CN113599367B - 具有核壳结构的蛋白微粒及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种具有核壳结构的蛋白微粒及其制备方法和用途,所述蛋白微粒具有以谷物醇溶蛋白为核、美拉德反应复合物为壳的核壳结构,且非共价交联剂存在于核与壳之间并与谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物分别结合。其制备方法包括将非共价交联剂溶液与含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系混合,从而形成稳定的蛋白微粒。本发明制备得到的蛋白微粒在盐及不同pH值溶液中都具有良好的稳定性,因此可以将其用于药物载体可以增加药物的吸收利用率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种具有核壳结构蛋白微粒及其制备方法和用途。
背景技术
玉米、小麦等谷物醇溶蛋白是一种不溶于水的植物微粒,一般占胚乳中蛋白质的50%以上。根据结构与溶解性,可被分为α-,β-,γ-和δ-醇溶蛋白。因其独特的自组装特性,良好的生物相容性以及可降解性,醇溶蛋白可作为可食用微粒,并可作药物输送载体。
但谷物醇溶蛋白微粒分散到水中时,若分散液中含有盐离子,或者pH在4-7之间,非常容易沉淀,限制了其使用。现有技术路线制成的微粒虽然可以在较宽的pH范围内保持稳定,但极易受盐溶液影响,即使在低浓度的盐溶液中也会聚沉,不利于实际应用。
CN106692978B公开了一种玉米醇溶蛋白/蛋白质-多糖静电复合物核/壳型纳米载体及其制备方法,所述的纳米载体粒径分布范围窄,酸碱稳定性和耐热性好。但是,由于玉米醇溶蛋白和蛋白质-多糖静电复合物之间仅通过静电吸附作用相结合,二者之间结合的作用力为静电力,极易被各种离子屏蔽或破坏。因此,该制备方法仍没有解决其在不同浓度的盐溶液下不稳定的问题。
因此增强谷物醇溶蛋白微粒在分散体系中的稳定性是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题,提供一种具有“核壳”结构蛋白微粒及其制备方法和用途。
本发明第一方面提供了一种蛋白微粒,该微粒具有以谷物醇溶蛋白为核、美拉德反应复合物为壳的核壳结构,且非共价交联剂存在于核与壳之间并与谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物分别结合。
本发明第二方面提供了蛋白微粒的制备方法,该方法包括:将非共价交联剂溶液与含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系混合。
本发明第三方面提供了一种由上述方法制得的蛋白微粒。
本发明第四方面提供了一种所述蛋白微粒在药物载体或营养素载体中的用途。
通过本发明的制备方法制备的蛋白微粒在pH4-8.5的具有不同盐浓度(0.2-3mol/L)的盐溶液中均具有良好的稳定性,不发生沉淀或絮凝。因此,本发明所述的蛋白微粒在作为药物载体或营养素载体方面具有重要应用潜力。具体地:
1、本发明利用美拉德反应复合物通过静电作用和/或疏水作用吸附于谷物醇溶蛋白表面,形成了以谷物醇溶蛋白为核心,以美拉德反应复合物为外壳的“核-壳”结构;非共价交联剂如单宁酸等含有大量羟基,能够与蛋白质上的羰基反应,该反应会产生稳定的氢键,从而促进谷物醇溶蛋白与美拉德反应复合物上蛋白质基团间的交联反应。所形成的“核-壳”分子因在表面引入大量亲水多糖基团,因而能够在高浓度盐溶液中保持稳定从而增强蛋白微粒的稳定性,使其更具实用性。
2、本发明所述方法包含将非共价交联剂溶液与含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系混合,操作简单,实用性强,效果显著。其中,在优选的情况下,本发明通过将加入非共价交联剂溶液加至含有谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系中,以此加入顺序制备得到的蛋白微粒在不同盐浓度及pH值溶液中都具有更好的稳定性。
