CN113599408A - 金银花提取物在制备atp柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种金银花提取物在制备ATP柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途,本申请经筛选发现,金银花提取物对ACL呈现显著抑制作用,IC50值为2.65±0.83μg/mL,结果显示,该植物提取物可能对高血脂、动脉粥样硬化、脂肪肝、II型糖尿病、癌症及其它由ACL所介导的疾病具有治疗作用,从而在制药领域有巨大的潜在用途。本申请的金银花提取物可经本领域技术人员熟知的方法制备获得。例如,以金银花为原料,可采用溶剂提取法以及层析法制成浓缩的金银花提取物。基于该用途本申请还提供一种ATP柠檬酸裂解酶抑制剂,该抑制剂以金银花提取物为活性成分,金银花提取物独立使用或与药学上可接受的载体或赋形剂制备成药剂。
Description
技术领域
本申请涉及医药用途技术领域,具体涉及一种金银花提取物在制备ATP柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途。
背景技术
ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)是糖代谢与脂肪酸和胆固醇生物合成的关键酶,其作用底物和产物是糖代谢中的关键中间产物,并可作为脂肪酸合成的底物。人体ACL酶蛋白是由4个相同的120KDa亚基组成的同源四聚体,每个多肽链含有1101个氨基残基(Singh et al,J.Biol.Chem.1976,251,5254-5250)。ACL是一种胞质酶,催化柠檬酸和辅酶A转化为乙酰辅酶A和草酰乙酸,同时伴随着ATP的水解。ACL在肝脏、肾脏、胰腺等生脂细胞和胆碱能神经细胞中高度表达(Beigneux et al.,J.Biol.Chem.2004,279,9557-9564),其催化衍生的乙酰辅酶A也被用于胆固醇的生物合成。作为胞质乙酰辅酶A的主要来源,ACL与脂肪酸和胆固醇的合成密切相关,其表达的改变与人类心血管疾病、脂肪肝、2型糖尿病、癌症等密切相关。
心血管疾病(cardiovascular diseases,CVDs)是世界上最主要的死亡原因,据世界卫生组织(world health organization,WHO)指出,CVDs几乎占全球死亡人数的三分之一(Mendis et al,Prog.Cardiovasc.Dis.2010,53,10-14)。寻找预防或治疗CDVs药物已成为全球公共卫生的优先事项。ACL是联结营养代谢与胆固醇和脂肪酸合成之间普遍存在的酶,研究表明,胆固醇和甘油三酯代谢紊乱促进人类心血管疾病的发生。新生胆固醇和脂肪酸的生物合成途径都依赖于ACL催化衍生所提供的乙酰辅酶A,ACL抑制剂能够有效阻断脂肪酸和胆固醇的从头合成,并降低血脂(Burke et al.,Curr.Opin.Lipidol.2017,28,193–200;Pinkosky et al.,Trends Mol.Med.2017,23,1047–1063)。因此,寻找有效的ACL抑制剂对于治疗或预防CDVs的发生有着非常重要的应用前景。此外,甘油三脂酸的代谢异常也增加非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)和II型糖尿病(TypeII Diabetes Mellitus,T2DM)的危险因素,因此,ACL还可作为非酒精性脂肪肝和II型糖尿病的潜在靶点(Cohen et al,Science2011,332,1519-1523;Armstrong et al.,Hepatology 2014,59,1174-1197)。
研究表明ACL还与癌症的发生密切相关。脂类合成的增加为细胞生长和分裂提供必须的脂质,是癌症的重要标志之一,也是肿瘤发生的早期事件(Migita et al,CancerRes.2008,68,8547-8554)。乙酰辅酶A是脂肪酸从头合成的重要组成部分,ACL作为乙酰辅酶A的主要来源,抑制其基因的表达能显著的抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。因此,ACL作为抗癌的潜在靶点在近年来被广泛研究,寻找其有效的抑制剂有望成为新的抗癌药物(Granchi et al.,Eur.J.Med.Chem.2018,157,1276–1291;Zaidi et al.,CancerRes.2012,72:3709–3714)。
ACL作为新的药用靶点已成为近年糖脂代谢紊乱疾病创新药物研究的一个热点。随着高通量筛选技术的广泛运用,已陆续发现较多种类的ACL小分子抑制剂。但目前尚未有ACL抑制剂得以成功上市,因此在医药领域竞争十分激烈。Bempedoic acid(有机合成而得)是有效的ACL小分子抑制剂,目前已被FDA批准用于高胆固醇血症的治疗。除Bempedoicacid外,其它ACL抑制剂,由于其低细胞穿透力、与ACL的低亲和力以及特异性不强等原因,研制受到限制。因此寻找高效、高选择性,同时兼具良好药代动力学性质的小分子ACL抑制剂具有重要意义,对于心血管疾病和癌症等疾病的治疗有着广阔的应用前景。
