CN113588957A - 微生物分离检测系统及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种微生物分离检测系统及检测方法。所述系统包括圆环形微流控芯片、旋转磁场装置、连接元件、步进电机、步进电机驱动器、固定装置、嵌入式装置和智能手机图像分析设备等。本发明提供的微生物分离检测系统集分离、标记、洗涤、催化、检测于一体，具有操作自动化、反应速度快、体积小等特点，在食源性致病菌、动物病毒等病原微生物快速检测方面具有广阔的应用前景。

Description

微生物分离检测系统及检测方法
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体地说，涉及一种微生物分离检测系统及检测方法。
背景技术
食源性致病菌一直被认为是食品安全最主要的危险因素。因此开展食源性致病菌现场筛查对预防食源性疾病暴发具有重要意义。
目前，常用的食源性致病菌分离方法主要是免疫纳米磁分离。但这种方式大多需要进行手动操作。免疫磁栅/网分离是一种利用特殊的磁场设计使磁性材料在通道中呈链状分布，从而增大细菌与磁性材料碰撞结合几率的分离方式。这种分离方式可以有效提高捕获效率并结合微流控芯片可以实现自动化操作。在国家标准中，检测食源性致病菌的方法有培养法、聚合酶链式反应和酶联免疫吸附测定这三种。但这三种方法均不能实现现场检测。生物传感器是近几十年发展迅速的食源性致病菌检测技术，具有操作简便、成本低廉、灵敏度高、特异性强、响应速度快、可现场检测等特点。因此，开发一种利用免疫磁网分离、生物传感器检测食源性致病菌的平台与方法对于现场检测意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物分离检测系统及检测方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种微生物分离检测系统，所述系统包括圆环形微流控芯片、旋转(高梯度)磁场装置、连接元件、步进电机、步进电机驱动器、固定装置、嵌入式装置和智能手机图像分析设备。
所述圆环形微流控芯片上设有n个纺锤状储液腔以及与各储液腔出口相连的弧形反应腔(所述弧形反应腔设置在芯片的外缘)，储液腔用于储存加载的液体，弧形反应腔用于目标微生物的分离与检测；其中，n为大于等于2的整数(优选n为6)；
所述旋转磁场装置与所述圆环形微流控芯片通过所述连接元件嵌合连接，圆环形微流控芯片中加载的磁性材料可在磁场带动下发生步移；所述连接元件包括中心轴、轴承和轴托；
所述旋转磁场装置包含的两个L型旋转轴可在所述步进电机的驱动下进行圆周运动；
所述步进电机驱动器控制所述步进电机运转(步进电机驱动器接收来自单片机的脉冲信号，控制步进电机按照设定的方向移动)；
所述固定装置为三层支架，上层可拆卸地固定有嵌合连接的圆环形微流控芯片和旋转磁场装置，中层可拆卸地固定有步进电机，下层可拆卸地固定有步进电机驱动器和嵌入式装置(单片机即为嵌入式装置)；所述嵌合连接的圆环形微流控芯片和旋转磁场装置作为一个整体，通过轴托与步进电机可拆卸地连接；
其中，所述圆环形微流控芯片的结构如下：
所述圆环形微流控芯片为中心具有圆孔的铜钱结构，圆孔的直径大于等于旋转磁场装置中圆柱形磁铁的直径，保证圆环形微流控芯片可以顺利穿过圆柱形磁铁；
所述圆环形微流控芯片由倒模而成的包含环形微通道的圆环形PDMS与圆环形玻璃片键合而成；通过设置合适的尺寸，使芯片套在圆柱形磁铁中间，由于芯片是包含一个1.5mm厚的PDMS与一个0.5mm厚的玻璃片，借助其自身厚度可以使芯片在放到圆柱形磁铁中心位置后保持平行/平衡；
所述弧形反应腔被环形微通道上设有的2n个出气口隔开，形成n个独立的开放式弧形腔体(用于形成独立液段)，每个腔体的内侧两端各有一个出气口(即储液腔数＝弧形腔体数＝1/2出气口数)；
所述圆环形微流控芯片上设有n个呈中心辐射状(均匀)排列的纺锤状储液腔，各储液腔之间的夹角为360°/n；
所述储液腔靠近芯片中心的一端设有进样孔，另一端为出口，且各储液腔的出口与弧形反应腔连通；
所述旋转磁场装置包括一个圆柱形磁铁、两个L型旋转轴、一根中心轴、两个轴承和一个固定环；
两个L型旋转轴通过穿过圆柱形磁铁的中心轴分别固定在圆柱形磁铁的两端，圆柱形磁铁的中心为空心，中心轴嵌套轴承刚好可以穿过该空心；
所述中心轴分为上半轴、中轴和下半轴；下半轴的长度大于上半轴；上半轴将一个L型旋转轴通过该旋转轴长端尾部上设有的开孔固定于圆柱形磁铁的一端，下半轴将另一个L型旋转轴通过该旋转轴长端尾部上设有的开孔固定于圆柱形磁铁的另一端；