3、本发明方法制备得到的蛋白微粒的稳定性较好,可以作为药物载体或营养素载体应用可以增加药物或营养素的吸收利用率。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
一方面,本发明提供了一种蛋白微粒,该蛋白微粒具有以谷物醇溶蛋白为核、美拉德反应复合物为壳的核壳结构,且非共价交联剂存在于核与壳之间并与谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物分别结合。
本发明对谷物醇溶蛋白的种类没有特别限定,可为本领域常见的谷物醇溶蛋白。优选的情况下,所述醇溶蛋白包括α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白和δ-醇溶蛋白的一种或多种。
更优选的,所述谷物醇溶蛋白选自玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、大麦醇溶蛋白。进一步优选的情况下,所述醇溶蛋白为玉米醇溶蛋白。
在本发明中,所述非共价交联剂包括但不限于多酚。优选的情况下,所述非共价交联及包括但不限于单宁酸、植酸、阿魏酸、咖啡酸和儿茶素中的至少一种。
在本发明中,所述美拉德反应复合物为还原性多糖和水溶性蛋白质经美拉德反应获得。优选的,所述还原性多糖选自β-葡聚糖和麦芽糊精中的至少一种,所述水溶性蛋白质选自大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、花生蛋白、谷物清蛋白、谷物球蛋白、谷物谷蛋白及其盐中的至少一种。优选的情况下,所述谷物清蛋白为玉米清蛋白、小麦清蛋白和高粱清蛋白中的至少一种,所述谷物球蛋白为玉米球蛋白、小麦球蛋白和高粱球蛋白中的至少一种,所述谷物谷蛋白为玉米谷蛋白、小麦谷蛋白和高粱谷蛋白中的至少一种。
优选的情况下,所述谷物醇溶蛋白与美拉德反应复合物的质量比为1:3.5-1:0.3,优选为1:2-1:1。在另一种优选的情况下,所述谷物醇溶蛋白与美拉德反应复合物的质量比可以为1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.2中任意一个比值或任意两个比值之间。
优选的情况下,所述谷物醇溶蛋白与非共价交联剂的质量比为40:1-2:1,优选为20:1-5:1。优选的情况下,所述谷物醇溶蛋白与非共价交联剂的质量比可以为40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1中任意一个比值或在任意两个比值之间。
在本发明中,术语“美拉德反应复合物”意为还原性多糖和水溶性蛋白质经过美拉德反应生成的产物。
根据本发明的优选实施方式,所述蛋白微粒为玉米醇溶蛋白-单宁酸-美拉德反应复合物微粒。
另一方面,本发明还提供了一种用于制备上述蛋白微粒的方法,其特征在于,该方法包括:将非共价交联剂溶液与含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系混合。在本发明优选的实施方式中,所述混合方式为将非共价交联剂溶液加至谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物分散液中。对加入速度没有特别的要求,但为了进一步改善蛋白微粒的稳定性,相对于每100ml的含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系,所述非共价交联剂溶液的加入速度为0.1-50ml/min,优选为1-10ml/min。