天然产物一直是药物分子的主要来源之一(Atanasov et al,Nat.Rev.DrugDiscov.,2021,20,200-216;Newman et al.,J.Nat.Prod.2020,83:770-803;Tiago etal.,Nat.Chem.2016,8:531-541)。与合成化学药物相比,植物提取物和组分具有低毒副、不抗药、结构多样和多靶点等优势。因此,从丰富的植物资源(特别是传统药用植物,如中药)中寻找新型ACL小分子抑制剂是现代医药行业发展的重要方向之一。
发明内容
本申请的目的是提供一种金银花提取物的医药用途,本申请经多次药理试验研究发现,金银花提取物具有显著的ACL(ATP柠檬酸裂解酶)抑制活性,基于此,本申请提供一种金银花提取物在制备ATP柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途。
金银花(LoniceraeJaponicaeFlos)别名金银藤、二宝藤、双花、二花等,为忍冬科(Caprifoliacere)多年生半常绿缠绕匍匐灌木忍冬(Lonicera japonicaThunb.)的干燥花蕾或初开花蕾。作为我国常用的一种中药材,已有数千年的使用历史,其始载于《名医别录》被列为上品,现已被收录于《中华人民共和国药典》,具有清热解毒、疏风散热等功效。
本申请经多次药理试验研究表明,其75%乙醇提取物具有显著的ACL抑制活性,对ACL呈现显著抑制作用,IC50值为2.65±0.83μg/mL,结果显示,该药材提取物可能对高血脂、动脉粥样硬化、脂肪肝、II型糖尿病、癌症及其它ACL所介导的疾病具有治疗作用,从而在制药领域有巨大的潜在用途。
本申请的金银花提取物可经本领域技术人员熟知的方法制备获得。例如,以金银花为原料,可采用溶剂提取法以制成浓缩的金银花提取物或将金银花提取物再经层析法制成不同馏分。
所述的溶剂提取法中,有机溶剂选自水、甲醇或乙醇或多种混合溶剂,在室温下浸渍提取或加热条件下回流提取5~10次获得金银花提取物。
可选的,所述溶剂为60~90%乙醇[即乙醇与水体积比(v/v)为60~90/40~10的溶液],所得提取物记为60~90%乙醇提取物;优选的,所述溶剂为75%乙醇[即乙醇与水体积比(v/v)为75/25的溶液];所得提取物即为75%乙醇提取物。
所述的层析法中,填料选择反相填料,优选为D-101型大孔树脂,洗脱体系优选甲醇-水或乙醇-水。
进一步优选的,选择乙醇-水为洗脱体系进行梯度洗脱;乙醇-水(0:100→20:80→40:60→60:40→80:20→100:0,v/v)梯度洗脱;然后根据TLC点板合并得到4个亚组分(JYH-EtOH-F1–JYH-EtOH-F4)。
本申请将获得的金银花提取物进行ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase,ACL)抑制活性实验,表明金银花提取物具有明显的ACL抑制活性,可用于制备由ACL所介导疾病的药物
因此本申请提供一种金银花提取物在制备ATP柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途。
本申请还提供一种金银花提取物在制备由ATP柠檬酸裂解酶介导疾病药物中的用途。
本申请还提供一种金银花提取物在制备治疗高脂血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、2型糖尿病、癌症或肥胖症的药物中的用途。
本申请还提供一种ATP柠檬酸裂解酶抑制剂,以金银花提取物为活性成分,与药学上可接受的载体或赋形剂结合,按照常规方法制成口服或者非口服剂型。
本申请所述的提取物或馏分可单独应用或者合用,亦可与药学上可接受的载体或赋形剂结合,按照常规方法制成口服或者非口服剂型。
可选的,还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
可选的,所述金银花提取物与赋形剂制成片剂、丸剂、胶囊剂或颗粒。
本申请还提供一种治疗高脂血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、2型糖尿病、癌症或肥胖症的药物,所述药物以金银花提取物为有效成分,与药学上可接受的载体或赋形剂结合,按照常规方法制成口服或者非口服剂型。
可选的,所述金银花提取物为金银花的乙醇提取物或所述乙醇提取物经柱层析后的馏分。
可选的,所述溶剂提取物为甲醇和/或乙醇和/或水和/或其任意比例的混合溶剂提取物,进一步为乙醇提取物。
进一步地,所述乙醇提取物为60~90%乙醇提取物;更进一步为75%乙醇提取物(JYH-EtOH)。
可选的,所述乙醇提取物经大孔树脂柱层析,以乙醇-水梯度洗脱后的馏分;乙醇-水(0:100→20:80→40:60→60:40→80:20→100:0,v/v)梯度洗脱;然后根据TLC点板合并得到4个亚组分(JYH-EtOH-F1–JYH-EtOH-F4)。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本申请的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本申请。
