，本发明的CRE是肝脏特异性诱导增强子。在本文中，优选CRE位于距转录起始位点1500个核苷酸或更少的位置，更优选距转录起始位点1000个核苷酸或更少，更优选距转录起始位点500个核苷酸或更少，合适的是距转录起始位点250、200、150或100个核苷酸或更少。本发明的CRE优选长度相对较短，优选长度为100个核苷酸或更少，例如长度可以为90、80、70、60个核苷酸或更少。
术语“顺式调控模块”或“CRM”是指由两个或多个CRE组成的功能模块；在本发明中，CRE通常是肝脏特异性诱导型增强子。因此，在本申请中，CRM典型地包括多个肝脏特异性诱导型CRE。典型地，CRM中的多个CRE一起作用(例如，附加地或协同地)以增强CRM可操作地连接的基因的转录。在CRM中，可以调整(即重新排序)、反转(即反转方向)和改变CRE中的间距。因此，本发明的CRM的功能变体包括参考CRM的变体，其中它们内的CRE已经被调整和/或反转，和/或CRE之间的间距已经被改变。
如本文所用，术语“启动子”指的是通常位于转录发生所需的待转录核酸序列上游的DNA区域，即启动转录的区域。启动子允许在其控制下适当激活或抑制编码序列的转录。启动子通常包含被多个转录因子识别和结合的特定序列。TF与启动子序列结合，导致RNA聚合酶的募集，这是一种从基因编码区合成RNA的酶。本领域已知许多启动子。本发明的诱导型启动子通常在被诱导前驱动低水平的表达，并且在诱导时，它们驱动显著更高水平的表达(例如，诱导后表达增加2、3、4、5、6、7、8、9或甚至10倍)。
本发明的启动子是合成启动子。本文使用的术语“合成启动子”涉及自然界中不存在的启动子。在本文中，它通常包含本发明的合成CRE和/或CRM，可操作地连接到最小(或核心)启动子或肝脏特异性近端启动子。本发明的CRE和/或CRM用于提供与启动子可操作连接的基因的诱导型肝脏特异性转录。合成启动子的部分可以是天然存在的(例如最小启动子或启动子中的一个或多个CRE)，但是合成启动子作为一个完整的实体不是天然存在的。
如本文所用，“最小启动子”(也称为“核心启动子”)是指一个短的DNA片段，其本身是无活性的或大部分是无活性的，但是当与其他转录调节元件结合时可以介导转录。最小启动子序列可以来自各种不同的来源，包括原核和真核基因。最小启动子的例子如上所述，包括多巴胺β-羟化酶基因最小启动子、巨细胞病毒(CMV)即早期基因最小启动子(CMV-MP)、SV40最小启动子(SV40-MP)和疱疹胸苷激酶最小启动子(MinTK)。然而，近端启动子可以是合成的。最小启动子通常包含转录起始位点(TSS)和直接上游的元件、RNA聚合酶II的结合位点和一般转录因子结合位点(通常是TATA盒)。
如本文所用，“近端启动子”是指最小启动子加上倾向于包含初级调节元件的基因上游的近端序列。它通常在TSS上游延伸约250个碱基对，并包括特定的TFBS。在目前的情况下，近端启动子合适地是天然存在的肝脏特异性近端启动子，其可以与本发明的一种或多种CRE或CRM结合。然而，近端启动子可以是合成的。
在本发明的上下文中，顺式调节元件、顺式调节模块、启动子或其他核酸序列的“功能变体”是参考序列的变体，其保持以与参考序列相同的方式起作用的能力，例如作为诱导型肝特异性顺式调节增强子元件、诱导型肝特异性顺式调节模块或诱导型肝特异性启动子。这种功能变体的替代术语包括“生物等价物”或“等价物”。
应当理解，如上所述，给定的顺式调控元件作为诱导型肝脏特异性增强子的能力主要取决于序列与CAR-RXR异源二聚体结合从而诱导表达的能力。因此，在大多数情况下，顺式调节元件的功能变体将包含CAR-RXR异二聚体的合适结合位点。CAR-RXR异二聚体被认为与野生型PBREM元件中的NR1基序结合，因此需要一种能起NR1基序作用的序列。在NR1基序中，小鼠和人PBREM之间存在高度的序列保守性，因此通常希望在任何功能变体中保持与NR1基序的高度同一性。野生型PBREM元件中的额外序列可能有助于最小化背景表达并提供高水平的诱导性，因此通常优选功能变体在这些其他区域中包含至少某种程度的序列同一性。因此，功能变体和参考序列之间的序列同一性水平可以是一个指标或保留的功能。顺式调节元件的NR1基序中的高水平序列同一性通常比其他区域(例如，NF1和NR2，它们对任何序列保守性的需求(如果有)要小得多)中的序列同一性更重要。
CAR-RXR异二聚体与给定CRE结合的能力可以通过本领域已知的任何相关方法来确定，包括但不限于，电动移动试验(EMSA)、结合试验、染色质免疫沉淀(ChIP)和ChIP测序(ChIP-seq)。在优选实施方案中，CAR-RXR异二聚体结合给定功能变体的能力由EMSA确定。实施EMSA的方法在本领域是众所周知的。合适的方法在上面引用的Sambrook等人的文章中描述。有很多描述这个过程的相关文章，例如Hellman和Fried,Nat Protoc.2007；2(8):1849–1861。
“肝脏特异性”或“肝脏特异性表达”是指与其他组织(如脾、肌肉、心脏、肺和脑)相比，顺式调节元件、顺式调节模块或启动子以优先或主要的方式增强或驱动基因在肝脏(或肝衍生细胞)中表达的能力。在本发明的情况下，表达应该是诱导型，即仅当施用合适的诱导剂(用于本发明所有方面的诱导剂已在上文讨论)时，基因的表达才会发生或显著增加。基因的表达可以是mRNA或蛋白质的形式。在优选实施方案中，肝脏特异性表达使得在其他(即非肝脏)组织或细胞中的表达可以忽略，即表达是高度肝脏特异性的。
技术人员可以容易地评估启动子作为肝脏特异性诱导型启动子起作用的能力。因此，技术人员可以容易地确定本文举例说明的特定启动子的任何变体是否仍然具有功能性(即它是如上定义的功能变体)。例如，待评估的任何给定CRE可以与最小启动子(例如位于MinTK上游)可操作地连接，并且测量顺式调节元件提供基因(通常是报告基因)的诱导型肝脏特异性表达的能力。或者，可以将CRE的变体替换成诱导型肝脏特异性启动子来代替参考CRE，并且可以测定由所述修饰的启动子驱动的对可识别的肝脏特异性表达的影响，并与未修饰的形式进行比较。类似地，技术人员可以容易地评估启动子诱导肝脏特异性表达的能力(例如，如以下实施例中所述)。由参考启动子的变体驱动的基因的表达水平和诱导性可以与参考序列的表达水平和诱导性进行比较，并且合适的方法在上面讨论。
可以鉴定肝脏特异性，其中基因(例如治疗基因或报告基因)在被诱导时优先或主要在肝来源的细胞中表达。可以定义优先或主要的表达，例如，当被诱导时，肝源性细胞中的表达水平明显高于其他类型的细胞(即，非肝源性细胞)。例如，当被诱导时，肝源性细胞中的表达适当地比非肝细胞高至少5倍，优选地比非肝细胞高至少10倍，并且在一些情况下可以高50倍或更多。为了方便起见，肝特异性表达可以通过比较肝细胞系(例如肝来源的细胞系如Huh7和/或HepG2细胞)或肝原代细胞中的表达水平，与肾来源的细胞系(例如HEK-293)、宫颈组织来源的细胞系(例如HeLa)和/或肺来源的细胞系(例如A549)中的表达水平来适当地证明。
本发明的肝脏特异性诱导型启动子优选在非肝脏来源的细胞中，合适地在HEK-293、HeLa和/或A549细胞中，具有比CMV-IE启动子低至少4倍的表达水平。
本发明的肝脏特异性诱导型启动子优选适于促进受试者肝脏中的表达，例如驱动转基因，优选治疗性转基因的肝脏特异性表达。
还应注意，在某些情况下，本发明的肝脏特异性启动子可用于非肝细胞。通常非肝细胞不表达CAR，因此本发明的启动子在这些细胞中不起作用。然而，当非肝细胞被工程化以表达CAR时(如果它们不天然表达RXR，则表达RXR)，这种非肝细胞可以诱导表达与本发明启动子相连的基因。换句话说，就CAR和RXR表达而言，本发明的肝脏特异性启动子也可以在已经修饰为具有肝脏样表型的非肝细胞中起作用。术语“肝脏特异性”应该相应地解释。当肝细胞不表达CAR(例如Huh-7细胞系)或RXR时，它们同样可以被修饰以表达相关的蛋白质。
本文使用的术语“核酸”通常指基本上由核苷酸组成的任何长度的低聚物或聚合物(优选线性聚合物)。核苷酸单元通常包括杂环碱基、糖基团和至少一个，例如一个、两个或三个磷酸基团，包括修饰或取代的磷酸基团。杂环碱基尤其可以包括嘌呤和嘧啶碱基，例如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，它们广泛存在于天然存在的核酸中，其它天然存在的碱基(例如黄嘌呤、肌苷、次黄嘌呤)以及化学或生物化学修饰的(例如甲基化的)、非天然的或衍生的碱基。糖基团尤其可以包括戊糖(戊呋喃糖)基团，例如天然存在的核酸中常见的优选核糖和/或2-脱氧核糖，或阿拉伯糖、2-脱氧阿拉伯糖、苏糖或己糖糖基团，以及修饰或取代的糖基团。本文预期的核酸可包括天然存在的核苷酸、修饰的核苷酸或其混合物。修饰的核苷酸可以包括修饰的杂环碱基、修饰的糖部分、修饰的磷酸基团或其组合。可以引入磷酸基团或糖的修饰以提高稳定性、抗酶降解性或一些其他有用的性质。术语“核酸”进一步优选包括DNA、RNA和DNA RNA杂交分子，具体包括hnRNA、pre-mRNA、mRNA、cDNA、基因组DNA、扩增产物、寡核苷酸和合成的(例如化学合成的)DNA、RNA或DNA RNA杂合体。核酸可以是天然存在的，例如存在于自然界中或从自然界中分离出来；或者可以是非天然存在的，例如重组的，即通过重组DNA技术产生的，和/或部分或全部化学或生物化学合成的。“核酸”可以是双链、部分双链或单链的。在单链的情况下，核酸可以是正义链或反义链。此外，核酸可以是环状或线性的。
术语“同一性”和“相同”等是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子之间，例如两个DNA分子之间的序列相似性。序列比对和序列同一性的确定可以例如使用最初由Altschul等人1990(J Mol Biol 215:403-10)描述的Basic Local Alignment SearchTool(BLAST)，例如由Tatusova和Madden 1999(FEMS Microbiol Lett 174:247-250)描述的“Blast 2sequences”算法。
用于比对序列的方法在本领域中是众所周知的。各种程序和比对算法描述于，例如:Smith and Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins and Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins and Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet et al.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang et al.(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson et al.(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana et al.(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50.A detailed considerationof sequence alignment methods and homology calculations can be found in,e.g.,Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。
国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对检索工具(Basic Local AlignmentSearch Tool)(BLASTTM；Altschul et al.(1990))可从几个来源获得，包括国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)和互联网，用于与多个序列分析程序结合使用。关于如何使用该程序确定序列同一性的说明，可在互联网上在BLASTTM的“帮助”部分找到。为了比较核酸序列，可以使用默认参数利用BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2 sequences”功能。当用这种方法评估时，与参考序列具有更大相似性的核酸序列将显示出增加的同一性百分比。通常，百分比序列同一性是在整个序列长度上计算的。
例如，通过具有以下评分参数的Needleman-Wunsch算法合适地找到全局最优比对：匹配得分：+2，错配得分：-3；空位罚分：空位开放5，空位扩展2。所得最优全局比对的同一性百分比通过比对碱基数与比对总长度的比率适当计算，其中比对长度包括匹配和错配，乘以100。
本申请中的“合成”是指自然界中不存在的核酸分子。本发明的合成核酸表达构建体通常通过重组技术人工生产。这样的合成核酸可以包含天然存在的序列(例如启动子、增强子、内含子和其他这样的调控序列)，但是它们存在于非天然存在的环境中。例如，合成基因(或基因的一部分)通常包含一个或多个本质上不连续的核酸序列(嵌合序列)，和/或可以包括取代、插入和缺失及其组合。
本文所用的“互补”或“互补性”是指两个核酸序列的沃森-克里克碱基配对。例如，对于序列5′-AGT-3′结合互补序列3′-TCA-5′。两个核酸序列之间的互补性可能是“部分的”，其中只有一些碱基结合到它们的互补序列上，或者当序列中的每个碱基都结合到它的互补碱基上时，它可能是完全的。核酸链之间的互补程度对核酸链之间杂交的效率和强度有显著影响。
本申请中的“转染”广义上指有意将核酸导入细胞的任何过程，并涵盖病毒和非病毒载体的导入，还包括转化、转导等术语和过程。例子包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔(Fromm et al.(1986)Nature 319:791-3)；脂质转染(Feigner et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7)；显微注射(Mueller et al.(1978)Cell 15:579-85)；农杆菌介导的转移(Fraley et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)；直接DNA摄取；晶须介导的转化；和微喷射轰击(Klein et al.(1987)Nature 327:70)。
如本文所用，短语“转基因”是指外源核酸序列。在一个例子中，转基因是编码工业上或药学上有用的化合物的基因，或编码所需性状的基因。在又一个例子中，转基因编码反义核酸序列，其中反义核酸序列的表达抑制靶核酸序列的表达。
术语“载体”在本领域中是众所周知的，如本文所用，是指核酸分子，例如双链DNA，其可能已经插入了根据本发明的核酸序列。载体适合用于将插入的核酸分子转运到合适的宿主细胞中。载体通常包含允许转录插入核酸分子的所有必要元件，并且优选将转录物翻译成多肽。载体通常包含所有必需的元件，使得一旦载体进入宿主细胞，载体就可以独立于宿主染色体DNA 或与宿主染色体DNA同步复制；可以产生载体及其插入的核酸分子的几个拷贝。本发明的载体可以是附加载体(即，不整合到宿主细胞基因组中)，或者可以是整合到宿主细胞基因组中的载体。这个定义包括非病毒和病毒载体。非病毒载体包括但不限于质粒载体(例如pMA-RQ、pUC载体、bluescript载体(pBS)和pBR322或其不含细菌序列(微环)的衍生物)基于转座子的载体(例如PigyBac(PB)载体或睡美人(SB)载体)等。较大的载体如人工染色体(细菌(BAC)、酵母(YAC)或人(HAC))可用于容纳较大的插入片段。病毒载体来源于病毒，包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒、肝炎病毒载体等。典型地，但不是必须地，病毒载体是复制缺陷型的，因为它们已经失去了在给定细胞中繁殖的能力，因为复制所必需的病毒基因已经从病毒载体中消除。然而，一些病毒载体也可以适于在给定细胞(例如癌细胞)中特异性复制，并且通常用于触发(癌症)细胞特异性(瘤细胞溶解)裂解。病毒体是包含病毒和非病毒元件的载体的非限制性实例，特别是它们将脂质体与灭活的HIV或流感病毒结合(Yamada等人，2003)。另一个例子包括与阳离子脂质混合的病毒载体。
本文使用的术语“可操作地连接”、“可操作地相连”或等效表达是指各种核酸元件相对于彼此的排列，使得这些元件功能性地连接并且能够以预期的方式相互作用。这些元件可以包括但不限于启动子、增强子和/或调控元件、聚腺苷酸化序列、一个或多个内含子和/或外显子以及待表达的感兴趣基因的编码序列。当适当定向或可操作地连接时，核酸序列元件一起作用以调节彼此的活性，并最终可能影响表达产物的表达水平。调节是指增加、降低或维持特定元件的活性水平。每个元件相对于其他元件的位置可以用每个元件的5’末端和3’末端来表示，任何特定元件之间的距离可以用元件之间插入的核苷酸或碱基对的数量来表示。如本领域技术人员所理解的，可操作连接意味着功能活性，并且不一定与天然位置连接相关。事实上，当用于核酸表达盒时，顺式调节元件通常位于启动子的紧邻上游(尽管通常是这种情况，但绝对不应该解释为限制或排除核酸表达盒内的位置)，但这不一定是体内的情况，例如，天然存在于基因下游的调控元件序列，当其位于启动子上游时，它影响其转录的基因能够以相同的方式发挥作用。因此，根据特定实施方案，调控元件的调控或增强效果是不依赖于位置的。
本文所用的“间隔序列”或“间隔子”是分离两个功能性核酸序列(例如TFBS、CRE、CRM、最小启动子等)的核酸序列。它可以基本上具有任何序列，只要它不阻止功能性核酸序列(例如顺式调节元件)如期望的那样起作用(例如，如果它包括沉默序列、阻止期望转录因子的结合等，这可能发生)。典型地，它是非功能性的，因为它的存在只是为了将相邻的功能性核酸序列彼此隔开。
这里使用的术语“药学上可接受的”与本领域一致，是指与药物组合物的其他成分相容，并且对其接受者无害。
“治疗有效量”和类似短语是指在受试者中提供所需的特定药理作用的剂量或血浆浓度，例如在肝脏中表达治疗基因。需要强调的是，治疗有效量并不总是能有效治疗本文所述的病症，即使本领域技术人员认为这种剂量是治疗有效量。治疗有效量可根据施用途径和剂型、受试者的年龄和体重和/或所治疗的疾病或病症而变化。
术语“治疗”是指减轻、改善或消除疾病或病况的一种或多种体征、症状或影响。
术语“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用，指的是任何患有需要治疗的疾病或病况的个体受试者。为了本公开的目的，受试者可以是灵长类动物，优选人类，或另一种哺乳动物，例如狗、猫、马、猪、山羊或牛等。
技术介绍
核受体
核受体在将细胞环境中的化学变化转化为转录和生物变化中起着至关重要的作用。这一功能不仅对维持细胞的稳态，而且对维持整个生物体的稳态至关重要。核受体仅在后生动物中发现，不同物种之间的数量差异很大，例如人类有48个，秀丽隐杆线虫(C.elegans)有270个。
自从他们发现以来，核受体的重要性和数量大大增加，这些蛋白质现在被认为是一个蛋白质超家族。这个家族包括结合类固醇、甲状腺激素、营养物质和异生化学物质并对其做出反应的受体。一旦被配体结合，受体就会发生构象变化，并与DNA结合，从而启动或抑制基因表达。这种结合基因组DNA的能力对于受体的功能及其在细胞命运、个体发育和新陈代谢中的重要性至关重要。已被证明与核受体结合的配体的数量不断增加，并掩盖了同源受体的功能。从内源性激素到维生素和外源性物质，都强调了它们对细胞代谢和体内平衡的重要性。由于这些受体对转录组的深远影响，它们是药物治疗的极好靶点，据估计，FDA批准的大约13％的药物靶向核受体。
结构
核受体的质量在50-100kDa之间，成熟多肽分为5个结构域:
A/B:受体之间高度可变。包含激活功能1(AF-1)，在没有配体的情况下其作为弱转录激活因子，但在配体结合时作为强激活因子。这是由于在E域与AF-2的相互作用。
C：高度保守的结构域，含有与DNA反应元件结合的2个锌指。
D:连接LBD和DBD并允许其交互的灵活域。在细胞运输和亚细胞分布中很重要
E:结构高度保守，但序列只有中度保守。包含配体结合腔并赋予受体配体特异性。与DBD一起形成二聚化界面，还结合共激活剂和阻遏剂。包含激活因子2(AF2)，其作用依赖于配体结合。
F:高度可变的C端结构域。
作用机理
根据其作用机制，核受体可分为4类。以下是每种类型的总结:
I型:这些受体在处于失活状态的细胞的细胞质中发现。配体的结合导致热休克蛋白(HSP)解离、同二聚化、移位至细胞核并与受体的DNA反应基序结合。这些受体与DNA基序结合，该基序由21/2个位点组成，所述位点由可变长度的DNA(同向重复1-5(DR1-5))隔开，其中第二个1/2位点是第一个的反向重复。这类受体中的一些与直接重复序列结合，并且可以作为单体/二聚体结合，或者在组成型雄甾烷受体的情况下作为异二聚体与RXR结合。
II型:这些受体，不管是无活性的还是活性的，都存在于细胞核中。它们通常以异二聚体的形式与RXR结合到DNA上。在没有配体的情况下，这些受体通常与共抑制蛋白复合。