优选的情况下,所述非共价交联剂溶液中非共价交联剂的质量浓度为0.05-6%,更优选为1-6%。优选的情况下,所述非共价交联剂溶液中非共价交联剂的质量浓度为0.05%、0.06%、0.0.7%、0.0.8%、0.09%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%中的任意一个质量浓度或在任意两个质量浓度之间。所述非共价交联剂溶液中的溶剂通常为水,优选为超纯水。
优选的,所述非共价交联剂溶液与含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系的用量使得谷物醇溶蛋白与非共价交联剂的质量比为80:1-1:1,优选为7:1-4:1。优选的情况下,所述谷物醇溶蛋白与非共价交联剂的质量比为80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1中的任意一个比值或在任意两个比值之间。
根据本发明,为了更好的增强蛋白微粒的稳定性,所述含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系可以通过以下步骤而制得:将谷物醇溶蛋白分散系与pH值为2-8的美拉德反应复合物分散液混合,持续搅拌。优选的条件下,所述美拉德反应复合物分散液的pH值为4.8-6。优选的情况下,所述拉德反应复合物分散液的pH值为2、2.4、2.8、3、3.4、3.8、4、4.4、4.8、5、5.4、5.8、6、6.4、6.8、7、7.4、7.8、8中的任意一个值或在任意两个值之间。在本发明优选的实施方式中,所述混合方法为将美拉德反应复合物分散液加至谷物醇溶蛋白分散系中。对加入速度没有特别的要求,但为了进一步改善蛋白微粒的稳定性,相对于每100ml的含谷物醇溶蛋白的分散系,所述美拉德反应复合物分散液的加入速度为0.1-80ml/min,优选为3-30ml/min。优选的,所述含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系中谷物醇溶蛋白与美拉德反应复合物的质量比为1:0.3-7,更优选的情况下,所述谷物醇溶蛋白与美拉德反应复合物的质量比为1:0.3-6。优选的情况下,所述谷物醇溶蛋白与美拉德反应复合物的质量比为1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7中的任意一个比值或者在任意两个比值之间。
根据本发明,为了更好地增强蛋白微粒的稳定性,所述谷物醇溶蛋白分散系可以通过以下步骤制得:将pH值为7-12的谷物醇溶蛋白溶液分散于水中。优选的情况下,所述谷物醇溶蛋白溶液的pH值为8-12。所述分散方式可为本领域常规方法,例如反溶剂沉淀法、蒸发法等。在本发明优选的实施方式中,所述分散方法为将谷物醇溶蛋白溶液加至水中。对加入速度没有特别的要求,但为了进一步改善蛋白微粒的稳定性,相对于每100ml的水,谷物醇溶蛋白溶液的加入速度为0.2-20ml/min,优选为2-10ml/min。更优选的,所述谷物醇溶蛋白溶液与水的体积比为1:0.1-80,优选为1:1-10。
在本发明中,所述谷物醇溶蛋白溶液可以通过本领域常规的方法制备。优选的,所述谷物醇溶蛋白溶液可以通过将谷物醇溶蛋白溶于乙醇水溶液、丙酮水溶液、异丙醇水溶液、pH大于11.5的水溶液中制备。其中,所述pH大于11.5的水溶液由碱金属氢氧化物(如氢氧化钠)调节pH制成。在优选的情况下,通过将谷物醇溶蛋白溶于50-90%(v/v)的乙醇水溶液制备谷物醇溶蛋白溶液。
优选的,所述谷物醇溶蛋白溶液的质量浓度为0.005-15%,优选为1-10%。优选的情况下,所述谷物醇溶蛋白的质量浓度为0.005%、0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%中任意一个质量浓度或在任意两个质量浓度之间。