实施例1:金银花提取物的制备
干燥的金银花(6.0kg)充分粉碎后,经75%乙醇(8L)室温提取5次,每次24小时,合并提取液,减压浓缩得到总浸膏738g,即得到金银花75%乙醇提取物(JYH-EtOH)。
总浸膏用1.0L水分散后,经大孔树脂柱层析,以乙醇-水(0:100→20:80→40:60→60:40→80:20→100:0,v/v)梯度洗脱,根据TLC点板合并得到4个亚组分(JYH-EtOH-F1–JYH-EtOH-F4)。
实施例2:ACL抑制活性测试
实验方法:本实验中ATP依赖的柠檬酸裂解酶ACL能将柠檬酸催化转变为乙酰辅酶A,进而产生脂肪酸合成的前体分子-丙二酸单酰辅酶A。该反应伴随ATP的消耗,因此可以使用ADP-Glo激酶检测试剂盒检测ATP的变化,来间接反应提取物对ACL的酶活性抑制作用。
具体来说,初筛选择实施例1制备得到的金银花75%乙醇提取物(JYH-EtOH)和4个馏分(JYH-EtOH-F1–JYH-EtOH-F4)浓度均为20μg/mL时对ACL酶活性的百分抑制率进行考察,试验结果表明金银花75%乙醇提取物(JYH-EtOH)和4个馏分(JYH-EtOH-F1–JYH-EtOH-F4)对ACL具有显著的抑制作用,抑制率分别为52.5%、90.4%,98.1%、91.6%和93.6%。
进一步测定IC50值:样品(实施例1制备的75%乙醇提取物(JYH-EtOH)和4个馏分(JYH-EtOH-F1–JYH-EtOH-F4))临用前溶于DMSO配成合适浓度,3倍稀释,7个稀释度,三复孔,取2μL样品溶液加入到标准的测活体系(40mMTris,pH 8.0,10mM MgCl2,5mM DTT,ATP,CoA,,柠檬酸钠和ACL),37℃下孵育30min。而后,体系内加入25μL ADP-Glo试剂,室温下孵育30min,以终止反应,并消耗完剩余的ATP。再加入激酶检测试剂孵育30min后,其荧光信号由EnVision读出,其动力学曲线一级反应的斜率作为酶的活性指标。以相对活性对75%乙醇提取物(JYH-EtOH)和4个馏分(JYH-EtOH-F1–JYH-EtOH-F4)的浓度作图,经公式v/v0=100/(1+b*[I]/IC50)拟合得到IC50值,实验重复三次,结果取三次的平均值,阳性对照BMS303141的IC50值为0.46μM。
表1.金银花75%乙醇提取物及其馏分的ACL抑制活性数据
金银花75%乙醇提取物及其馏分抑制ACL的IC50值见表1,测试结果表明上述75%乙醇提取物(JYH-EtOH)以及4个馏分(JYH-EtOH-F1–JYH-EtOH-F4)对ACL表现出显著的抑制活性,表明本申请的溶剂提取物可用于制备治疗糖脂代谢紊乱相关疾病的药物。
综上,本申请经体外活性实验发现金银花75%乙醇提取物对ACL呈现显著的抑制作用,可在制备预防、延缓或治疗由ACL所介导的疾病药物中应用。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本申请的保护范围。因此,本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.金银花提取物在制备ATP柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途。
2.金银花提取物在制备由ATP柠檬酸裂解酶介导疾病的药物中的用途。
3.金银花提取物在制备治疗高脂血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、2型糖尿病、癌症或肥胖症的药物中的用途。
4.根据权利要求1~3任一项权利要求所述的用途,其特征在于,所述金银花提取物为金银花的乙醇提取物或所述乙醇提取物经柱层析后所得的馏分。
5.根据权利要求4所述的用途,其特征在于,所述乙醇提取物为75%乙醇提取物。
6.根据权利要求4所述的用途,其特征在于,所述乙醇提取物经大孔树脂柱层析,用乙醇-水梯度洗脱所得的馏分即为所述馏分。
7.一种ATP柠檬酸裂解酶抑制剂,其特征在于,以金银花提取物为活性成分。
8.根据权利要求7所述的ATP柠檬酸裂解酶抑制剂,其特征在于,还包括药学上可接受的载体和/或赋形剂。
9.根据权利要求8所述的所述ATP柠檬酸裂解酶抑制剂,其特征在于,所述金银花提取物与赋形剂制成片剂、丸剂、胶囊剂或颗粒。
10.一种治疗高脂血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝、2型糖尿病、癌症或肥胖症的药物,其特征在于,所述药物以金银花提取物为有效成分。
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宋亚玲等: "金银花化学成分研究进展", 《中草药》 * |
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