III型:类似于I型受体，但只与DNA序列的直接重复序列结合。
IV型:它们可以作为二聚体单体结合，但只有单个DNA结合域与DNA上的单个半位点结合。
组成型雄甾烷受体(CAR)
组成型雄甾烷受体(CAR)-或核受体亚家族1，组I，成员3-是核受体超家族的成员，几乎只在肝细胞中表达。正是在这里，CAR与另一核受体，孕烷X受体(PXR)协同作用，作为内生和外生化学物质的传感器。一旦被激活物质结合，这些受体调节许多基因的活性，包括细胞色素p450s，因此负责这些化合物的代谢和排泄。正是通过这种结合和基因激活活性，CAR和PXR在体内外来化学物质的解毒中发挥了重要作用。
功能:
如上所述，CAR作为异生和内生代谢的关键调节剂发挥作用。它在肝脏中有24个转录本。已经表明，这些转录本中的一些负责该受体的低水平组成型活性，而其他转录本是诱导型的。组成型活性被认为是通过与转录共激活因子(如类固醇受体共激活因子1(SRC1))的相互作用来调节的。这种活性可以通过反向激动剂(如雄甾烷)的结合来抑制。
配体活化:
无活性的CAR被磷酸化并存在于细胞的细胞质中。在这里，它与热休克蛋白90(hsp90)和细胞质CAR保留蛋白(CCRP)形成复合物，这种联系使CAR保持在细胞质中，并因此是无活性的。这种无活性的CAR可以通过2种方式激活1)例如通过TCPOBOP直接配体结合一种小鼠CAR配体，或2)通过苯巴比妥的间接激活。这两种途径都导致CAR从多蛋白复合物中解离，并允许其转移到细胞核中。在细胞核中，CAR可以作为单体，也可以与类视黄醇X受体(RXR)形成异二聚体。细胞核CAR在苯巴比妥反应元件(PBREM)处结合DNA，通过它激活CAR调节基因，如CYP2B、CYP2C和CYP3A亚家族。
直接激活:
TCPOBOP被认为直接与小鼠CAR结合并诱导其易位至细胞核。然而，这种化学物质不会与人体CAR结合，因此在人体研究中，CITCO是一种等效化合物。
间接激活:
抗惊厥药苯巴比妥(PB)间接激活CAR是一种广泛认可的间接CAR激活的模式。PB通过磷酸酶PP2A的激活引起CAR的去磷酸化。PP2A激活的确切机制尚不清楚，然而，PB激活AMP激活的蛋白激酶，该蛋白激酶可能激活PP2A，激活的PP2A然后被多蛋白复合物募集。
另一种理论是，PB与表皮生长因子(EGF)竞争其受体，表皮生长因子受体(EGFR)。表皮生长因子和EGFR的解离使SRC1失活，这导致活化的C激酶1(RACK 1)受体去磷酸化，从而刺激PP2A。
PBREM元件:
小鼠CAR同系物的DNA结合位点由Honkakoski等人确定(MOLECULARPHARMACOLOGY,53:597-601(1998))。在这项研究中，他们发现RXR和CAR异二聚体结合到细胞色素P-450 Cyp2b10基因的苯巴比妥反应增强子模块(PBREM)中的位点上，以响应苯巴比妥诱导。RXR和CAR在哺乳动物细胞系中的表达激活了PBREM，表明CAR-RXR异二聚体是Cyp2b10基因的反式作用因子。还表明这种异二聚体与2个不完全的直接重复-4基序结合，并且这种基序在人类中是保守的。PBREM元件如图6所示，NR1和NR2是核受体结合位点，不完全的直接重复以粗体显示。显示了NFI结合位点。CAR-RXR异二聚体似乎与NR1位点结合。
人类的PBREM元件也已被确定，Sueyoshi等人(J.BIOL.CHEM.Vol.274,10,pp.6043-6046,1999)。
小鼠和人PBREM元件的序列和比对如下所示，每个元件中的所谓NR1基序都带有下划线(SEQ ID NO显示在括号中):
Figure BDA0003269993130000471
可以看出，在NR1基序中有非常高的保守水平，而在其他区域中有低得多的同一性水平。
本发明基于令人惊讶的发现，即PBREM元件及其功能变体可用于提供诱导型表达，例如，当在基因治疗载体中提供时。本发明允许有用水平的诱导性和低水平的背景(组成型表达)。
实施例1
PBREM增强子与MinTK启动子一起用于驱动荧光素酶和EPO的表达。
材料
-Huh7细胞是人类肝细胞系
-DPBS：不含CaCl2，不含MgCl2(Gibco,14190-094)
-DMEM(Sigma,D6546)
-FBS(Sigma,F9665)
-Pen-Strep(Sigma,P4333)
-Promega Fugene-HD(E2311)
-TCPOBOP(Sigma,T2320)
-CITCO(Cayman Chemicals Company,16027)
-含有β-半乳糖苷酶基因的pcDNA6质粒，用作转染效率的内部对照(Thermofisher，V22020)
-小鼠CAR表达质粒来自Jouan等，2016(BioCat GmbH，EX-Z4288-M51-10-GC)。这是因为Huh7缺乏CAR。
-β-半乳糖苷酶底物溶液(Thermofisher，75707/75710)
-Pierce BCA试剂盒(23225)
-LARII(双荧光素酶报告子1000分析系统，Promega,E1980)
-EPO ELISA试剂盒(Abcam,ab119522)
方法：
第1天
-细胞以25,000细胞/300μl的密度接种到48孔板上
第2天
-在转染当天，将待转染的DNA(CAR质粒/PB1-MinTK可操作地与荧光素酶或EPO/pcDNA6质粒连接用于内部对照)稀释至100ng/μl储备溶液。
每48孔转染:
-将45ng的DNA(质粒、pcDNA6、CAR和测试质粒各15ng)与4.1μl的Optimem培养基混合。
-将0.5μl的Fusion HD与4μl的Optimem培养基混合。
-将这两种溶液混合并在室温下温育15分钟。
-然后将最终溶液滴加到孔中。
-转染后3小时，将诱导剂TCPOBOP以指定的浓度加入到合适的孔中。
第3天
-诱导后24小时，从细胞中除去培养基。
-细胞在300μl的DPBS中洗涤一次
-使用100μl的被动裂解缓冲液裂解细胞，并摇动温育15分钟
-通过在台式离心机中以最大速度离心平板1分钟来沉淀细胞碎片
-对于荧光素酶，将10μl样品转移到白色96孔板中，通过注射50μl的LARII底物来测量发光。
-使用25μl的裂解物，按照制造商的说明(哺乳动物β-半乳糖苷酶测定试剂盒，75707/75710，Thermo Scientific)测量β-半乳糖苷酶活性。将25μl的裂解物转移到微孔板孔中，并与25μl的β-半乳糖苷酶测定试剂混合，平衡至室温。将混合物在37℃温育30分钟，在405nm处测量吸光度。
-根据制造商的说明(PierceTM BCA蛋白质测定试剂盒，23225/23227，ThermoScientific)使用25μl的裂解物测量蛋白质浓度。将25μl的裂解物转移到微孔板孔中，并与200μl的工作溶液混合。将混合物在37℃温育30分钟，冷却至室温，然后在562nm左右测量吸光度。相对于由具有已知蛋白质浓度的测定标准制备的蛋白质标准曲线计算蛋白质浓度。
荧光素酶读数被标准化为裂解物中的β-半乳糖苷酶和蛋白质浓度，以产生标准化的相对光度计单位(RLUs)。
为了在实验之间进行比较，将启动子的强度与CMV-IE启动子进行比较，CMV-IE启动子驱动与包含PBREM的构建体相同的基因，该构建体包含在每个实验中。
使用PB1-MinTk-EPO的转染如上所述进行，不同的是EPO被分泌到培养基中。因此，收集培养基，并根据制造商的说明(ab119522 Erythropoietin(EPO)Human ELISA Kit,Abcam)使用ELISA测量EPO浓度。将50μl培养基转移到预洗的微孔板孔中，并与50μl的1x生物素结合抗体混合。混合物在室温下温育1小时。洗涤孔，加入100μl链霉亲和素-HRP，平板在室温下温育15分钟。洗涤孔，然后用100μl的TMB底物溶液洗涤。混合物在室温下温育10分钟。通过加入100μl的终止溶液终止酶反应，并在450nm处读取吸光度。EPO浓度是根据EPO标准曲线计算的，EPO标准曲线由已知EPO浓度的测定标准品制成。
使用KpnI和NcoI限制性位点将PB1-MinTk构建体克隆到载体pGL4.10中。这将启动子直接置于萤火虫荧光素酶报告基因的上游。PB1-MinTK构建体包含51bp增强子和来自疱疹胸苷激酶基因的MinTK最小启动子。
结果：
图1A中PB1-MinTk构建体的荧光素酶表达显示，当细胞用载体(DMSO)处理时，启动子几乎没有可测量的荧光素酶活性。这种活性对应于启动子的泄漏表达。添加50nM或150nM的TCPOBOP导致启动子的强烈诱导，测得的诱导高达6倍。添加250nM的TCPOBOP并没有引起该启动子的异常反应，这表明体内平衡控制机制可能已经被激活以防止细胞负担过重。因此，在Huh7细胞中加入TCPOBOP诱导了PB1-MinTK构建体。所述诱导是可调的，取决于TCPOBOP的浓度，但在较高浓度时会下降。
在图1B中，在CAR和150nM TCPOBOP存在下，来自PB1-MinTK构建体的荧光素酶表达是高的，如先前在图1A中所见。然而，当细胞用PB1-MinTK转染但没有CAR时，当加入150nm的TCPOBOP时，没有可测量的活性。这可以解释为当不存在CAR时，TCPOBOP没有受体与之结合。因此，诱导是CAR依赖性的，并表明为高度肝脏特异性的过程。
综上所述，这些结果表明，PB1-MinTk构建体可通过在Huh7细胞中添加TCPOBOP进行诱导，诱导是可调节的，诱导是CAR依赖性的，并且来自单个元件的表达足以驱动40％的CMV-IE基因表达。
图1A所示的实验数据在图1C中表示为强病毒启动子CMV-IE的荧光素酶表达的比率。这表明来自与MinTK启动子连接的一个PBREM元件的荧光素酶表达足以驱动CMV-IE启动子的40％的荧光素酶表达。图1C还显示，在没有CAR的情况下，没有来自PB1-MInTK构建体的荧光素酶表达。
PB1-MinkTK启动子然后被用于驱动蛋白EPO的表达，这是治疗感兴趣的。在转染了与EPO蛋白和含CAR质粒可操作连接的PB1-MinTK启动子的Huh7细胞中驱动表达。如前所述进行转染，但EPO的表达由人CAR诱导剂CITCO诱导。
用人CAR诱导剂CITCO代替小鼠诱导剂TCPOBOP，因为TCPOBOP不会激活人CAR。这意味着TCPOBOP不能用于人类细胞，而人类细胞是使用本发明的最终目标。这样做也是为了确保小鼠PBREM元件可以被人类CAR激活，人类CAR是用人类CAR诱导剂CITCO诱导的。
在转染到Huh7细胞并用DMSO、0.5μM、1μM、2μM和3μM CITCO处理后，来自PB1-MinTK构建体的EPO表达如图1D所示。该图显示，在没有添加药物的情况下，EPO的表达非常少，但是在添加最多2μM的CITCO时，EPO的产量显著增加。这再次回到最高浓度的基线活性。该图还表明，添加CITCO不会改变来自启动子CMV-MP的EPO表达。在该实施例中，PB1-MinTk的总EPO表达水平约为CMV-IE的EPO表达的22％(数据未显示)。这与之前在图1C中观察到的CMV-IE的40％不同，因为CITCO是比TCPOBOP更弱的CAR活性诱导剂。
PB1-MinTk用于成功驱动荧光素酶和EPO的可调表达。
实施例2
然后将PBREM元件与另外两种最小启动子结合使用，以测试诱导性和表达。PBREM被克隆在CMV最小启动子、MinTK启动子和SV40最小启动子之前，并被引入AXOL ARE-肝细胞。
Axol Assay-Ready Expanded(ARE)肝细胞是已经在体外扩增的原代人肝细胞。大批量(多达2000个小瓶)可用，确保原代肝细胞可靠、即用和一致的来源。ARE肝细胞表达CYP酶，具有代谢功能，呈极化状态，可被丙型肝炎病毒感染。AXOL ARE-肝细胞表达CAR，不需要用表达CAR的质粒转染。
材料：
-AXOL assay-ready expanded(ARE)肝细胞(Axol,ax3701)
-ARE肝细胞解冻培养基(Axol,ax3705)
-ARE维持培养基(Axol,ax3710)
-Virimer red转染试剂(Lipocalyx,VR04-02-15)
-如上所述的CITCO、荧光素酶、β-半乳糖苷酶和BCA试剂盒
方法：
按照制造商手册中的说明培养和转染ARE肝细胞。
将200,000个细胞接种在胶原蛋白包被的6孔板中的2ml培养基中。细胞在37℃和5％CO2下温育4小时，以获得足够的粘附力。加入200μl的含有待转染的DNA的转染混合物(PB1-MinTK/PB1-CMV/PB1-SV40与荧光素酶和含β-半乳糖苷酶的启动子可操作地连接)，细胞在37℃和5％CO2下以100rpm在轨道振荡器上温育3小时。转染后3小时，将CITCO加入合适的孔中。细胞在37℃和5％CO2的静态条件下温育过夜，早晨用新鲜的ARE肝细胞维持培养基替换培养基。诱导后24小时读数。
结果：
图2A中来自PB1-MinTK、PB1-CMV-MP和PB1-SV40-MP构建体的荧光素酶表达表明，在加入1μM CITCO后，每个最小启动子都支持来自PBREM元件的表达。SV40和MinTK的诱导约为7倍，CMV-IE启动子的诱导为2倍。与CMV-IE相比，PB1-MinTK、PB1-CMV和PB1-SV40的每个构建体的表达水平分别为20％、10％和55％。SV40可以带动最高的表达，但它是以更高的背景水平为代价的。CMV最小启动子显示很少或没有表达。从该数据看来，原始MinTk构建体可以在表达水平、诱导性和控制严密性(即最小化背景表达)之间提供最佳折衷。
PBREM可用于与各种最小启动子组合驱动诱导型表达。
实施例3
进行该实验是为了检查多聚NR结合位点是否会随后增加启动子的活性。因此，我们在MinTk、CMV和SV40最小启动子前面克隆了PBREM元件的2、3和4个重复。这里一个重要的考虑因素是元件之间的间距，这里我们遵循间距为5的一般规则，即间隔5bp的元件不会在空间上相互阻碍。利用内部知识，从以前的诱导型启动子设计中，我们克隆了相距20bp的元件。这些多聚体被克隆到前面描述的pGL4.10质粒中。然后，如前所述，在AXOL ARE肝细胞中测试这些构建体。
MinTK启动子:
PB1-MinTK、PB1-1-MinTK、PB1-2-MinTK和PB1-3-MinTK分别含有1、2、3和4个与MinTK最小启动子组合的PBREM元件。在用1μl CITCO诱导时，来自PB1-1-MinTK、PB1-2-MinTK和PB1-3-MinTK构建体的荧光素酶表达在图3C显示多聚体被诱导并增加表达水平。然而，这种表达水平的增加仅在3个拷贝的PBREM元件(PB1-2)中观察到，因为添加另一个元件似乎对诱导和表达水平有不利影响。每个多聚体分别被诱导至1.5、4.1和2.66的CMV-IE。然而，诱导水平类似于此处描述为PB1的原始PB1-MinTK结构。这是由于启动子的背景活性增加。结果表示为与CMV-IE的比率。结果是3次生物学重复的平均值。
SV40最小启动子:
PB1-SV40、PB1-1-SV40、PB1-2-SV40和PB1-3-SV40分别含有1、2、3和4个PBREM与SV40最小启动子组合的元件。在图3A中用1μl CITCO诱导时，来自PB1-1-SV40、PB1-2-SV40和PB1-3-SV40构建体的荧光素酶表达显示多聚体被诱导并确实增加了表达水平。然而，如前所述，由于添加另一种元件似乎对诱导和表达水平有不利影响，仅观察到3个拷贝的PBREM元件表达水平的增加。每个多聚体分别被诱导至2.6、3.6和2.57的CMV-IE。诱导水平高于MinTk最小启动子所见的6倍增加，诱导水平高达9倍。同样，背景表达水平也有所增加，但这远低于下文所述的CMV-MP启动子。结果表示为与CMV-IE的比率。结果是3次生物学重复的平均值。
CMV启动子:
PB1-CMV、PB1-1-CMV、PB1-2-CMV和PB1-3-CMV分别含有1、2、3和4个与CMV最小启动子结合的PBREM元件。在图3B中用1μl CITCO诱导时，来自PB1-1-CMV、PB1-2-CMV和PB1-3-CMV构建体的荧光素酶表达显示多聚体被诱导并且确实增加了表达水平。然而，如前所述，这种表达水平的增加仅在3个拷贝的PBREM元件中观察到，因为添加另一个元件似乎对诱导和表达水平没有影响。每个多聚体分别被诱导至1.9、2.67和2.67的CMV-IE。诱导水平低于用MinTk或SV40最小启动子观察到的水平，最大5倍。使用CMV最小启动子似乎将背景表达水平提高到非常高的水平，因此它可能是被评估的最差候选。
增加PBREM元件的数量可以将表达水平提高到3个PBREM元件。进一步将PBREM数增加到4导致荧光素酶表达降低。
实施例4
根据实施例3，决定将PB1-MinTK和PB1-2-MinTk用于体内研究。为了促进这一点，将上述两种构建体克隆到pAAV载体(Takara，Clontech)中，以便制备AAV病毒。使用pAAV质粒的限制性消化和原始pGL4.10构建体的PCR扩增来克隆插入片段。
我们研究了反向末端重复序列(ITR)对启动子活性的影响。这是因为我们在其他项目中观察到AAV ITR的干扰。为此，如前所述，将pAAV-PB1-MinTk和pAAV-PB1-2-MinTk转染到Huh7和ARE原代细胞中，并评估它们的活性。
这些实验的结果可以在图4A和4B中看到。这些图代表3次生物复制的平均值，并表明ITR不影响启动子的性能。来自PB1-MinTK和PB1-2-MinTK构建体的荧光素酶表达诱导在载体和细胞类型之间具有可比性。这些构建体非常稳健，质粒骨架似乎对活性没有影响。
实施例5
AXOL ARE肝细胞中的pAAV载体中PB1-MinTK和PB1-2-MinTK构建体的荧光素酶表达由CITCO(1μM)诱导，但在去除CITCO后减少，如图5所示。这表明药物的去除将启动子的活性降低到几乎基线水平。
实施例6-使用包括PB1和PB1-2诱导的AAV的体内实验
从先前的申请中，选择构建体PB1(单一小鼠PBREM元件和Min-TK启动子)和PB1-2(3xPBREM和Min-TK启动子)用于小鼠体内测试。这是按如下方式进行的。
来自先前申请的PB1和PB1-2 AAV构建体，序列如下(SEQ ID NO 49和50，表3)，用于制造AAV病毒。
AAV生产
第1天：
-在15cm平板中接种HEK 293-AAV细胞。转染当天为70-80％汇合-每个平板上的最终体积:15ml
第2天：制备转染混合物：
-DNA混合物/平板:PDG9(AAV 9的包装质粒):10.5μg/pHGTI(Ad.辅助质粒):31.5μg/载体质粒:10.5μg/在无DMEM/Optimem的血清中制备
-转移混合物/平板:PEI:125μl/在无DMEM/Optimem的血清中制备
-将DNA混合物加入转染混合物中。混合并在室温下放置15-20分钟。
-将3ml转染混合物滴加到每个平板上，并轻轻分散。温育24小时。
第3天：
-将培养基更换为15ml DMEM，并添加P/S和2％FCS。放置48小时。
第5天：
-收集上清液并储存在50ml试管中，每管25ml。储存在-20℃。
-收集细胞:向每个平板中加入5ml的PBS→刮取并收集在50ml试管中。
-为了清洗平板，再加入1ml的PBS并收集。
-以1500rpm旋转5分钟。
-取出上清液，将沉淀的细胞重新悬浮在1ml/平板TD裂解缓冲液→池中
-储存在-80℃。
核酸内切酶处理
细胞：
-冷冻和解冻沉淀5次→在37℃下约20分钟，然后在干冰(或-80℃)中约20分钟。
-加入25μl/ml细胞的20％脱氧胆酸盐(或50μl/ml的10％脱氧胆酸盐)。
-加入8μl/ml细胞的苯并酶。
-在37℃温育30分钟。
-以4Krpm旋转30分钟。
-使用0.45μM过滤器过滤上清液。
-在4℃下储存最多24小时。
上清液:
-加入2.5μl/25ml上清液的苯并酶。
-加入50μl/25ml上清液的MgSO4。
-在37℃温育30分钟。
-以4Krpm旋转30分钟。
-使用0.45μM过滤器过滤上清液。
-在4℃下储存最多24小时。
HPLC纯化
-将两条管线放入20％ETOH中→模板→系统清洗
-将管线A置于PBS中，管线B置于甘氨酸中→模板→系统清洗
-将色谱柱置于机器中→手动运行→流速:5ml/min→运行25ml或直到UV线变平。
-准备FACS试管(细胞10个，上清液更多):加入30μl/管Tris→放入机器中收集载体。
-将废液管线放在一个单独的试管中，使其能够再次通过色谱柱。
-运行样品(流速低，取决于系统的速度和样品的浓度；对于细胞来说较慢，对于上清液来说较高)。
-废物通过色谱柱后，用PBS洗涤→流速:5ml/min，直到UV线变平。
-设置→分数大小:1ml；流速：1ml/min；浓度％B:100％→运行。
-开始收集:寻找峰。峰表示载体纯化。标记包含这些载体的试管。
-退出前保存程序。
-用PBS清洗→75ml,5ml/min
-用Na3PO4清洗(将色谱柱储存在其中)→75ml,5ml/min
-取出色谱柱，在4℃下储存
-用PBS清洗机器→模板→系统清洗
-用20％ETOH清洗机器→模板→系统清洗
-将两条管线放入20％ETOH中，然后关闭
-将2L的PBS加入大桶中，放入透析盒(Side-A-Lyzer；Thermo scientific)来灌注。