两个L型旋转轴的尺寸相同；L型旋转轴的短端尾部为半圆形的收缩结构，用于聚集磁感线；
圆环形微流控芯片嵌套于圆柱形磁铁的中部，其中一个L型旋转轴位于芯片上方，另一个L型旋转轴位于芯片下方，且在两个L型旋转轴短端尾部之间形成一个气隙，该气隙的高度大于芯片的厚度；在该气隙处产生一个竖直的(高梯度)磁场，且该磁场对应作用于芯片上的弧形反应腔；
贯穿于圆柱形磁铁的中心轴的下半轴与步进电机轴通过轴托连接；
固定环用于固定圆柱形磁铁，使其在L型旋转轴发生转动时，圆柱形磁铁自身不转动，步进电机可通过中心轴和轴托带动L型旋转轴发生转动。
所述嵌入式装置用于控制反应时间和反应速度。
所述智能手机图像分析设备用于检测反应结果。优选地，利用安卓手机平台开发图像分析设备。
优选地，所述L型旋转轴的材质为铁，在每个L型旋转轴的短端尾部还带有两个条形小磁铁以增强磁场。
优选地，所述中心轴、轴托和固定环均为非磁性材料或导磁材料。
在本发明的一个具体实施方式中，所述微生物分离检测系统中：圆环形微流控芯片的内径为18mm，外径为64mm；芯片上设有6个尺寸形状相同的纺锤状储液腔；储液腔进样孔的直径为0.8mm；环形微通道上设置的出气口的直径为0.6mm；
空心圆柱形磁铁(优选N52)的尺寸为：外径18mm，内径8mm，高28mm；
L型旋转轴的尺寸为：长38.5mm，宽5mm，高17mm；L型旋转轴的长端尾部设有孔径为3mm的开孔，中心轴的上半轴和下半轴可以穿过该开孔，将L型旋转轴固定于圆柱形磁铁上；
条形小磁铁(优选N52)的尺寸为：12.7mm×6.4mm×3.2mm；
中心轴的材质为光敏树脂；中心轴总长为46mm；中轴半径为2.5mm，长28mm；上半轴半径为1.5mm，长3mm；下半轴半径为1.5mm，长15mm；
轴承的材质为铁；尺寸为：外径8mm，内径5mm，高2mm；
轴托的材质为光敏树脂，轴托包括上托轴和下托轴与连接上下托轴的中心实心部分，其中，上托轴用来嵌套中心轴的下半轴，下托轴用来嵌套步进电机的轴；上托轴的半径为3mm，长7mm，开孔半径1.5mm；下托轴的半径为4mm，长10mm，开孔半径2.5mm。
第二方面，本发明提供一种利用所述微生物分离检测系统分离检测微生物的方法，所述方法包括：
S1、将修饰的免疫纳米镍线溶液、含有目标微生物的待测样品溶液、HRP-纳米花溶液(免疫纳米花溶液)、清洗液1、清洗液2和TMB显色液(商品化TMB显色液)分别按圆环形微流控芯片的顺时针或逆时针方向从进样孔注入到各纺锤状储液腔中；然后通过离心力使储液腔中的液体进入到外围的弧形反应腔中，形成各自独立的液段；
S2、将形成液段的芯片置于旋转(高梯度)磁场中，进行如下操作：
①启动步进电机，带动L型旋转轴在纳米镍线液段进行循环移动，形成纳米镍线网；
②L型旋转轴带动纳米镍线网进入含有目标微生物的待测样品液段循环移动，将目标微生物捕获到纳米镍线网上形成磁性微生物；
③L型旋转轴带动磁性微生物进入HRP-纳米花液段循环移动，进行微生物标记，形成纳米花微生物；
④L型旋转轴带动纳米花微生物进入清洗液1液段循环移动，然后进入清洗液2液段循环移动；
⑤经过清洗后的纳米花微生物在L型旋转轴的带动下进入TMB显色液段循环移动进行酶催化反应；
⑥L型旋转轴带动纳米花微生物进入起始的纳米镍线液段，终止反应，电机停止运行；
⑦反应结束后，通过智能手机图像分析设备对产物颜色进行分析，从而实现对目标微生物的定性和定量检测。
优选地，所述修饰的免疫纳米镍线溶液的制备方法包括：
(1)将1M六水氯化镍溶液(纯度99.9％)75μL和乙二醇(99.8％)15mL混合加入烧杯中，加热至100℃；
(2)逐滴滴加0.5mL一水合肼至上述混合物，温度保持在100℃；
(3)继续加热30min，直到深灰色产物形成并漂浮在溶液表面；
(4)收集生成的深灰色产物即纳米镍线，用去离子水结合磁分离清洗3次，无水乙醇结合磁分离清洗2次；
(5)将清洗后的纳米镍线分散在含0.03％w/v聚乙烯吡咯烷酮的乙醇中，得到1mg/mL的纳米镍线溶液；
(6)将纳米镍线溶液进行超声混匀，使其形成均散体系；取500μL纳米镍线溶液加入反应瓶内，用超纯水清洗2次(以除去镍线表面的保护剂--乙醇)；
(7)将100μL H2O2、100μL NH4OH和500μL去离子水加入上述清洗后的纳米镍线中(进行纳米镍线的羟基化修饰)，将上述混合溶液置于80℃中水浴30min，得到修饰有羟基的纳米镍线(反应瓶不盖盖)；