在本发明中,所述美拉德反应复合物分散液可以通过本领域常规的制备方法制得。优选的,所述美拉德反应复合物分散液通过以下步骤制得:将美拉德反应复合物溶于水中,于温水中搅拌、溶解,待溶液温度降至室温后调节其pH值为2-8,优选为4.8-6。优选的情况下,所述拉德反应复合物分散液的pH值为2、2.4、2.8、3、3.4、3.8、4、4.4、4.8、5、5.4、5.8、6、6.4、6.8、7、7.4、7.8、8中的任意一个值或在任意两个值之间。优选的,所述美拉德反应复合物分散液中美拉德反应复合物的质量浓度为0.05-6%。优选的情况下,所述美拉德反应复合物分散液中美拉德反应复合物的质量浓度为0.05%、0.07%、0.09%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%中任意一个质量浓度或在任意两个质量浓度之间。
优选的情况下,所述美拉德反应复合物通过还原性多糖和水溶性蛋白质发生美拉德反应获得。进一步优选的,制备所述美拉德反应复合物的步骤包括:在溶剂存在下,将还原性多糖和水溶性蛋白质接触进行美拉德反应。
进一步优选的,所述接触的条件包括:pH 6-11.5,温度为45-95℃,时间为2-50h。优选的条件下,所述pH为8.5-9.5,所述反应时间为4-8h。优选的条件下,所述反应时间为2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、15h、20h、25h、30h、35h、40h、45h、50h中任意一个反应时间或在任意两个反应时间之间。
优选的情况下,制备所述美拉德反应复合物的步骤还包括:将美拉德反应后的反应液通过50kDa的膜过滤,去掉滤过液,将截留液进行干燥,得到美拉德反应复合物。
本发明中,所述将截留液进行干燥可以为本领域常用的方法,例如喷雾冻干。
所述美拉德反应复合物分散液中的溶剂通常为水,优选为超纯水。
进一步优选的,所述接触的体系中还原性多糖的质量浓度为0.1-10%,优选为0.2-2%。在另一种优选的情况下,所述还原性多糖的质量浓度为0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%中任意一个质量浓度或在任意两个质量浓度之间。
更优选的,所述接触的体系中水溶性蛋白质的质量浓度为0.005-6%,优选为0.01-2%。在另一种优选的情况下,所述水溶性蛋白质的质量浓度为0.01%、0.03%、0.05%、0.07%、0.09%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1%、2%、3%、4%、5%、6%中任意一个质量浓度或在任意两个质量浓度之间。
进一步优选的,所述还原性多糖与水溶性蛋白质的用量质量比为90:10-60:40。在另一种优选的情况下,所述还原性多糖与水溶性蛋白质的用量质量比为95:5、90:5、85:5、80:5、75:5、70:5、65:5、60:5、55:5、50:5、45:5、40:5、35:5、30:5、25:5、20:5、15:5、10:5、7.5:5中的任意一个比值或者在任意两个比值之间。
优选的,所述还原性多糖选自β-葡聚糖和麦芽糊精中的至少一种,所述水溶性蛋白质选自大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白、花生蛋白、谷物清蛋白、谷物球蛋白、谷物谷蛋白及其盐中的至少一种。优选的情况下,所述谷物清蛋白为玉米清蛋白、小麦清蛋白和高粱清蛋白中的至少一种,所述谷物球蛋白为玉米球蛋白、小麦球蛋白和高粱球蛋白中的至少一种,所述谷物谷蛋白为玉米谷蛋白、小麦谷蛋白和高粱谷蛋白中的至少一种。
在本发明中,所述非共价交联剂和谷物醇溶蛋白的种类在第一方面已经进行了详细的阐述,在此不再赘述。
本发明还提供了由上述方法制得的蛋白微粒。
上述蛋白微粒在不同pH、不同盐浓度的溶液中均具有良好的稳定性,不易沉淀或聚沉。因此,另一方面,本发明提供了一种所述蛋白微粒作为药物或营养素载体的用途。所述营养素可以为姜黄素、β-胡萝卜素、多肽、脂溶性和水溶性维生素、铁、锌,所述蛋白微粒以非共价结合方式搭载营养素,从而能够增加营养素的吸收利用率。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂等,如无特殊说明,均可以从商业途径得到。室温指“25℃”。