-使用注射器和针头从标记的FACS试管中收集载体，并添加到透析盒中→去除膜上多余的空气，小心地将橡胶放在盒的顶部，并让其漂浮在含有PBS的桶中→在室温下在缓慢旋转的转子上过夜。
次日：
-通过在离心过滤器上加入5ml PBS对膜进行准备(Amico Ultra 15；MERCK)→以4Krpm旋转5分钟
-去除膜内多余的PBS。
-从盒子中取出载体并装载到膜上→以4Krpm旋转5分钟
-用里面的载体清洗膜几次，然后收集到2ml离心管过滤器0.22μM(Spin-X；COSTAR)
-以13Krpm的速度旋转3分钟。
-取出过滤器，等分:1x100 l(注射用)，其余的10-2μl等分。
-储存在-80℃。
-使用qRT-PCR和荧光素酶基因的引物和探针进行病毒定量。
小鼠实验
所选的AAV血清型是AAV9，因为它对大多数组织和器官都有趋化性，因此可以了解我们启动子的特异性(避免AAV趋化性问题)。实验的输出是在注射后第5天用第一个读数目测测量的荧光素酶活性。然后每周对小鼠进行监测，35天后，一旦带有CMVIE的对照载体AAV9显示出一致的稳定结果，就建立诱导谱的基线。此时加入诱导剂，并在诱导前后进行测量。请参阅下面的更多细节。
小鼠：
-成年(8周龄)CD1雄性小鼠通过尾静脉注射AAV9载体。
-每只小鼠总共施用5x1011个载体基因组拷贝数/ml。
-注射后5天对小鼠进行成像。他们首先被麻醉，并接受荧光素腹腔注射(300μl荧光素储液15mg/ml)。5分钟后，将小鼠放入IVIS机器中并获取图像。
成像：
-用于图像的曝光时间为1秒和10秒。
-图像每周拍摄一次
-此外，在给予诱导剂或阻遏剂之前，在四天内每天对小鼠进行成像。
诱导：
-诱导剂(苯巴比妥)的浓度为5mg/ml。小鼠腹腔注射10μl，即每只小鼠注射50微克(每只小鼠体重约为30g)。
结果
实验结果见图8。图8A显示了来自每个测试构建体的代表性小鼠。这里可以看到，PB1和PB1-2的表达都局限于肝脏，而CMV-IE启动子几乎在小鼠的所有组织中表达。此外，在0小时时，PB1和PB1-2小鼠没有显示荧光素酶基因的表达，表明表达受到严格控制。然而，当加入诱导剂苯巴比妥时，我们可以看到PB1和PB1-2的表达都增加了。诱导的幅度和持续时间存在一些变化。例如，PB1诱导约10倍，在9小时时达到最大活性，诱导在24小时完成，而PB1-2在24小时时最大活性增加约50倍，诱导直到注射后48小时才完成(图8B和8C)。这些数据证实了在模型细胞系中观察到的发现，并进一步证明了这种诱导系统用于体内的潜力。该系统具有低背景和良好的诱导性，即使诱导物的施用剂量比推荐的人类剂量少10倍。
实施例7–PBREM元件的变体
如上所述，核受体CAR与人和小鼠的DNA序列结合。从序列比对可以看出，物种之间存在一些序列差异。51bp模块化PBREM元件本身可以分为3个不同的部分(见下表)。1)NR1区(包含NR1元件)，其被认为负责大部分诱导活性，2)NF1区(包含NF1元件)，其结合其他核受体并可能在没有激活的CAR时负责降低背景水平，和3)NR2区(包含NR2元件)，其再次参与CAR诱导活性。
构成PBREM元件的组成部分的比对和描绘如下所示:
小鼠 TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC 51
人类 ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA 51
**************** ** *** ** *** **** ***** *
(小鼠＝SEQ ID NO:1,人类＝SEQ ID NO:2)
表4–小鼠和人类PBREM序列:
Figure BDA0003269993130000601
在前面的例子中，所用启动子的变体含有小鼠PBREM元件。为了证实我们的预期，即人类PBREM元件也可以使用，我们还评估了人类PBREM诱导性；这可能是相关的，因为这个项目的一个目的是提供用于人类基因治疗的诱导型启动子，并且人类序列可能具有一些优势。此外，我们还评估了PBREM元件的人和小鼠杂合体，以确定我们是否可以调节或改善启动子的诱导性和背景水平。这种新的组合在自然界的任何环境中都找不到，并且可能具有新的特征，例如背景和诱导水平。如前所述，构建体在PGL4.10骨架中进行了测试，并在下表2中列出。它们是:人NR1x3-Min TK(具有MinTK最小启动子的3x人NR1区域)；人PBREM-minTK(具有MinTK最小启动子的人PBREM)；hNR1-mNFI-hNR2-Min TK(具有MinTK最小启动子的人鼠人杂合体)；hNR1-mNFI mNR2-Min TK(具有MinTK最小启动子的人鼠鼠杂合体)；mNR1-hNFI-mNR2-Min TK(具有MinTK最小启动子的鼠人鼠杂合体)；mNR1-hNFI-hNR2-Min TK(具有MinTK最小启动子的鼠人人杂合体)；hPB-SV40(具有SV40最小启动子的人PBREM)；和MHM-SV40(具有SV40最小启动子的鼠人鼠杂合体)—分别为SEQ ID NO：59至66。
如前所述，在Huh7稳定细胞系和原代肝细胞中测试这些构建体。此外，为了用传统的人CAR激活剂CITCO测试构建体，我们还测试了天然化合物黄酮。这是一种GRAS(通常被认为是安全的)产品，此前已有报道称其可激活人类CAR，并且由于其无毒的性质和很少的副作用，可能是一种用于基因治疗应用的有用药物。据预测，CITCO在体内相对不稳定，并且没有关于其在人体内使用安全性的数据，因此优选仅用于组织培养。此外，上述体内结果使用苯巴比妥作为诱导剂。在某些情况下，苯巴比妥的使用可能是不可取的，即使比推荐剂量少10倍(鉴于上述数据，这似乎是可能的)。因此，黄酮可能是缓解任何安全或监管问题的更理想的诱导剂。
这些实验的结果可以在图9和10中看到。这些数字显示了与体内测试的PB1的比较。在稳定的表达CAR的Huh7细胞系(图9)和原代细胞(图10)中，人PBREM(hPB)的表现与小鼠PBREM(PB1)几乎相同，这表明它们可以与Min-TK和SV40最小启动子互换。在测试的杂合体中，除了MHM杂合体外，所有的杂合体都可以诱导到与PB1相似的水平和相似的背景。其具有较低的背景和较低的总体活性，但具有良好的诱导性，表明它可能比PB1构建体具有更严格的表达控制；这与最小启动子环境无关，因为其与Min-Tk和SV40的杂交显示了相似的结果。黄酮诱导的所有构建体的水平与CITCO相似，表明该化合物确实是PBREM构建体的有用诱导剂。这些实验中的一个轻微异常是由来自人类PBREM的3x NR1组成的构建体。它具有相对高的背景，并且仅在稳定的细胞系中被诱导，而在原代细胞中较少被诱导。
从这些实验中，应用了与上述例子类似的方法。最好的单体，人PBREM和MHM杂合，用Min-Tk最小启动子和SV40最小启动子进行多聚体化和测试。这些多聚体的序列如表3所示。启动子为:2xhPB SV40(具有SV40最小启动子的2x人PBREM元件)；2xMHM-MinTK(具有MinTK最小启动子的2x鼠人鼠杂合体)；2xMHM-SV40(具有SV40最小启动子的2x鼠人鼠杂合体)；3xhPB minTK(具有MinTK最小启动子的3x人PBREM元件)；和xhPB-SV40(具有SV40最小启动子的3x人PBREM元件)-SEQ ID NOs分别为:67至71。
如前所述，在表达稳定细胞系的Huh7 CAR和原代肝细胞中，使用CITCO和黄酮评估启动子的表达和诱导。
结果见图11和12。这里的对比是来自早期例子的PB1-2。可以观察到多聚体启动子都高度诱导这两种化合物，并且无论使用的最小启动子如何，它们都具有非常低的背景。此外，2xMHM和3xhPB表现最好，总体表达水平高于我们观察到的PB1-2和可比的背景水平。这表明，一些新的启动子可能在体内表现更好，也为根据需要控制基因表达提供了更多选择。
序列
表1–PBREM元件、变体及其部分
Figure BDA0003269993130000621
Figure BDA0003269993130000631
NR1基序加下划线，NF1基序加粗，NF2基序加双下划线。
表2–包含小鼠PBREM元件的诱导型启动子
Figure BDA0003269993130000632
Figure BDA0003269993130000641
Figure BDA0003269993130000651
Figure BDA0003269993130000661
Figure BDA0003269993130000671
Figure BDA0003269993130000681
Figure BDA0003269993130000691
Figure BDA0003269993130000701
Figure BDA0003269993130000711
PBREM元件带下划线；最小启动子用粗体表示；基因序列带双下划线。
表3–构建体和其他序列。
Figure BDA0003269993130000712
Figure BDA0003269993130000721
Figure BDA0003269993130000731
Figure BDA0003269993130000741
Figure BDA0003269993130000751
Figure BDA0003269993130000761
Figure BDA0003269993130000771
Figure BDA0003269993130000781
Figure BDA0003269993130000791
Figure BDA0003269993130000801
Figure BDA0003269993130000811
Figure BDA0003269993130000821
Figure BDA0003269993130000831
Figure BDA0003269993130000841
Figure BDA0003269993130000851
Figure BDA0003269993130000861
Figure BDA0003269993130000871
Figure BDA0003269993130000881
Figure BDA0003269993130000891
Figure BDA0003269993130000901
Figure BDA0003269993130000911
Figure BDA0003269993130000921
Figure BDA0003269993130000931
Figure BDA0003269993130000941
Figure BDA0003269993130000951
Figure BDA0003269993130000961
序列表
<110> 塞普洛麦克斯有限公司
<120> 肝脏特异性诱导型启动子及其使用方法
<130> P265002WO
<150> GB1900741.8
<151> 2019-01-18
<160> 91
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 小鼠肌肉
<400> 1
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac c 51
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
actgtacttt cctgaccctg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc a 51
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 小鼠肌肉
<400> 3
tgtactttcc tgacct 16
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
tgtactttcc tgaccc 16
<210> 5
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3x NR1序列(小鼠)
<400> 5
gatctctgta ctttcctgac cttggatcga tctctgtact ttcctgacct tggatcgatc 60
tctgtacttt cctgaccttg gatc 84
<210> 6
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3x NR1序列(人)
<400> 6
gatcactgta ctttcctgac cctggatcga tcactgtact ttcctgaccc tggatcgatc 60
actgtacttt cctgaccctg gatc 84
<210> 7
<211> 262
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-MinTK
<400> 7
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac cgatccggcc 60
ccgcccagcg tcttgtcatt ggcgaattcg aacacgcaga tgcagtcggg gcggcgcggt 120
ccgaggtcca cttcgcatat taaggtgacg cgtgtggcct cgaacaccga gcgaccctgc 180
agcgacccgc ttaacagcgt caacagcgtg ccgcagatct cgaggagctt ggcgagattt 240
tcaggagcta aggaagctaa ac 262
<210> 8
<211> 180
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-CMV-MP
<400> 8
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac cgctgggagt 60
tcgtagacgg agcgattaat ccatatgcag gtctatataa gcagagctcg tttagtgaac 120
cgtcagatcg cctagatacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag atcgccaccc 180
<210> 9
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-SV40-MP
<400> 9
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac cgctgggagt 60
tcgtagacgg actagcccgg gctcgagatc tgcgatctgc atctcaatta gtcagcaacc 120
atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct 180
ccgccccatc gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct 240
gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctt 300
ggcattccgg tactgttggt aaagccaccc 330
<210> 10
<211> 353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-1-MinTk (2xPBREM)
<400> 10
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca 120
ccgctgggag ttcgtagacg gagatccggc cccgcccagc gtcttgtcat tggcgaattc 180
gaacacgcag atgcagtcgg ggcggcgcgg tccgaggtcc acttcgcata ttaaggtgac 240
gcgtgtggcc tcgaacaccg agcgaccctg cagcgacccg cttaacagcg tcaacagcgt 300
gccgcagatc tcgaggagct tggcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aac 353
<210> 11
<211> 424
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-2-MinTk (3xPBREM)
<400> 11
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca 120
ccgcactgaa ggtcctcaat cgtctgtact ttcctgacct tggcacagtg ccaccatcaa 180
cttgcctgac accgctggga gttcgtagac ggagatccgg ccccgcccag cgtcttgtca 240
ttggcgaatt cgaacacgca gatgcagtcg gggcggcgcg gtccgaggtc cacttcgcat 300
attaaggtga cgcgtgtggc ctcgaacacc gagcgaccct gcagcgaccc gcttaacagc 360
gtcaacagcg tgccgcagat ctcgaggagc ttggcgagat tttcaggagc taaggaagct 420
aaac 424
<210> 12
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-3-MinTk
<400> 12
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca 120
ccgcactgaa ggtcctcaat cgtctgtact ttcctgacct tggcacagtg ccaccatcaa 180
cttgcctgac accctgacct cctgccagca atatctgtac tttcctgacc ttggcacagt 240
gccaccatca acttgcctga caccgctggg agttcgtaga cggagatccg gccccgccca 300
gcgtcttgtc attggcgaat tcgaacacgc agatgcagtc ggggcggcgc ggtccgaggt 360
ccacttcgca tattaaggtg acgcgtgtgg cctcgaacac cgagcgaccc tgcagcgacc 420
cgcttaacag cgtcaacagc gtgccgcaga tctcgaggag cttggcgaga ttttcaggag 480
ctaaggaagc taaac 495
<210> 13
<211> 401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-1-SV40
<400> 13
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca 120
ccgctgggag ttcgtagacg gactagcccg ggctcgagat ctgcgatctg catctcaatt 180
agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt 240
ccgcccattc tccgccccat cgctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg 300
cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt 360
gcaaaaagct tggcattccg gtactgttgg taaagccacc c 401
<210> 14
<211> 472
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-2-SV40
<400> 14
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca 120
ccgcactgaa ggtcctcaat cgtctgtact ttcctgacct tggcacagtg ccaccatcaa 180
cttgcctgac accgctggga gttcgtagac ggactagccc gggctcgaga tctgcgatct 240
gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac 300
tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tcgctgacta atttttttta tttatgcaga 360
ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg 420
cctaggcttt tgcaaaaagc ttggcattcc ggtactgttg gtaaagccac cc 472
<210> 15
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-3-SV40
<400> 15
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca 120
ccgcactgaa ggtcctcaat cgtctgtact ttcctgacct tggcacagtg ccaccatcaa 180
cttgcctgac accctgacct cctgccagca atatctgtac tttcctgacc ttggcacagt 240
gccaccatca acttgcctga caccgctggg agttcgtaga cggactagcc cgggctcgag 300
atctgcgatc tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc 360
ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atcgctgact aatttttttt 420
atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc 480
ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag cttggcattc cggtactgtt ggtaaagcca 540
ccc 543
<210> 16
<211> 251
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-1-CMV
<400> 16
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca 120
ccgctgggag ttcgtagacg gagcgattaa tccatatgca ggtctatata agcagagctc 180
gtttagtgaa ccgtcagatc gcctagatac gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa 240
gatcgccacc c 251
<210> 17
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-2-CMV
<400> 17
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca 120
ccgcactgaa ggtcctcaat cgtctgtact ttcctgacct tggcacagtg ccaccatcaa 180
cttgcctgac accgctggga gttcgtagac ggagcgatta atccatatgc aggtctatat 240
aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cgcctagata cgccatccac gctgttttga 300
cctccataga agatcgccac cc 322
<210> 18
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-3-CMV
<400> 18
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca 120
ccgcactgaa ggtcctcaat cgtctgtact ttcctgacct tggcacagtg ccaccatcaa 180
cttgcctgac accctgacct cctgccagca atatctgtac tttcctgacc ttggcacagt 240
gccaccatca acttgcctga caccgctggg agttcgtaga cggagcgatt aatccatatg 300
caggtctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctagat acgccatcca 360
cgctgttttg acctccatag aagatcgcca ccc 393
<210> 19
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PB1-MinTK和EPO
<400> 19
ggcctaactg gccggtactc tgtactttcc tgaccttggc acagtgccac catcaacttg 60
cctgacaccg atccggcccc gcccagcgtc ttgtcattgg cgaattcgaa cacgcagatg 120
cagtcggggc ggcgcggtcc gaggtccact tcgcatatta aggtgacgcg tgtggcctcg 180
aacaccgagc gaccctgcag cgacccgctt aacagcgtca acagcgtgcc gcagatctcg 240
aggagcttgg cgagattttc aggagctaag gaagctaaac atgggggtgc acgaatgtcc 300
tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct ctgggcctcc cagtcctggg 360
cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag aggtacctct tggaggccaa 420
ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc agcttgaatg agaatatcac 480
tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg atggaggtcg ggcagcaggc 540
cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct gtcctgcggg gccaggccct 600
gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg catgtggata aagccgtcag 660
tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga gcccagaagg aagccatctc 720
ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc actgctgaca ctttccgcaa 780
actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg aagctgtaca caggggaggc 840
ctgcaggaca ggggacagat gatctagagt cggggcggcc ggccgcttcg agcagacatg 900
ataagataca ttgatgagtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtgaaa aaaatgcttt 960
atttgtgaaa tttgtgatgc tattgcttta tttgtaacca ttataagctg caataaacaa 1020
gtt 1023
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自 PBREM 的 NR1 基序
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 20
tgtactttcc tgaccn 16
<210> 21
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优选包含在PBREM元件的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 21
ctgtactttc ctgaccn 17
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优选包含在PBREM元件的功能变体中的序列
<400> 22
ctgtactttc ctgaccy 17
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优选包含在PBREM元件的功能变体中的序列
<400> 23
ctgtactttc ctgacct 17
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 优选包含在PBREM元件的功能变体中的序列
<400> 24
ctgtactttc ctgaccc 17
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 25
nctgtacttt cctgaccntg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<400> 26
wctgtacttt cctgaccytg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<400> 27
tctgtacttt cctgaccttg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<400> 28
actgtacttt cctgaccctg 20
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 29
tgtactttcc tgaccn 16
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 30
ctgtactttc ctgaccn 17
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> 任选的间隔子
<400> 31
nctgtacttt cctgaccntg 20
<210> 32
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 32
tgtactttcc tgaccntgta ctttcctgac cn 32
<210> 33
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(48)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 33
tgtactttcc tgaccntgta ctttcctgac cntgtacttt cctgaccn 48
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 34
ctgtactttc ctgaccnctg tactttcctg accn 34
<210> 35
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(18)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(34)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(35)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 35
ctgtactttc ctgaccnctg tactttcctg accnctgtac tttcctgacc n 51
<210> 36
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 36
nctgtacttt cctgaccntg nctgtacttt cctgaccntg 40
<210> 37
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(41)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (41)..(41)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (58)..(58)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 37
nctgtacttt cctgaccntg nctgtacttt cctgaccntg nctgtacttt cctgaccntg 60
<210> 38
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(41)
<223> 任选的间隔子
<400> 38
tctgtacttt cctgaccttg tctgtacttt cctgaccttg tctgtacttt cctgaccttg 60
<210> 39
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合适地包含在PBREM序列的功能变体中的序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(21)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)..(41)
<223> 任选的间隔子
<400> 39
actgtacttt cctgaccctg actgtacttt cctgaccctg actgtacttt cctgaccctg 60
<210> 40
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> spacer
<400> 40
gatcgatc 8
<210> 41
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 序列优选包含在PBREM元件的功能变体中
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(37)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(49)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 41
nctgtacttt cctgaccntg nnnnngtgnc ancatnnact tncctgannc n 51
<210> 42
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRM
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(37)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(49)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(52)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(52)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(76)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(88)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(93)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(100)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(102)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 42
nctgtacttt cctgaccntg nnnnngtgnc ancatnnact tncctgannc nnctgtactt 60
tcctgaccnt gnnnnngtgn cancatnnac ttncctgann cn 102
<210> 43
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRM
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(25)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(29)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(32)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (36)..(37)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (42)..(42)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (48)..(49)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(52)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(51)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (52)..(52)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(69)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (72)..(76)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (80)..(80)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (83)..(83)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(88)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(93)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(100)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(102)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(103)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (120)..(120)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (123)..(127)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (131)..(131)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (134)..(134)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (138)..(139)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (144)..(144)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (150)..(151)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<220>
<221> misc_feature
<222> (153)..(153)
<223> n 是 a, c, g, 或 t
<400> 43