(8)磁力架回收修饰有羟基的纳米镍线，并用超纯水清洗1次，无水乙醇清洗1次，然后置于烘箱中烘干(65℃烘干约8min)；
(9)用无水乙醇配制1％[3-(甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐溶液，用1％[3-(甲氧基硅烷基)丙基琥珀酸酐(分子式C10H18O6Si)溶液(10μL[3-(甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐+990μL无水乙醇)重悬烘干后的修饰有羟基的纳米镍线(进行纳米镍线的羧基化修饰)，之后置于混匀仪上室温过夜反应(15h)，得到修饰有羧基的纳米镍线；
[3-(甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐的结构如式I)所示：
Figure BDA0003167444070000051
(10)次日用磁力架回收修饰有羧基的纳米镍线，用无水乙醇洗涤3次(以除去表面残留的羧基化试剂)，再用超纯水清洗2次(以去除残留乙醇)，然后加入1MNaOH溶液(pH 9，用HCl调节pH)500μL，反应5h以上(可肉眼观察，镍线溶液水溶性变好，即羧基充分打开)；
(11)用超纯水清洗被碱液重悬的修饰有羧基的纳米镍线3次(以去除残余的NaOH)，再用pH 7.4的PB溶液清洗1次；
(12)加入500μg EDC(10mg/mL，pH 7.4的PB溶液溶解)和NHSS(10mg/mL，pH 7.4的PB溶液溶解)，反应1h，活化羧基(终体系500μL，pH 7.4的PB溶液)；
(13)用pH 7.4的PB溶液清洗修饰有活化羧基的纳米镍线2次(以去除残留的EDC和NHSS)；
(14)用420μL pH 7.4的PB溶液复溶修饰有活化羧基的纳米镍线，然后加入1.2mg/mL链霉亲和素溶液41.67μL和200μg脱脂乳(用于链霉亲和素与镍线结合及稳定反应体系)，室温反应1h；
(15)用pH 7.4的PB溶液清洗修饰有活化羧基的纳米镍线2次(以去除未结合的链霉亲和素)，然后加入1％脱脂乳(pH 7.4的PB溶液溶解)500μL封闭1h，得到链霉亲和素化镍线；
(16)在500μL PBS溶液中加入60μg链霉亲和素化镍线，磁分离清洗2次，去除脱脂乳溶液；
(17)然后用500μL PBS溶液复溶纳米镍线并加入4μg捕获抗体，室温孵育45min；其中，所述捕获抗体可特异性识别并结合所述目标微生物(当目标微生物为鼠伤寒沙门氏菌时，所述捕获抗体可以是浓度为2.25mg/mL的抗鼠伤寒沙门氏菌生物素化多克隆抗体)；
(18)磁分离清洗，去除多余的未结合抗体，即得。
优选地，所述HRP-纳米花溶液的制备方法包括：
(1)将浓度为3.35mg/mL的针对所述目标微生物的检测抗体(当目标微生物为鼠伤寒沙门氏菌时，所述检测抗体可以是抗鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体)20μg、5mg/mL HRP酶溶液180μg加入到1mL的3mM PBS溶液中；
(2)再将20μL的200mM CaCl2溶液(超纯水配制)加入步骤(1)的混合液中，室温孵育12h后(自组装形成纳米花)，15000rpm离心5min，收集沉淀，用超纯水清洗3次，离心得到HRP-纳米花材料，用400μL超纯水复溶，即得。
优选地，所述清洗液1、清洗液2为PBST液。
本发明中，所述目标微生物包括但不限于鼠伤寒沙门氏菌。
优选地，步骤S1中各储液腔的加样量为20μL；离心条件为：650～700rpm离心3s；
当目标微生物为鼠伤寒沙门氏菌时，所述捕获抗体可以是抗鼠伤寒沙门氏菌生物素化多克隆抗体(2.25mg/mL)，购自美国Fitzgerald公司。所述检测抗体可以是抗鼠伤寒沙门氏菌的单克隆抗体(3.35mg/mL)，购自美国Abcam公司。
本发明提供的微生物快速分离检测系统/平台，与现有技术相比，具有如下优点：
(一)反应试剂与待测样品的注入实现自动化。只要预先将样品存储在微流控芯片的储液腔，就可以利用离心力实现所有溶液的自动注入、自动分配和无交叉污染。
(二)将样品放入旋转高梯度磁场中，启动步进电机旋转一周即可完成整个反应，简单便捷。并且纳米镍线在磁场的存在下会形成纳米镍线网充满整个通道截面，能够增加纳米镍线上的抗体(捕获抗体)与微生物的碰撞结合几率，从而大大提高捕获效率。