下述实施例中,如无特殊说明,玉米醇溶蛋白、单宁酸、β-葡聚糖、酪蛋白酸钠购自美国sigma试剂公司;乙醇购自天津永大试剂公司,NaOH、HCl购自天津永大试剂公司,
下述实施例中,如无特殊说明,搅拌器为WH220-HT数字式加热磁力搅拌器,购自德国wiggens公司。
喷雾冻干的条件:样品于LGJ-12型冻干机(北京松源华兴生物技术有限公司)中干燥至恒重。
实施例1
(1)将5g玉米醇溶蛋白溶于100ml的80%(v/v)的乙醇水溶液中,于室温600rpm搅拌1h,得到玉米醇溶蛋白溶液,再使用0.1mol/L NaOH和HCl溶液将玉米醇溶蛋白溶液的pH值调为9;
(2)将0.90gβ-葡聚糖和0.10g酪蛋白酸钠置于100ml的水中搅拌、溶解得到含还原性多糖和水溶性蛋白质的溶液,调节其pH值至9.5,于80℃条件下保持4h,使其发生美拉德反应,将反应液通过50kDa的膜中过滤,收集截留液后,进行喷雾冻干处理得到美拉德反应复合物;
(3)取2g按照步骤(2)制得的美拉德反应复合物于50℃240ml的超纯水中600rpm连续搅拌1h,得到美拉德反应复合物的分散液,随后,降至室温并使用0.1mol/L NaOH和HCl溶液调节其pH值至5.5;
(4)将步骤(1)中的玉米醇溶蛋白溶液的20ml以相对于每100ml的超纯水5ml/min的加入速度加至5倍超纯水中制备玉米醇溶蛋白分散液,600rpm持续搅拌1h;
(5)以玉米醇溶蛋白与美拉德反应复合物为1:2的质量比将步骤(3)中的美拉德反应复合物分散液以相对于每100ml的玉米醇溶蛋白分散系10ml/min的加入速度加至步骤(4)中的玉米醇溶蛋白分散液,600rpm持续搅拌30min,得到玉米醇溶蛋白-美拉德反应复合物分散液;
(6)将5ml浓度为0.04g/mL的单宁酸以相对于每100ml的含玉米醇溶蛋白和美拉德反应产物的分散液10ml/min的加入速度加至步骤(5)中的含玉米醇溶蛋白和美拉德反应产物的分散液中,600rpm持续搅拌1h,从而形成稳定的玉米醇溶蛋白-单宁酸-美拉德反应复合物微粒分散液,将分散液喷雾冻干后,即得到玉米醇溶蛋白-单宁酸-美拉德反应复合物微粒A1。
实施例2
按照实施例1的方法制备蛋白微粒,不同的是,将步骤(1)中玉米醇溶蛋白溶液的pH值调至7,将步骤(2)中溶液的pH值调至8.5,于95℃条件下保持6h,步骤(3)中取3g按照步骤(2)制得的美拉德反应复合物,将步骤(3)中美拉德反应复合物分散液的pH值调至5.0,且更改步骤(5)中玉米醇溶蛋白和美拉德反应复合物的质量比为1:3,更改步骤(6)中单宁酸溶液的加入量为4ml,最终得到玉米醇溶蛋白-单宁酸-美拉德反应复合物微粒A2。
实施例3
按照实施例1的方法制备蛋白微粒,不同的是,将步骤(1)中玉米醇溶蛋白溶液的pH值调至8.5,将步骤(2)中溶液的pH值调至8.5,于45℃条件下保持6h,步骤(3)中取1g按照步骤(2)制得的美拉德反应复合物,将步骤(3)中美拉德反应复合物分散液的pH值调至5.2,且更改步骤(5)中玉米醇溶蛋白和美拉德反应复合物的质量比为1:1,最终得到玉米醇溶蛋白-单宁酸-美拉德反应复合物微粒A3。
对比例1
(1)将5g玉米醇溶蛋白溶于100ml的80%(v/v)的乙醇水溶液中,于室温600rpm搅拌1h,得到玉米醇溶蛋白溶液,再使用0.1mol/L NaOH和HCl溶液将玉米醇溶蛋白溶液的pH值调为9;
(2)将0.90gβ-葡聚糖和0.10g酪蛋白酸钠置于100ml的水中搅拌、溶解得到含还原性多糖和水溶性蛋白质的溶液,使用0.1mol/L NaOH和HCl溶液调节其pH值至5.5,得到β-葡聚糖和酪蛋白酸钠分散液;
(3)将步骤(1)中的玉米醇溶蛋白溶液的20ml以相对于每100ml的超纯水5ml/min的加入速度加至5倍超纯水中制备玉米醇溶蛋白分散液,600rpm持续搅拌1h;