nctgtacttt cctgaccntg nnnnngtgnc ancatnnact tncctgannc nnctgtactt 60
tcctgaccnt gnnnnngtgn cancatnnac ttncctgann cnnctgtact ttcctgaccn 120
tgnnnnngtg ncancatnna cttncctgan ncn 153
<210> 44
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRM
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(52)
<223> 任选的间隔子
<400> 44
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ctctgtactt 60
tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca cc 102
<210> 45
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRM
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(52)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(103)
<223> 任选的间隔子
<400> 45
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ctctgtactt 60
tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca cctctgtact ttcctgacct 120
tggcacagtg ccaccatcaa cttgcctgac acc 153
<210> 46
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRM
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(52)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(103)
<223> 任选的间隔子
<400> 46
actgtacttt cctgaccctg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc aactgtactt 60
tcctgaccct gaagaggtgg cagcatggac tttcctgaac caactgtact ttcctgaccc 120
tgaagaggtg gcagcatgga ctttcctgaa cca 153
<210> 47
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRM
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(52)
<223> 任选的间隔子
<400> 47
actgtacttt cctgaccctg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc aactgtactt 60
tcctgaccct gaagaggtgg cagcatggac tttcctgaac ca 102
<210> 48
<211> 5716
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pAAV-ZsGreen原始质粒
<400> 48
agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60
acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120
tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180
ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gaattgcctg 240
caggcagctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc 300
gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc 360
catcactagg ggttcctatc gatatcaagc tttaatagta atcaattacg gggtcattag 420
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 480
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 540
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 600
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 660
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 720
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 780
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 840
gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 900
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gcatctgtgc ggtatttcac accgcatacg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc 3180
ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 3240
gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 3300
ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 3360
ctcgacccca aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 3420
acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 3480
actggaacaa cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg 3540
atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 3600
aaaatattaa cgtttacaat tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca 3660
tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg 3720
ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg 3780
ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta 3840
taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat 3900
gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg 3960
agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa 4020
catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac 4080
ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac 4140
atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt 4200
ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc 4260
gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca 4320
ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc 4380
ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag 4440
gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa 4500
ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg 4560
gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa 4620
ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg 4680
gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt 4740
gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt 4800
caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag 4860
cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat 4920
ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct 4980
taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct 5040
tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca 5100
gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc 5160
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aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct 5280
gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag 5340
gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc 5400
tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg 5460
agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag 5520
cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt 5580
gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac 5640
gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg 5700
ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc 5760
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gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga 6000
taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg aatt 6044
<210> 51
<211> 4242
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGL4.10质粒骨架
<400> 51
ggcctaactg gccggtacct gagctcgcta gcctcgagga tatcaagatc tggcctcggc 60
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gaggtggaca ttacctacgc cgagtacttc gagatgagcg ttcggctggc agaagctatg 300
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ggcaaccaga tcatccccga caccgctatc ctcagcgtgg tgccatttca ccacggcttc 840
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gccaaacgct tccacctacc aggcatccgc cagggctacg gcctgacaga aacaaccagc 1140
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ttcttcgagg ctaaggtggt ggacttggac accggtaaga cactgggtgt gaaccagcgc 1260
ggcgagctgt gcgtccgtgg ccccatgatc atgagcggct acgttaacaa ccccgaggct 1320
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agcaagtaaa acctctacaa atgtggtaaa atcgataagg atccgtcgac cgatgccctt 2040
gagagccttc aacccagtca gctccttccg gtgggcgcgg ggcatgacta tcgtcgccgc 2100
acttatgact gtcttcttta tcatgcaact cgtaggacag gtgccggcag cgctcttccg 2160
cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc 2220
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acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 2460
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gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca 2700
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tggttaccag tgcttgatca gtgaggcacc gatctcagcg atctgcctat ttcgttcgtc 3180
catagtggcc tgactccccg tcgtgtagat cactacgatt cgtgagggct taccatcagg 3240
ccccagcgca gcaatgatgc cgcgagagcc gcgttcaccg gcccccgatt tgtcagcaat 3300
gaaccagcca gcagggaggg ccgagcgaag aagtggtcct gctactttgt ccgcctccat 3360
ccagtctatg agctgctgtc gtgatgctag agtaagaagt tcgccagtga gtagtttccg 3420
aagagttgtg gccattgcta ctggcatcgt ggtatcacgc tcgtcgttcg gtatggcttc 3480
gttcaactct ggttcccagc ggtcaagccg ggtcacatga tcacccatat tatgaagaaa 3540
tgcagtcagc tccttagggc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cggtgttgtc 3600
gctcatggta atggcagcac tacacaattc tcttaccgtc atgccatccg taagatgctt 3660
ttccgtgacc ggcgagtact caaccaagtc gttttgtgag tagtgtatac ggcgaccaag 3720
ctgctcttgc ccggcgtcta tacgggacaa caccgcgcca catagcagta ctttgaaagt 3780
gctcatcatc gggaatcgtt cttcggggcg gaaagactca aggatcttgc cgctattgag 3840
atccagttcg atatagccca ctcttgcacc cagttgatct tcagcatctt ttactttcac 3900
cagcgtttcg gggtgtgcaa aaacaggcaa gcaaaatgcc gcaaagaagg gaatgagtgc 3960
gacacgaaaa tgttggatgc tcatactcgt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 4020
gggttactag tacgtctctc aaggataagt aagtaatatt aaggtacggg aggtattgga 4080
caggccgcaa taaaatatct ttattttcat tacatctgtg tgttggtttt ttgtgtgaat 4140
cgatagtact aacatacgct ctccatcaaa acaaaacgaa acaaaacaaa ctagcaaaat 4200
aggctgtccc cagtgcaagt gcaggtgcca gaacatttct ct 4242
<210> 52
<211> 584
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CMV-IE比较启动子
<400> 52
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
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tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agct 584
<210> 53
<211> 8191
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pcDNA6.0β-半乳糖苷酶转染对照
<400> 53
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
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aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900
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aggctgaagt tcagatgtgc ggcgagttgc gtgactacct acgggtaaca gtttctttat 1740
ggcagggtga aacgcaggtc gccagcggca ccgcgccttt cggcggtgaa attatcgatg 1800
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agaacaactt taacgccgtg cgctgttcgc attatccgaa ccatccgctg tggtacacgc 2160