(三)利用安卓手机平台开发的图像分析应用对反应结果进行灰度分析，检测结果可以进一步上传至云平台，进行风险评估，从而实现对微生物的风险预警。
(四)本发明的微生物分离检测系统集分离、标记、洗涤、催化、检测于一体，具有操作自动化、反应速度快、体积小等特点，在食源性致病菌、动物病毒等病原微生物快速检测方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中微生物检测平台的圆环形微流控芯片的结构示意图。
图2为本发明较佳实施例中微生物检测平台的旋转高梯度磁场的整体结构示意图。
图3为本发明较佳实施例中旋转高梯度磁场的构成部件结构示意图。
图4为本发明较佳实施例中微生物检测平台的整体结构示意图。
图5为本发明较佳实施例中微生物检测原理的过程示意图。
图6为本发明较佳实施例中智能手机图像分析得到的灰度值和不同浓度HRP-纳米花之间的曲线图。
图7为本发明较佳实施例中智能手机图像分析得到的灰度值和不同浓度的目标微生物之间的标定曲线。
图8为搭建好的微生物分离检测系统的照片。
图9为本发明较佳实施例中纳米镍线用量的优化结果图。
图10为本发明较佳实施例中旋转磁场转动速度的优化结果图。
图11为本发明较佳实施例中微生物捕获循环次数的优化结果图。
图12为本发明较佳实施例中免疫纳米花用量的优化结果图。
图13为本发明较佳实施例中免疫纳米花催化TMB显色液时间的优化结果图。
图14为本发明较佳实施例中手机图像分析得到的灰度值和不同非目标微生物之间的特异性结果图。
图15为本发明较佳实施例中手机图像分析得到的灰度值和不同浓度加标目标微生物的鸡肉样品之间的检测结果图。
图中，1-进样孔，2-储液腔，3-弧形反应腔，4-出气口，5-圆环形微流控芯片，6-圆柱形磁铁，7-L型旋转轴，8-条形小磁铁，9-中心轴，10-轴托，11-轴承，12-上半轴，13-下半轴，14-固定环，15-旋转磁场装置，16-步进电机，17-步进电机驱动器，18-单片机(嵌入式装置)，19-固定装置，20-智能手机图像分析设备。
具体实施方式
本发明旨在提供一种微生物快速分离检测的平台/系统，以解决现有技术中的试剂添加发生交叉污染以及固-液反应存在的捕获效率低的问题。
本发明还提供一种基于纳米镍线网与HRP-纳米花催化显色的微生物快速分离检测方法。
本发明采用如下技术方案：
本发明的微生物快速分离检测的平台包括：圆环形微流控芯片、旋转高梯度磁场、嵌入式装置和智能手机图像分析设备和三层支架。
根据本发明的第一方面，提供一种自动加样方式，包括：制作一种圆环形微流控芯片，利用离心力实现反应试剂的自动加样、自动分配，无交叉污染；利用旋转高梯度磁场形成纳米镍线网自动实现高分离效率捕获目标微生物。
所述圆环形微流控芯片用于储存反应试剂与待测样品。
所述旋转高梯度磁场用于捕获目标微生物、标记信号探针以及进行酶催化反应。
所述嵌入式装置用于控制生物反应时间和反应速度。
所述智能手机图像分析设备用于检测酶催化反应的产物。
其中，所述圆环形微流控芯片由倒模而成的包含微通道的圆环形PDMS与圆环形玻璃片键合而成。芯片外径尺寸为整个芯片的直径尺寸，内径为环形开口直径尺寸。芯片包含n个靠近圆心的纺锤状储液腔与一个与各个储液腔出口相连的弧形反应腔。弧形反应腔内侧边界处设置2n个出气口，以保证腔内气压与外界保持平衡和促进使用离心力自动注入溶液时，各反应液能够通过空气隔开，形成独立液段。
所述旋转高梯度磁场由中心轴、轴承、(空心)圆柱形磁铁、两个L型旋转轴、轴托和固定环组成；其中中心轴(中轴)直径尺寸等于轴承内径尺寸；轴承外径尺寸等于圆柱形磁铁内径尺寸；圆柱形磁铁外径尺寸等于圆环形微流控芯片内径尺寸。
所述中心轴包含中轴、上半轴和下半轴；上半轴与下半轴直径尺寸相等但小于中轴直径尺寸，且下半轴的长度大于上半轴的长度。
所述L型旋转轴在L型长端靠近顶部处有一个直径等于上下半轴直径的开孔，用于连接中心轴与旋转轴；L型短端尾部是一个半圆形的收缩结构，用于聚集磁感线，使两个L型旋转轴之间的气隙部分产生一个竖直的高梯度磁场。
所述轴托是一个中心为实心，两侧分别为能容纳中心轴(下半轴)与步进电机轴的轴套，用于连接旋转高梯度磁场和步进电机。
所述固定环是一个用于固定圆柱形磁铁的圆环，以此可以使步进电机通过中心轴和轴托带动L型旋转轴转动。
优选地，所述中心轴为光敏树脂材料，由3D打印机打印而成。
优选地，所述轴承为铁材料，高度为2mm。
优选地，所述圆柱形磁铁为铷铁硼材料N52强度材料。
优选地，所述L型旋转轴为铁材料。
优选地，所述轴托为光敏树脂材料，由3D打印机打印而成。