(4)取步骤(2)中得到的β-葡聚糖和酪蛋白酸钠分散液,以玉米醇溶蛋白、β-葡聚糖、酪蛋白酸钠为1:1.8:0.2的质量比将β-葡聚糖和酪蛋白酸钠的混合溶液以相对于每100ml的玉米醇溶蛋白分散系10ml/min的加入速度加至步骤(3)中的玉米醇溶蛋白分散液,600rpm持续搅拌30min,得到玉米醇溶蛋白及β-葡聚糖和酪蛋白酸钠分散液;
(5)将5ml浓度为0.04g/mL的单宁酸以相对于每100ml的含玉米醇溶蛋白及β-葡聚糖和酪蛋白酸钠分散液10ml/min的加入速度加至步骤(4)中的含玉米醇溶蛋白及β-葡聚糖和酪蛋白酸钠的分散液中,600rpm持续搅拌1h,从而形成稳定的玉米醇溶蛋白-单宁酸-β-葡聚糖-酪蛋白酸钠分散液,将分散液喷雾冻干后,即得到玉米醇溶蛋白-单宁酸-β-葡聚糖-酪蛋白酸钠复合物微粒B1。
对比例2
(1)将5g玉米醇溶蛋白溶于100ml的80%(v/v)的乙醇水溶液中,于室温600rpm搅拌1h,得到玉米醇溶蛋白溶液,再使用0.1mol/L NaOH和HCl溶液将玉米醇溶蛋白溶液的pH值调为9;
(2)将0.90gβ-葡聚糖和0.10g酪蛋白酸钠置于100ml的水中搅拌、溶解得到含还原性多糖和水溶性蛋白质的溶液,调节其pH值至9.5,于80℃条件下保持4h,使其发生美拉德反应,将反应液通过50kDa的膜中过滤,收集截留液后进行喷雾冻干处理得到美拉德反应复合物;
(3)将2g步骤(2)得到的美拉德反应复合物于50℃240ml的超纯水中600rpm连续搅拌1h,得到美拉德反应复合物的分散液,随后,降至室温并使用0.1mol/L NaOH和HCl溶液调节其pH值至5.5;
(4)将步骤(1)中的玉米醇溶蛋白溶液的20ml以相对于每100ml的超纯水5ml/min的加入速度加至5倍超纯水中制备玉米醇溶蛋白分散液,600rpm持续搅拌1h;
(5)以玉米醇溶蛋白与美拉德反应复合物为1:2的质量比将步骤(3)中的美拉德反应复合物分散液以相对于每100ml的玉米醇溶蛋白分散系10ml/min的加入速度加至步骤(4)中的玉米醇溶蛋白分散液,600rpm持续搅拌30min,得到玉米醇溶蛋白-美拉德反应复合物分散液,将分散液喷雾冻干后,即得到玉米醇溶蛋白-美拉德反应复合物微粒B2。
对比例3
(1)将5g玉米醇溶蛋白溶于100ml的80%(v/v)的乙醇水溶液中,于室温600rpm搅拌1h,得到玉米醇溶蛋白溶液,再使用0.1mol/L NaOH和HCl溶液将玉米醇溶蛋白溶液的pH值调为9;
(2)将0.85gβ-葡聚糖和0.15g玉米谷蛋白置于100ml的水中搅拌、溶解得到含还原性多糖和水溶性蛋白质的溶液,调节其pH值至9.5,于80℃条件下保持4h,使其发生美拉德反应,将反应液通过50kDa的膜中过滤,收集截留液后进行喷雾冻干处理得到美拉德反应复合物;
(3)将2g步骤(2)得到的美拉德反应复合物于50℃240ml的超纯水中600rpm连续搅拌1h,得到美拉德反应复合物的分散液,随后,降至室温并使用0.1mol/L NaOH和HCl溶液调节其pH值至5.5;
(4)将步骤(1)中的玉米醇溶蛋白溶液的20ml以相对于每100ml的超纯水5ml/min的加入速度加至5倍超纯水中制备玉米醇溶蛋白分散液,600rpm持续搅拌1h;
(5)以玉米醇溶蛋白与美拉德反应复合物为1:2的质量比将步骤(3)中的美拉德反应复合物分散液以相对于每100ml的玉米醇溶蛋白分散系10ml/min的加入速度加至步骤(4)中的玉米醇溶蛋白分散液,600rpm持续搅拌30min,得到玉米醇溶蛋白-美拉德反应复合物分散液,将分散液喷雾冻干后,即得到玉米醇溶蛋白-美拉德反应复合物微粒B3。
测试例1