tgtgcgaccg ctacggcctg tatgtggtgg atgaagccaa tattgaaacc cacggcatgg 2220
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cccgcccggt gcagtatgaa ggcggcggag ccgacaccac ggccaccgat attatttgcc 2460
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gtttacaggg cggcttcgtc tgggactggg tggatcagtc gctgattaaa tatgatgaaa 2700
acggcaaccc gtggtcggct tacggcggtg attttggcga tacgccgaac gatcgccagt 2760
tctgtatgaa cggtctggtc tttgccgacc gcacgccgca tccagcgctg acggaagcaa 2820
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agccgctggc aagcggtgaa gtgcctctgg atgtcgctcc acaaggtaaa cagttgattg 3000
aactgcctga actaccgcag ccggagagcg ccgggcaact ctggctcaca gtacgcgtag 3060
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gcgatcagtt cacccgtgca ccgctggata acgacattgg cgtaagtgaa gcgacccgca 3360
ttgaccctaa cgcctgggtc gaacgctgga aggcggcggg ccattaccag gccgaagcag 3420
cgttgttgca gtgcacggca gatacacttg ctgatgcggt gctgattacg accgctcacg 3480
cgtggcagca tcaggggaaa accttattta tcagccggaa aacctaccgg attgatggta 3540
gtggtcaaat ggcgattacc gttgatgttg aagtggcgag cgatacaccg catccggcgc 3600
ggattggcct gaactgccag ctggcgcagg tagcagagcg ggtaaactgg ctcggattag 3660
ggccgcaaga aaactatccc gaccgcctta ctgccgcctg ttttgaccgc tgggatctgc 3720
cattgtcaga catgtatacc ccgtacgtct tcccgagcga aaacggtctg cgctgcggga 3780
cgcgcgaatt gaattatggc ccacaccagt ggcgcggcga cttccagttc aacatcagcc 3840
gctacagtca acagcaactg atggaaacca gccatcgcca tctgctgcac gcggaagaag 3900
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gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca 4920
aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg 4980
cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc 5040
gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat 5100
tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctctgcctct gagctattcc agaagtagtg 5160
aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctc ccgggagctt gtatatccat 5220
tttcggatct gatcagcacg tgttgacaat taatcatcgg catagtatat cggcatagta 5280
taatacgaca aggtgaggaa ctaaaccatg gccaagcctt tgtctcaaga agaatccacc 5340
ctcattgaaa gagcaacggc tacaatcaac agcatcccca tctctgaaga ctacagcgtc 5400
gccagcgcag ctctctctag cgacggccgc atcttcactg gtgtcaatgt atatcatttt 5460
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ggctaagcac ttcgtggccg aggagcagga ctgacacgtg ctacgagatt tcgattccac 5760
cgccgccttc tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat 5820
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ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc 5940
actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctgtatacc 6000
gtcgacctct agctagagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 6060
ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 6120
tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 6180
gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 6240
gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 6300
gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 6360
taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 6420
cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 6480
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 6540
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 6600
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 6660
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 6720
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 6780
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 6840
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 6900
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 6960
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 7020
tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 7080
ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 7140
aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 7200
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 7260
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 7320
tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 7380
agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 7440
taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 7500
tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 7560
cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 7620
ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 7680
tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 7740
tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 7800
cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 7860
tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 7920
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 7980
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 8040
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 8100
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 8160
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt c 8191
<210> 54
<211> 3196
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pGL4.10-CMV-MP-EPO
<400> 54
ggcctaactg gccggtaccg tcgacgatat cggatccagg tctatataag cagagctcgt 60
ttagtgaacc gtcagatcgc ctagatacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga 120
tcgccaccat gggggtgcac gaatgtcctg cctggctgtg gcttctcctg tccctgctgt 180
cgctccctct gggcctccca gtcctgggcg ccccaccacg cctcatctgt gacagccgag 240
tcctggagag gtacctcttg gaggccaagg aggccgagaa tatcacgacg ggctgtgctg 300
aacactgcag cttgaatgag aatatcactg tcccagacac caaagttaat ttctatgcct 360
ggaagaggat ggaggtcggg cagcaggccg tagaagtctg gcagggcctg gccctgctgt 420
cggaagctgt cctgcggggc caggccctgt tggtcaactc ttcccagccg tgggagcccc 480
tgcagctgca tgtggataaa gccgtcagtg gccttcgcag cctcaccact ctgcttcggg 540
ctctgggagc ccagaaggaa gccatctccc ctccagatgc ggcctcagct gctccactcc 600
gaacaatcac tgctgacact ttccgcaaac tcttccgagt ctactccaat ttcctccggg 660
gaaagctgaa gctgtacaca ggggaggcct gcaggacagg ggacagatga tctagagtcg 720
gggcggccgg ccgcttcgag cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac 780
aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt 840
tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt 900
tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg 960
taaaatcgat aaggatccgt cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct 1020
tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc 1080
aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc 1140
tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc 1200
acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg 1260
aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat 1320
cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag 1380
gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga 1440
tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg 1500
tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt 1560
cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac 1620
gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc 1680
ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt 1740
ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc 1800
ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc 1860
agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg 1920
aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag 1980
atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg 2040
tctgacagcg gccgcaaatg ctaaaccact gcagtggtta ccagtgcttg atcagtgagg 2100
caccgatctc agcgatctgc ctatttcgtt cgtccatagt ggcctgactc cccgtcgtgt 2160
agatcactac gattcgtgag ggcttaccat caggccccag cgcagcaatg atgccgcgag 2220
agccgcgttc accggccccc gatttgtcag caatgaacca gccagcaggg agggccgagc 2280
gaagaagtgg tcctgctact ttgtccgcct ccatccagtc tatgagctgc tgtcgtgatg 2340
ctagagtaag aagttcgcca gtgagtagtt tccgaagagt tgtggccatt gctactggca 2400
tcgtggtatc acgctcgtcg ttcggtatgg cttcgttcaa ctctggttcc cagcggtcaa 2460
gccgggtcac atgatcaccc atattatgaa gaaatgcagt cagctcctta gggcctccga 2520
tcgttgtcag aagtaagttg gccgcggtgt tgtcgctcat ggtaatggca gcactacaca 2580
attctcttac cgtcatgcca tccgtaagat gcttttccgt gaccggcgag tactcaacca 2640
agtcgttttg tgagtagtgt atacggcgac caagctgctc ttgcccggcg tctatacggg 2700
acaacaccgc gccacatagc agtactttga aagtgctcat catcgggaat cgttcttcgg 2760
ggcggaaaga ctcaaggatc ttgccgctat tgagatccag ttcgatatag cccactcttg 2820
cacccagttg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttcggggtgt gcaaaaacag 2880
gcaagcaaaa tgccgcaaag aagggaatga gtgcgacacg aaaatgttgg atgctcatac 2940
tcgtcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ctagtacgtc tctcaaggat 3000
aagtaagtaa tattaaggta cgggaggtat tggacaggcc gcaataaaat atctttattt 3060
tcattacatc tgtgtgttgg ttttttgtgt gaatcgatag tactaacata cgctctccat 3120
caaaacaaaa cgaaacaaaa caaactagca aaataggctg tccccagtgc aagtgcaggt 3180
gccagaacat ttctct 3196
<210> 55
<211> 13
<212> DNA
<213> 小鼠肌肉
<400> 55
tggcacagtg cca 13
<210> 56
<211> 13
<212> DNA
<213> 智人
<400> 56
tgaagaggtg gca 13
<210> 57
<211> 16
<212> DNA
<213> 小鼠肌肉
<400> 57
tcaacttgcc tgacac 16
<210> 58
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 58
tggactttcc tgaacc 16
<210> 59
<211> 273
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 NR1x3-Min TK
<400> 59
actgtacttt cctgaccctg aagagactgt actttcctga ccctgaagag actgtacttt 60
cctgaccctg aagaggatcc ggccccgccc agcgtcttgt cattggcgaa ttcgaacacg 120
cagatgcagt cggggcggcg cggtccgagg tccacttcgc atattaaggt gacgcgtgtg 180