优选地，固定环为光敏树脂材料，由3D打印机打印而成。
第二方面，本发明所述的微生物快速分离检测平台在食源性致病菌检测中的应用。
根据本发明的第二方面，提供一种基于纳米镍线网与HRP-纳米花催化显色的微生物快速分离检测方法，该方法的工作原理是利用HRP-纳米花催化TMB显色产生蓝色信号物，结合圆环形微流控芯片，通过手机APP图像分析实现微生物的定量检测。首先，将免疫纳米镍线、目标微生物、HRP-纳米花、PBST清洗液、TMB溶液预先装载在圆环形微流控芯片中靠近圆心的纺锤状储液腔中，通过离心力将溶液转移到圆环形微流控芯片外圈的反应腔中，通过空气隔开各反应溶液并形成独立的液段。然后通过步进电机旋转高梯度磁场移动纳米镍线，分别与目标微生物、HRP-纳米花反应，形成镍线-微生物-纳米花-HRP复合体。最后，将该复合体经清洗后移至TMB液段，利用HRP催化TMB生成蓝色产物(TMB氧化物，TMBOX)，并利用手机APP进行灰度分析，实现目标微生物的定量分析(也可以实现定性检测)。
本发明中，通过链霉亲和素和生物素修饰。链霉亲和素与生物素具有极高的亲和性，1个链霉亲和素可以与4个生物素相结合。通过在镍线上修饰链霉亲和素，抗体使用生物素化的抗目标细菌抗体，就可以使镍线与抗体连接。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”、“内径”、“外径”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个、三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
化合物简称如下：
EDC：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
NHSS：N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐。
实施例1微生物分离检测系统/平台的构建
本实施例提供的微生物分离检测系统，所述系统包括圆环形微流控芯片5、旋转(高梯度)磁场装置15、连接元件、步进电机16、步进电机驱动器17、固定装置19、嵌入式装置(单片机)18和智能手机图像分析设备20。
所述圆环形微流控芯片上设有六个纺锤状储液腔2以及与各储液腔出口相连的弧形反应腔3(所述弧形反应腔设置在芯片的外缘)，储液腔用于储存加载的液体，弧形反应腔用于目标微生物的分离与检测；
所述旋转磁场装置与所述圆环形微流控芯片通过所述连接元件嵌合连接，圆环形微流控芯片中加载的磁性材料可在磁场带动下发生步移；所述连接元件包括中心轴9、轴承11和轴托10；
所述旋转磁场装置包含的两个L型旋转轴7，可在所述步进电机的驱动下进行圆周运动；
所述步进电机驱动器控制所述步进电机运转(步进电机驱动器接收来自单片机的脉冲信号，控制步进电机按照设定的方向移动)；
所述固定装置为三层支架，上层可拆卸地固定有嵌合连接的圆环形微流控芯片和旋转磁场装置，中层可拆卸地固定有步进电机，下层可拆卸地固定有步进电机驱动器；所述嵌合连接的圆环形微流控芯片和旋转磁场装置作为一个整体，通过轴托与步进电机可拆卸地连接；
其中，所述圆环形微流控芯片5的结构如下：
所述圆环形微流控芯片为中心具有圆孔的铜钱结构，圆孔的直径大于等于旋转磁场装置中圆柱形磁铁6的直径，保证圆环形微流控芯片可以顺利穿过圆柱形磁铁；
所述圆环形微流控芯片由倒模而成的包含环形微通道的圆环形PDMS与圆环形玻璃片键合而成；通过设置合适的尺寸，使芯片套在圆柱形磁铁中间，由于芯片是包含一个1.5mm厚的PDMS与一个0.5mm厚的玻璃片，借助其自身厚度可以使芯片在放到圆柱形磁铁中心位置后保持平行/平衡；
所述弧形反应腔被环形微通道上设有的2n个出气口4隔开，形成n个独立的开放式弧形腔体(用于形成独立液段)，每个腔体的内侧两端各有一个出气口(即储液腔数＝弧形腔体数＝1/2出气口数)；
所述圆环形微流控芯片上设有6个呈中心辐射状(均匀)排列的纺锤状储液腔，各储液腔之间的夹角为60°；
所述储液腔靠近芯片中心的一端设有进样孔1，另一端为出口，且各储液腔的出口与弧形反应腔3连通；
所述旋转磁场装置包括一个圆柱形磁铁6、两个L型旋转轴7、一根中心轴9、两个轴承11和一个固定环14；
两个L型旋转轴通过穿过圆柱形磁铁的中心轴分别固定在圆柱形磁铁的两端，圆柱形磁铁的中心为空心，中心轴嵌套轴承刚好可以穿过该空心；