针对上述实施例以及对比例制备得到的各颗粒进行颗粒稳定性检测。所用方法为粒径法,具体地:将冻干后的各实施例或对比例所述颗粒分散到100mL超纯水中得到样品分散液,使样品分散液的计数率介于300~700counting rate/s,4℃条件下磁力搅拌12h,室温下放置2h后进行测试。取100μL样品分散于10mL超纯水中,向其中添加不同质量的氯化钠,使其浓度分别为0、0.25、0.5、1、2、3mol/L,并将pH值分别调至4、7和8.5。进行动态光散射测试,获得颗粒的布朗运动的自相关函数,通过拟合,仪器可自动计算其z-平均直径。使用的仪器为Nano Zetasizer(英国Malvern公司),检测所用的条件为:检测温度25℃,溶剂的折光指数为1.333,粘度为1.002mPa·s。
各实施例和对比例在不同pH和NaCl浓度条件下的颗粒直径(nm)见表1。实施例1-3制备得到的醇溶蛋白微粒A1-A3的直径虽然随pH和NaCl浓度发生变化,但是均在300nm范围内,该尺寸的颗粒可以在分散体系中做热运动,不会沉淀;而经过其他处理方式获得的颗粒虽然在pH8.5,NaCl浓度为0的情况下直径低于300nm,但在其他条件下时由于发生聚集无法测试。
表1
(1)“-”为样品沉淀。
(2)颗粒直径的单位为nm。
通过上述结果可以看出,本发明的制备方法得到的具有核壳结构的蛋白微粒在不同的pH值和不同的NaCl浓度下都有更好的稳定性,说明其在不同pH条件下均能够抵抗盐离子而不发生聚集或沉淀。本发明制得的蛋白微粒用于药物载体时可以增加药物的吸收利用率。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合,这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容,均属于本发明的保护范围。
Claims (20)
1.一种蛋白微粒,其特征在于,该蛋白微粒具有以谷物醇溶蛋白为核、美拉德反应复合物为壳的核壳结构,且非共价交联剂存在于核与壳之间并与谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物分别结合;
其中,所述谷物醇溶蛋白为玉米醇溶蛋白;所述非共价交联剂为单宁酸;所述美拉德反应复合物为还原性多糖和水溶性蛋白质经美拉德反应获得,所述还原性多糖为β-葡聚糖,所述水溶性蛋白质为酪蛋白酸钠;所述谷物醇溶蛋白与美拉德反应复合物的质量比为1:3.5-1:0.3;所述谷物醇溶蛋白与非共价交联剂的质量比为40:1-2:1。
2.根据权利要求1所述的蛋白微粒,其中,所述谷物醇溶蛋白与美拉德反应复合物的质量比为1:2-1:1;
和/或,所述谷物醇溶蛋白与非共价交联剂的质量比为20:1-5:1。
3.一种制备蛋白微粒的方法,其特征在于,该方法包括将非共价交联剂溶液与含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系混合;
其中,所述谷物醇溶蛋白为玉米醇溶蛋白;所述非共价交联剂为单宁酸;所述美拉德反应复合物为还原性多糖和水溶性蛋白质经美拉德反应获得,所述还原性多糖为β-葡聚糖,所述水溶性蛋白质为酪蛋白酸钠;所述含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系中谷物醇溶蛋白与美拉德反应复合物的质量比为1:0.3-7;所述非共价交联剂溶液与含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系的用量使得谷物醇溶蛋白与非共价交联剂的质量比为80:1-1:1;
所述含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系通过以下步骤而制得:将谷物醇溶蛋白分散系与pH值为2-8的美拉德反应复合物分散液混合,持续搅拌;
所述谷物醇溶蛋白分散系通过以下步骤制得:将pH值为7-12的谷物醇溶蛋白溶液分散于水中;
所述美拉德反应复合物分散液通过以下步骤而制得:将美拉德反应复合物溶于水中,于温水中搅拌、溶解,待溶液温度降至室温后调节其pH值为2-8;