gcctcgaaca ccgagcgacc ctgcagcgac ccgcttaaca gcgtcaacag cgtgccgcag 240
atctcgagga gcttggcgag attttcagga gct 273
<210> 60
<211> 286
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人 PBREM-MinTK
<400> 60
actgtacttt cctgaccctg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc agatccggcc 60
ccgcccagcg tcttgtcatt ggcgaattcg aacacgcaga tgcagtcggg gcggcgcggt 120
ccgaggtcca cttcgcatat taaggtgacg cgtgtggcct cgaacaccga gcgaccctgc 180
agcgacccgc ttaacagcgt caacagcgtg ccgcagatct cgaggagctt ggcgagattt 240
tcaggagcta aggaagctaa acatggaaga tgccaaaaac attaag 286
<210> 61
<211> 286
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hNR1-mNFI-hNR2-Min TK (HMH MinTK)
<400> 61
actgtacttt cctgaccctg gcacagtgcc accatggact ttcctgaacc agatccggcc 60
ccgcccagcg tcttgtcatt ggcgaattcg aacacgcaga tgcagtcggg gcggcgcggt 120
ccgaggtcca cttcgcatat taaggtgacg cgtgtggcct cgaacaccga gcgaccctgc 180
agcgacccgc ttaacagcgt caacagcgtg ccgcagatct cgaggagctt ggcgagattt 240
tcaggagcta aggaagctaa acatggaaga tgccaaaaac attaag 286
<210> 62
<211> 286
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hNR1-mNFI mNR2-Min TK (HMM MinTK)
<400> 62
actgtacttt cctgaccctg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac cgatccggcc 60
ccgcccagcg tcttgtcatt ggcgaattcg aacacgcaga tgcagtcggg gcggcgcggt 120
ccgaggtcca cttcgcatat taaggtgacg cgtgtggcct cgaacaccga gcgaccctgc 180
agcgacccgc ttaacagcgt caacagcgtg ccgcagatct cgaggagctt ggcgagattt 240
tcaggagcta aggaagctaa acatggaaga tgccaaaaac attaag 286
<210> 63
<211> 286
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mNR1-hNFI-mNR2-Min TK (MHM MinTK)
<400> 63
tctgtacttt cctgaccttg aagaggtggc accatcaact tgcctgacac cgatccggcc 60
ccgcccagcg tcttgtcatt ggcgaattcg aacacgcaga tgcagtcggg gcggcgcggt 120
ccgaggtcca cttcgcatat taaggtgacg cgtgtggcct cgaacaccga gcgaccctgc 180
agcgacccgc ttaacagcgt caacagcgtg ccgcagatct cgaggagctt ggcgagattt 240
tcaggagcta aggaagctaa acatggaaga tgccaaaaac attaag 286
<210> 64
<211> 286
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mNR1-hNFI hNR2-Min TK (MHH MinTK)
<400> 64
tctgtacttt cctgaccttg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc agatccggcc 60
ccgcccagcg tcttgtcatt ggcgaattcg aacacgcaga tgcagtcggg gcggcgcggt 120
ccgaggtcca cttcgcatat taaggtgacg cgtgtggcct cgaacaccga gcgaccctgc 180
agcgacccgc ttaacagcgt caacagcgtg ccgcagatct cgaggagctt ggcgagattt 240
tcaggagcta aggaagctaa acatggaaga tgccaaaaac attaag 286
<210> 65
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hPB-SV40
<400> 65
actgtacttt cctgaccctg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc agctgggagt 60
tcgtagacgg actagcccgg gctcgagatc tgcgatctgc atctcaatta gtcagcaacc 120
atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct 180
ccgccccatc gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct 240
gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctt 300
ggcattccgg tactgttggt aaagccaccc 330
<210> 66
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MHM-SV40
<400> 66
tctgtacttt cctgaccttg aagaggtggc accatcaact tgcctgacac cgctgggagt 60
tcgtagacgg actagcccgg gctcgagatc tgcgatctgc atctcaatta gtcagcaacc 120
atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct 180
ccgccccatc gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct 240
gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctt 300
ggcattccgg tactgttggt aaagccaccc 330
<210> 67
<211> 401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2xhPB SV40
<400> 67
actgtacttt cctgaccctg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc acattactcg 60
catccattct cactgtactt tcctgaccct gaagaggtgg cagcatggac tttcctgaac 120
cagctgggag ttcgtagacg gactagcccg ggctcgagat ctgcgatctg catctcaatt 180
agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt 240
ccgcccattc tccgccccat cgctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg 300
cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt 360
gcaaaaagct tggcattccg gtactgttgg taaagccacc c 401
<210> 68
<211> 353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2xMHM-MinTK
<400> 68
tctgtacttt cctgaccttg aagaggtggc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt gaagaggtgg caccatcaac ttgcctgaca 120
ccgctgggag ttcgtagacg gagatccggc cccgcccagc gtcttgtcat tggcgaattc 180
gaacacgcag atgcagtcgg ggcggcgcgg tccgaggtcc acttcgcata ttaaggtgac 240
gcgtgtggcc tcgaacaccg agcgaccctg cagcgacccg cttaacagcg tcaacagcgt 300
gccgcagatc tcgaggagct tggcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aac 353
<210> 69
<211> 401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2xMHM-SV40
<400> 69
tctgtacttt cctgaccttg aagaggtggc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt gaagaggtgg caccatcaac ttgcctgaca 120
ccgctgggag ttcgtagacg gactagcccg ggctcgagat ctgcgatctg catctcaatt 180
agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt 240
ccgcccattc tccgccccat cgctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg 300
cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt 360
gcaaaaagct tggcattccg gtactgttgg taaagccacc c 401
<210> 70
<211> 424
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3xhPB-minTK
<400> 70
actgtacttt cctgaccctg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc acattactcg 60
catccattct cactgtactt tcctgaccct gaagaggtgg cagcatggac tttcctgaac 120
cagcactgaa ggtcctcaat cgactgtact ttcctgaccc tgaagaggtg gcagcatgga 180
ctttcctgaa ccagctggga gttcgtagac ggagatccgg ccccgcccag cgtcttgtca 240
ttggcgaatt cgaacacgca gatgcagtcg gggcggcgcg gtccgaggtc cacttcgcat 300
attaaggtga cgcgtgtggc ctcgaacacc gagcgaccct gcagcgaccc gcttaacagc 360
gtcaacagcg tgccgcagat ctcgaggagc ttggcgagat tttcaggagc taaggaagct 420
aaac 424
<210> 71
<211> 472
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3xhPB-SV40
<400> 71
actgtacttt cctgaccctg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc acattactcg 60
catccattct cactgtactt tcctgaccct gaagaggtgg cagcatggac tttcctgaac 120
cagcactgaa ggtcctcaat cgactgtact ttcctgaccc tgaagaggtg gcagcatgga 180
ctttcctgaa ccagctggga gttcgtagac ggactagccc gggctcgaga tctgcgatct 240
gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac 300
tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tcgctgacta atttttttta tttatgcaga 360
ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg 420
cctaggcttt tgcaaaaagc ttggcattcc ggtactgttg gtaaagccac cc 472
<210> 72
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HMH杂合
<400> 72
actgtacttt cctgaccctg gcacagtgcc accatggact ttcctgaacc a 51
<210> 73
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HMM杂合
<400> 73
actgtacttt cctgaccctg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac c 51
<210> 74
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MHM杂合
<400> 74
tctgtacttt cctgaccttg aagaggtggc accatcaact tgcctgacac c 51
<210> 75
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MHH杂合
<400> 75
tctgtacttt cctgaccttg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc a 51
<210> 76
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2x 小鼠 PBREM CREs
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(52)
<223> 任选的间隔子
<400> 76
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac cctgtacttt 60
cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac c 101
<210> 77
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3x 小鼠 PBREM CREs
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(52)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(103)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (153)..(154)
<223> 任选的间隔子
<400> 77
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ctctgtactt 60
tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca cctctgtact ttcctgacct 120
tggcacagtg ccaccatcaa cttgcctgac acctctgtac tttcctgacc ttggcacagt 180
gccaccatca acttgcctga cacc 204
<210> 78
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2x MHM杂合 CREs
<220>
<221> misc_feature
<222> (50)..(51)
<223> 任选的间隔子
<400> 78
ctgtactttc ctgaccttga agaggtggca ccatcaactt gcctgacacc tctgtacttt 60
cctgaccttg aagaggtggc accatcaact tgcctgacac c 101
<210> 79
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2x 人 PBREM CREs
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(52)
<223> 任选的间隔子
<400> 79
actgtacttt cctgaccctg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc aactgtactt 60
tcctgaccct gaagaggtgg cagcatggac tttcctgaac ca 102
<210> 80
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3x 人 PBREM CREs
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(52)
<223> 任选的间隔子
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(103)
<223> 任选的间隔子
<400> 80
actgtacttt cctgaccctg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc aactgtactt 60
tcctgaccct gaagaggtgg cagcatggac tttcctgaac caactgtact ttcctgaccc 120
tgaagaggtg gcagcatgga ctttcctgaa cca 153
<210> 81
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2x 小鼠 PBREM CREs
<400> 81
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca 120
cc 122
<210> 82
<211> 264
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3x 小鼠 PBREM
<400> 82
tctgtacttt cctgaccttg gcacagtgcc accatcaact tgcctgacac ccattactcg 60
catccattct ctctgtactt tcctgacctt ggcacagtgc caccatcaac ttgcctgaca 120
ccgcactgaa ggtcctcaat cgtctgtact ttcctgacct tggcacagtg ccaccatcaa 180