所述中心轴分为上半轴12、中轴和下半轴13；下半轴的长度大于上半轴；上半轴将一个L型旋转轴通过该旋转轴长端尾部上设有的开孔固定于圆柱形磁铁的一端，下半轴将另一个L型旋转轴通过该旋转轴长端尾部上设有的开孔固定于圆柱形磁铁的另一端；
两个L型旋转轴的尺寸相同；L型旋转轴的短端尾部为半圆形的收缩结构，用于聚集磁感线；
圆环形微流控芯片嵌套于圆柱形磁铁的中部，其中一个L型旋转轴位于芯片上方，另一个L型旋转轴位于芯片下方，且在两个L型旋转轴短端尾部之间形成一个气隙，该气隙的高度大于芯片的厚度；在该气隙处产生一个竖直的(高梯度)磁场，且该磁场对应作用于芯片上的弧形反应腔；
贯穿于圆柱形磁铁的中心轴的下半轴13与步进电机轴通过轴托10连接；
固定环14用于固定圆柱形磁铁，使其在L型旋转轴发生转动时，圆柱形磁铁自身不转动，步进电机16可通过中心轴和轴托带动L型旋转轴发生转动。
所述L型旋转轴的材质为铁，在每个L型旋转轴的短端尾部还带有两个条形小磁铁8以增强磁场。
所述中心轴、轴托和固定环均为非磁性材料或导磁材料。
所述系统还包括嵌入式装置(单片机)18和智能手机图像分析设备20。
所述单片机用于控制反应时间和反应速度。
所述智能手机图像分析设备用于检测反应结果。优选地，利用安卓手机平台开发图像分析设备。
材质及规格如下：
圆环形微流控芯片的内径为18mm，外径为64mm；芯片上设有6个尺寸形状相同的储液腔；储液腔进样孔的直径为0.8mm；环形微通道上内侧设置的出气口的直径为0.6mm；
空心圆柱形磁铁(优选N52)的尺寸为：外径18mm，内径8mm，高28mm；
L型旋转轴的尺寸为：长38.5mm，宽5mm，高17mm；L型旋转轴的长端尾部设有孔径为3mm的开孔，中心轴的上半轴和下半轴可以穿过该开孔，将L型旋转轴固定于圆柱形磁铁上；
条形小磁铁(优选N52)的尺寸为：12.7mm×6.4mm×3.2mm；
中心轴的材质为光敏树脂；中心轴总长为46mm；中轴半径为2.5mm，长28mm；上半轴半径为1.5mm，长3mm；下半轴半径为1.5mm，长15mm；
轴承的材质为铁；尺寸为：外径8mm，内径5mm，高2mm；
轴托的材质为光敏树脂，轴托包括上托轴和下托轴与连接上下托轴的中心实心部分，其中，上托轴用来嵌套轴的下半轴，下托轴用来嵌套步进电机的轴；上托轴的半径为3mm，长7mm，开孔半径1.5mm；下托轴的半径为4mm，长10mm，开孔半径2.5mm。
微生物检测平台的圆环形微流控芯片的结构示意图见图1。
微生物检测平台的为旋转高梯度磁场的整体结构示意图见图2。
构成部件结构示意图见图3。
微生物检测平台的整体结构示意图见图4。
微生物检测原理的过程示意图见图5。
搭建好的微生物分离检测系统的照片见图8。
实施例2基于纳米镍线网与HRP-纳米花催化显色的食源性致病菌快速分离、检测方法
在本实施例中，利用实施例1构建的食源性致病菌检测平台，首先将修饰的免疫纳米镍线溶液、含有目标微生物的待测样品溶液、HRP-纳米花溶液、清洗液1(PBST液)、清洗液2(PBST液)和TMB显色液(商品化TMB显色液)预先装载在圆环形微流控芯片中靠近圆心的纺锤状储液腔中，通过离心力将溶液转移到圆环形微流控芯片外圈的反应腔中，通过空气隔开各反应溶液并形成独立的液段。然后通过步进电机旋转高梯度磁场移动纳米镍线，分别与目标细菌、HRP-纳米花反应，形成镍线-细菌-纳米花-HRP复合体。最后，将该复合体经清洗后移至底物(四甲基联苯胺，TMB)液段，利用HRP催化TMB生成蓝色产物(TMB氧化物，TMBOX)，并利用手机APP进行灰度分析，实现目标细菌的定量分析。
以食源性致病菌---鼠伤寒沙门氏菌为例，具体方法如下：
1、将1mL经过夜培养(16h)的鼠伤寒沙门氏菌(2.8×109CFU/mL)利用PBS缓冲液经10倍梯度稀释，得到2.8×103-2.8×107CFU/mL的沙门氏菌培养样本。
2、将用1％BSA封闭的圆环形微流控芯片依次注入20μL修饰的免疫纳米镍线溶液、20μL不同浓度的沙门氏菌样品、20μL免疫纳米花(HRP-纳米花溶液)、两部分20μL PBST清洗液、20μL TMB溶液；然后利用650～700rpm，3s的离心力将芯片储液腔中的液体注入到芯片外围的弧形反应腔中。
3、将芯片放入到旋转高梯度磁场中，启动步进电机。
4、旋转磁场首先在纳米镍线段循环2次，形成纳米镍线网，接着旋转磁场带动纳米镍线网进入沙门氏菌样品段循环移动50次进行细菌捕获形成磁细菌；然后，磁场带动磁细菌进入免疫纳米花液段循环50次进行细菌标记形成纳米花细菌；通过两段PBST清洗液分别20次循环移动清洗，纳米花细菌进入到TMB底物段进行30次循环催化反应；最后旋转磁场带动到达催化反应时间的纳米花细菌进入原始的纳米镍线液段，酶催化反应结束。