制备所述美拉德反应复合物的步骤包括:在溶剂存在下,将还原性多糖和水溶性蛋白质接触进行美拉德反应;将美拉德反应后的反应液通过50 kDa的膜过滤,去掉滤过液,将截留液进行干燥,得到美拉德反应复合物。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述混合的方式为将非共价交联剂溶液加至含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系中。
5.根据权利要求4所述的方法,其中,所述混合的方式为将非共价交联剂溶液加至含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系中,相对于每100ml的含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系,所述非共价交联剂溶液的加入速度为0.1-50 ml/min。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述非共价交联剂溶液的加入速度为1-10ml/min。
7.根据权利要求3所述的方法,其中,所述非共价交联剂溶液中非共价交联剂的质量浓度为0.05-6%。
8.根据权利要求3所述的方法,其中,所述非共价交联剂溶液中非共价交联剂的质量浓度为1-6%;
和/或,所述非共价交联剂溶液与含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系的用量使得谷物醇溶蛋白与非共价交联剂的质量比为7:1-4:1。
9.根据权利要求3所述的方法,其中,所述混合的方法为将美拉德反应复合物分散液加至谷物醇溶蛋白分散系中,相对于每100ml的含谷物醇溶蛋白的分散系,所述美拉德反应复合物分散液的加入速度为0.1-80 ml/min;
和/或,所述含谷物醇溶蛋白和美拉德反应复合物的分散系中谷物醇溶蛋白与美拉德反应复合物的质量比为1:0.3-6。
10.根据权利要求9所述的方法,其中,相对于每100ml的含谷物醇溶蛋白的分散系,所述美拉德反应复合物分散液的加入速度为3-30 ml/min。
11.根据权利要求3所述的方法,其中,所述分散的方法为将谷物醇溶蛋白溶液加至水中,相对于每100ml的水,谷物醇溶蛋白溶液的加入速度为0.2-20 ml/min。
12.根据权利要求3或11所述的方法,其中,相对于每100ml的水,谷物醇溶蛋白溶液的加入速度为2-10 ml/min;
和/或,所述谷物醇溶蛋白溶液与水的体积比为1:0.1-80;
和/或,所述谷物醇溶蛋白溶液中谷物醇溶蛋白的质量浓度为0.005-15%。
13.根据权利要求12所述的方法,其中,所述谷物醇溶蛋白溶液与水的体积比为1:1-10;
和/或,所述谷物醇溶蛋白溶液中谷物醇溶蛋白的质量浓度为1-10%。
14.根据权利要求3所述的方法,其中,所述美拉德反应复合物分散液中美拉德反应复合物的质量浓度为0.05-6%。
15.根据权利要求3所述的方法,其中,所述接触的条件包括:pH 6-11.5,温度为45-95℃,时间为2-50 h。
16.根据权利要求15所述的方法,其中,所述接触的条件包括:pH 6-11.5,温度为45-95℃,时间为4-8 h。
17.根据权利要求3、15或16所述的方法,其中,所述接触的体系中还原性多糖的质量浓度为0.1-10%;
和/或,所述接触的体系中水溶性蛋白质的质量浓度为0.005-6%;
和/或,所述还原性多糖与水溶性蛋白质的用量质量比为90:10-60:40。
18.根据权利要求17所述的方法,其中,所述接触的体系中还原性多糖的质量浓度为0.2-2%;
和/或,所述接触的体系中水溶性蛋白质的质量浓度为0.01-2%。
19.权利要求3-18中任意一项所述的方法制得的蛋白微粒。
20.权利要求1或19所述的蛋白微粒在制备药物载体或营养素载体中的用途。
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