cttgcctgac accctgacct cctgccagca atatctgtac tttcctgacc ttggcacagt 240
gccaccatca acttgcctga cacc 264
<210> 83
<211> 121
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2x MHM杂合
<400> 83
ctgtactttc ctgaccttga agaggtggca ccatcaactt gcctgacacc cattactcgc 60
atccattctc tctgtacttt cctgaccttg aagaggtggc accatcaact tgcctgacac 120
c 121
<210> 84
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2x 人 PBREM
<400> 84
actgtacttt cctgaccctg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc acattactcg 60
catccattct cactgtactt tcctgaccct gaagaggtgg cagcatggac tttcctgaac 120
ca 122
<210> 85
<211> 193
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3x 人 PBREM
<400> 85
actgtacttt cctgaccctg aagaggtggc agcatggact ttcctgaacc acattactcg 60
catccattct cactgtactt tcctgaccct gaagaggtgg cagcatggac tttcctgaac 120
cagcactgaa ggtcctcaat cgactgtact ttcctgaccc tgaagaggtg gcagcatgga 180
ctttcctgaa cca 193
<210> 86
<211> 18
<212> DNA
<213> 小鼠肌肉
<400> 86
tctgtacttt cctgacct 18
<210> 87
<211> 18
<212> DNA
<213> 智人
<400> 87
actgtacttt cctgaccc 18
<210> 88
<211> 16
<212> DNA
<213> 小鼠肌肉
<400> 88
tggcacagtg ccacca 16
<210> 89
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人
<400> 89
tgaagaggtg gcagca 16
<210> 90
<211> 17
<212> DNA
<213> 小鼠肌肉
<400> 90
tcaacttgcc tgacacc 17
<210> 91
<211> 17
<212> DNA
<213> 智人
<400> 91
tggactttcc tgaacca 17

Claims (47)

1.一种基因治疗载体，其包含表达盒，所述表达盒包含可操作地连接到基因的合成肝特异性诱导型启动子，所述合成肝特异性诱导型启动子包含能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的顺式调节元件(CRE)。
2.根据权利要求1所述的基因治疗载体，其中能够被CAR-RXR异二聚体结合和激活的CRE包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的功能变体或由SEQID NO:1或SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的功能变体组成。
3.根据权利要求1或2所述的基因治疗载体，其中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的功能变体包含来自PBREM的NR1基序，优选序列TGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO:20)或与序列TGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO：20)在不超过2个，优选不超过1个核苷酸位置处不同的序列。
4.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的功能变体包含以下序列之一：
-[TGTACTTTCCTGACCN-S-]n(SEQ ID NO:29)；
-[CTGTACTTTCCTGACCN-S-]n(SEQ ID NO:30)；和
-[NCTGTACTTTCCTGACCNTG-S-]n(SEQ ID NO:31),
其中S是任选的间隔子，n是1-5，任选2-4，优选3。
5.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的功能变体包含以下序列之一：
-TGTACTTTCCTGACCN-S-TGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO:32)；
-TGTACTTTCCTGACCN-S-TGTACTTTCCTGACCN-S-TGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO:33)；
-CTGTACTTTCCTGACCN-S-CTGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO:34)；
-CTGTACTTTCCTGACCN-S-CTGTACTTTCCTGACCN-S-CTGTACTTTCCTGACCN(SEQ ID NO:35)；和
-NCTGTACTTTCCTGACCNTG-S-NCTGTACTTTCCTGACCNTG(SEQ ID NO:36)；和
-NCTGTACTTTCCTGACCNTG-S-NCTGTACTTTCCTGACCNTG-S-NCTGTACTTTCCTGACCNTG(SEQID NO:37),
其中S是任选的间隔子。
6.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的功能变体包含以下序列之一：
-TCTGTACTTTCCTGACCTTG-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTG-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTG(SEQID NO:38)；或
-ACTGTACTTTCCTGACCCTG-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTG-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTG(SEQID NO:39)，
其中S是任选的间隔子。
7.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的功能变体包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少60％相同的序列，优选与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少65％、75％、80％、85％、90％、95％或99％相同的序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的功能变体包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2在跨越核苷酸3至18的区域(优选跨越核苷酸1至20的区域)中至少90％相同，优选至少95％相同，更优选完全相同，并且与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的其余部分至少70％、80％、85％、90％、95％或99％相同的序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的功能变体包含以下序列：
NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN(SEQ ID NO:41)，或与其至少90％，优选95％，更优选99％相同的序列。
10.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其包含多个CRE，每个CRE能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活。
11.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其包含2或3个CRE，每个CRE能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活。
12.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其包含合成肝特异性诱导型启动子，所述启动子包含顺式调控模块(CRM)，所述顺式调控模块包含以下序列之一或由以下序列之一组成:
-NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN-S-NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN(SEQ ID NO:42)；和
-NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN-S-NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN-S-NCTGTACTTTCCTGACCNTGNNNNNGTGNCANCATNNACTTNCCTGANNCN(SEQ ID NO:43),
其中S是任选的间隔子。
13.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其包含合成肝特异性诱导型启动子，所述启动子包含CRM，所述CRM包含以下序列之一或由以下序列之一组成:
-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC(SEQ ID NO:44)；
-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC-S-TCTGTACTTTCCTGACCTTGGCACAGTGCCACCATCAACTTGCCTGACACC(SEQ ID NO:45)；
-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA(SEQ ID NO:46)；和
-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA-S-ACTGTACTTTCCTGACCCTGAAGAGGTGGCAGCATGGACTTTCCTGAACCA(SEQ ID NO:47)，
其中S是任选的间隔子。
14.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其基本上不包含导致组成型表达或在非肝细胞中表达的核酸序列。
15.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其包含能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的CRE，所述异二聚体可操作地连接到最小启动子或近端启动子。
16.根据权利要求15所述的基因治疗载体，其中最小启动子是HSV胸苷激酶最小启动子(MinTK)、CMV最小启动子(CMVmp)或SV40最小启动子(SV40mp)。
17.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其包含根据SEQ ID NO:7至18和59至71中任一个的序列，或其任一个的功能变体。
18.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其包含根据SEQ ID NO:7、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:71的序列，或其任一个的功能变体。
19.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中合成肝特异性表达盒包含提供或编码核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子、转录终止序列、编码转录后调控元件的核酸和/或polyA元件中的一个或多个，优选所有的序列。
20.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中所述基因编码蛋白质或RNA。
21.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中所述基因编码治疗性表达产物，优选适用于治疗与肝脏中异常基因表达相关的疾病或病症的治疗性蛋白质。
22.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其中所述基因编码位点特异性核酸酶，例如巨核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、基于转录激活因子样效应子的核酸酶(TALEN)或聚集的规则间隔短回文重复系统(CRISPR-Cas)。
23.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其为病毒载体，例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(AAV)载体。
24.根据前述权利要求中任一项所述的基因治疗载体，其为质粒。
25.一种表达盒，其包含可操作地连接到基因的合成肝特异性诱导型启动子，该合成肝特异性诱导型启动子包含能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的CRE。
26.根据权利要求25所述的表达盒，其中所述基因不是报道基因。
27.根据权利要求25或26所述的表达盒，其中所述基因编码治疗性表达产物。
28.一种合成肝特异性诱导型启动子，其包含根据SEQ ID NOs:7至18和59至71中任一个的序列，或其任一个的功能变体。
29.一种重组病毒体，其包含根据权利要求1至24中任一项所述的基因治疗载体、根据权利要求25至27中任一项所述的表达盒或根据权利要求28所述的启动子。
30.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至24中任一项所述的基因治疗载体、根据权利要求25至27中任一项所述的表达盒、根据权利要求28所述的启动子或根据权利要求29所述的病毒体。
31.一种细胞，其包含根据权利要求1至24中任一项所述的基因治疗载体、根据权利要求25至27中任一项所述的表达盒、根据权利要求28所述的启动子或根据权利要求29所述的病毒体。
32.根据权利要求31所述的细胞，其为肝细胞，任选地为细胞培养物中的肝细胞或存在于受试者肝脏中的肝细胞。
33.根据权利要求1至24中任一项所述的基因治疗载体、根据权利要求25至27中任一项所述的表达盒、根据权利要求28所述的启动子、根据权利要求29所述的病毒体或根据权利要求30所述的药物组合物在治疗疾病中的用途，优选与肝脏中异常基因表达相关的疾病。
34.一种在细胞，优选肝细胞中产生表达产物，优选治疗性表达产物的方法，所述方法包括:
-提供包含表达盒的细胞，所述表达盒包含可操作地连接到基因的合成肝特异性诱导型启动子，该合成肝特异性诱导型启动子包含能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的顺式调节元件(CRE)；和
-给所述细胞施用诱导剂，所述诱导剂能够诱导与所述表达盒中的诱导型启动子可操作连接的基因的表达产物的表达。
35.根据权利要求34所述的方法，其包括将所述肝细胞维持在合适的条件下，以表达来自基因的表达产物。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述诱导剂包括一种或多种选自下列的试剂:
苯巴比妥(PB)；黄酮类化合物，例如黄酮、白杨素、黄芩素或高良姜素；1，4-双[2-(3，5-二氯吡啶氧基)]苯(TCPOBOP)；6-(4氯苯基)咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑-5-甲醛-O-(3，4-二氯苄基)肟(CITCO)；对乙酰氨基酚；丁丙诺啡；苯妥英；卡马西平；丙戊酸；青蒿素及其衍生物；氯丙嗪；依法韦仑；奈韦拉平；利匹维林；依曲韦林；地西泮；环磷酰胺；异环磷酰胺；西利伐他汀；辛伐他汀；洛伐他汀；取代的磺酰胺；噻唑烷-4-酮；雌二醇；雌酮及其类似物；17α-乙炔基-3；17β-雌二醇(EE2)；脱氢表雄酮(DHEA)；5β-孕烷-3,20-二酮；己烯雌酚；银杏提取物；高良姜素；白杨素；黄芩素；二烯丙基硫化物；鞣花酸；白藜芦醇；角鲨烷素-1；白果内酯；三氯卡班；三氯生；二氯二苯三氯乙烷(DDT)；狄氏剂；甲氧氯；美托氟汀；氯菊酯；除虫菊素；砜虫啶；邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)；环丙唑醇；氟康唑；丙环唑；FL81；三对甲基苯基磷酸酯(TMPP)；UM104和UM145。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述诱导剂包括一种或多种选自下列的试剂:
苯巴比妥(PB)；黄酮类化合物，如黄酮、白杨素、黄芩素或高良姜素；对乙酰氨基酚；丁丙诺啡；苯巴比妥；苯妥英；卡马西平；丙戊酸；青蒿素及其衍生物；氯丙嗪；依法韦仑；奈韦拉平；利匹维林；依曲韦林；地西泮；环磷酰胺；异环磷酰胺；西利伐他汀；辛伐他汀；洛伐他汀；取代的磺酰胺；和噻唑烷-4-酮。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其包括停止施用所述诱导剂。
39.根据权利要求34至38中任一项所述的方法，其包括随时间改变施用给细胞的诱导剂的浓度。
40.根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其包括将所述合成肝特异性表达盒引入所述细胞的步骤。
41.一种在受试者的肝细胞中表达治疗性转基因的方法，所述方法包括将根据权利要求1至24中任一项所述的基因治疗载体引入肝细胞，然后给细胞施用诱导剂。
42.一种对有需要的受试者，优选人，进行基因治疗的方法，所述方法包括:
-将包含编码治疗产物的基因的根据权利要求1至24中任一项所述的基因治疗载体、根据权利要求25至27中任一项所述的表达盒、根据权利要求29所述的病毒体或根据权利要求30所述的药物组合物引入受试者的肝脏；和
-给受试者施用诱导剂，使得治疗有效量的治疗产物在受试者中表达。
43.根据权利要求42所述的方法，其包括随时间改变施用于受试者的诱导剂的量，以调节受试者中提供的治疗性基因产物的剂量。
44.根据权利要求42或43所述的方法，其包括以下步骤:
-确定在受试者中表达的治疗产物的量或评估受试者对治疗产物的反应；
a)当在受试者中需要更高量的治疗产品时，增加施用于受试者的诱导剂的量，或者
b)当在受试者中需要更低量的治疗产物时，减少施用于受试者的诱导剂的量。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的方法，其包括改变诱导剂以改变受试者中治疗产物的量。
46.根据权利要求1至24中任一项所述的基因治疗载体、根据权利要求25至27中任一项所述的表达盒、根据权利要求28所述的启动子、根据权利要求29所述的病毒体用于制备用于治疗本文所述任何病况或疾病的药物组合物的用途。
47.另一方面，本发明提供了一种生产表达产物的方法，该方法包括以下步骤:
a)提供真核细胞群，优选动物细胞，更优选哺乳动物细胞，更优选肝细胞，所述真核细胞群包含表达盒，所述表达盒包含可操作地连接到基因的合成肝特异性诱导型启动子，所述合成肝特异性诱导型启动子包含能够被CAR和RXR的异二聚体结合和激活的顺式调节元件(CRE)；
b)培养所述细胞群；和
c)给所述细胞施用诱导剂，所述诱导剂能够诱导与所述表达盒中的诱导型启动子可操作连接的基因的表达产物的表达；和
d)回收表达产物。
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