5、利用手机图像分析软件对生成物进行图像灰度分析，获得细菌浓度，然后将结果上传云平台进行风险评估，当细菌浓度超过设置的阈值，报警提示。
其中，修饰的免疫纳米镍线溶液的制备方法包括：
(1)将1M六水氯化镍溶液(纯度99.9％)75μL和乙二醇(99.8％)15mL混合加入烧杯中，加热至100℃；
(2)逐滴滴加0.5mL一水合肼至上述混合物，温度保持在100℃；
(3)继续加热30min，直到深灰色产物形成并漂浮在溶液表面；
(4)收集生成的深灰色产物即纳米镍线，用去离子水结合磁分离清洗3次，无水乙醇结合磁分离清洗2次；
(5)将清洗后的纳米镍线分散在含0.03％w/v聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的乙醇中，得到1mg/mL的纳米镍线溶液；
(6)将纳米镍线溶液进行超声混匀，使其形成均散体系；用移液枪吸取500μL纳米镍线溶液加入进样瓶内，用超纯水清洗2次，以除去镍线表面的保护剂(乙醇)；
(7)将100μL H2O2、100μL NH4OH和500μL去离子水加入上述清洗后的纳米镍线中(进行纳米镍线的羟基化修饰)，将上述混合溶液置于80℃中水浴30min，得到修饰有羟基的纳米镍线(进样瓶不盖盖)；
(8)磁力架回收修饰有羟基的纳米镍线，并用超纯水清洗1次，无水乙醇清洗1次，然后置于烘箱中烘干(65℃烘干约8min)；
(9)用无水乙醇配制1％[3-(甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐溶液(10μL[3-(甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐+990μL无水乙醇)，用1％[3-(甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐溶液重悬烘干后的修饰有羟基的纳米镍线(进行纳米镍线的羧基化修饰)，之后置于混匀仪上室温过夜反应15h，得到修饰有羧基的纳米镍线；
(10)次日用磁力架回收修饰有羧基的纳米镍线，用无水乙醇洗涤3次，以除去表面残留的羧基化试剂；再用超纯水清洗2次，以去除残留乙醇；然后加入1M NaOH溶液(pH 9，使用HCl进行pH调节)500μL，反应5h以上(可肉眼观察，镍线溶液水溶性变好，即羧基充分打开)；
(11)用超纯水清洗用碱液泡过的修饰有羧基的纳米镍线3次(以去除残余的NaOH)，再用pH 7.4的PB溶液清洗1次；
(12)加入500μg EDC(10mg/mL，pH 7.4的PB溶液溶解)和NHSS(10mg/mL，pH 7.4的PB溶液溶解)，反应1h，活化羧基(终体系500μL，pH 7.4的PB溶液)；
(13)用pH 7.4的PB溶液清洗修饰有活化羧基的纳米镍线2次，以去除残留的EDC和NHSS；
(14)用420μL pH 7.4的PB溶液复溶修饰有活化羧基的纳米镍线，然后加入1.2mg/mL链霉亲和素溶液41.67μL(50μg)和1％脱脂乳2μL(用于链霉亲和素与镍线结合及稳定反应体系)，室温反应1h；
(15)用pH 7.4的PB溶液清洗修饰有活化羧基的纳米镍线2次，以去除未结合的链霉亲和素；然后加入1％脱脂乳(pH 7.4的PB溶液溶解)500μL封闭1h，得到链霉亲和素化镍线；
(16)在500μL PBS溶液中加入60μg链霉亲和素化镍线，磁分离清洗2次，去除脱脂乳溶液；
(17)然后用500μL PBS溶液复溶纳米镍线并加入4μg抗鼠伤寒沙门氏菌生物素化多克隆抗体(2.25mg/mL)，室温孵育45min；其中，所述捕获抗体可特异性识别并结合所述目标微生物；
(18)磁分离清洗，去除多余的未结合抗体，即得。
所述HRP-纳米花溶液的制备方法包括：
(1)将20μg抗鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体(抗鼠伤寒沙门氏菌单克隆抗体，购自美国Abcam公司，浓度为3.35mg/mL)和180μg的HRP酶(5mg/mL，36μL)加入到1mL PBS溶液(3mM)中；
(2)再将20μL的200mM CaCl2溶液(超纯水配制)加入步骤(1)的混合液中，室温孵育12h后(自组装形成纳米花)，15000rpm离心5min，收集沉淀，用超纯水清洗3次，离心；每次复溶后，均匀振荡1min，得到HRP-纳米花材料，用400μL超纯水复溶，于4℃保存。
智能手机图像分析得到的灰度值和不同浓度HRP-纳米花之间的曲线图见图6。
图7为本发明检测鼠伤寒沙门氏菌建立的标定曲线，可表示为G＝-6.49×ln(CB)+200(R2＝0.99)，其中G为灰度值，GB为沙门氏菌浓度。结果表明，灰度值与细菌浓度之间具有良好的线性关系，检测下线可达56CFU/mL。
实施例3
1、为验证以蓝色TMBOX作为输出信号的可行性，利用组内开发的智能手机图像分析APP对不同浓度的TMBOX进行图像采集和分析。为了得到不同浓度TMBOX的颜色变化，对500μM的免疫纳米花进行倍比稀释(1/2原浓度稀释)得到不同浓度(2μM-500μM)的纳米花，然后使用相同体积的不同浓度的纳米花催化相同体积的TMB溶液，再利用该APP进行图像采集，得到灰度值，每组进行3次平行试验。实验结果如图6所示，TMBOX的浓度CNF与灰度值G之间有着良好的线性关系，随着纳米花浓度增加，蓝色加深，灰度值减小。该线性模型可表示为G＝-27.51×ln(CNF)+216.89(R2＝0.99)。结果表明随着TMBOX的浓度增大，其灰度值随之减小，并具有良好的线性关系，这说明TMBOX可作为输出信号。
2、参数优化
细菌自动化检测过程主要包括：分离、洗涤和催化。为了获得最佳的检测结果，需要对实验过程涉及的变量进行优化。其中纳米镍线用量、电机运行速度、电机循环次数，免疫纳米花用量、催化时间对细菌分离效率与信号输出强度具有重要影响，因此本发明进行了相应的参数优化实验。
(1)镍线用量优化
纳米镍线的使用量直接影响到细菌的分离效率，因此通过不同量的纳米镍线捕获鼠伤寒沙门氏菌的分离效率来确定最优免疫镍线使用量。将不同量的(20μg、40μg、60μg、80μg和100μg)的免疫镍线(1mg/mL)注入圆形微流控芯片，分别捕获20μL浓度为4.8×106CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌，通过平板计数法得到细菌数量，并计算得到不同量免疫镍线的分离效率。当免疫镍线的使用量从20μg增加至60μg时，分离效率从71％增加至90％。然而，当免疫镍线的使用量增加至80μg和100μg时，分离效率没有显著变化，这表明60μg的免疫镍线已足够用于捕获目标细菌。因此，本发明选择免疫镍线最佳用量为60μg(图9)。
(2)电机转动速度优化
电机转动速度直接影响到免疫镍线与细菌接触的时间，从而影响分离效率。将60μg的免疫纳米镍线与5×106CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌使用不同的速度(4.8～12degree/s)反应。当电机转动速度从12degree/s减小到6degree/s时，分离效率从73.8％增加到91.4％，继续减小转动速度到4.8degree/s时，分离效率略有增加(<2.6％)，因此本发明最佳电机转动速度为6degree/s(图10)。
(3)电机循环次数优化
电机循环次数也直接影响到免疫镍线与细菌接触的时间，从而影响分离效率。将60μg的免疫纳米镍线与7.2×106CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌使用20s/循环的速度循环不同次数。当循环次数为30次时，分离效率为79％，增加循环次数为40次时，分离效率为86％，继续增加循环次数为50时，分离效率增加至90％，而循环次数为60次时，分离效率为92％，基本保持不变，因此本发明最佳循环次数为50次(图11)。
(4)免疫纳米花用量优化
免疫纳米花的使用量会影响输出信号的强度也就是会影响该生物传感器的灵敏度。在其他条件一致的情况下，采用不同体积的免疫纳米花，分别和20μL浓度为2.8×106CFU/mL磁细菌进行结合反应，形成双抗夹心复合体；经过PBST洗液清洗后，复合体催化TMB产生蓝色TMBOX产物；最后用手机APP进行灰度分析。当免疫纳米花的体积从5μg增加至7.5μg时，灰度值从116.32减小到96.29。继续增加免疫纳米花的体积至10μg，灰度值为93.74，稍微降低，然而，当免疫纳米花的体积持续增加至12.5μg或15μg时，灰度值分别为88.73、83.45，没有明显变化。这表明7.5μg的免疫纳米花已足够用于催化显色。因此，本发明选择免疫纳米花的最佳用量为7.5μg(图12)。
(5)催化时间优化
酶催化时间是影响该生物传感器灵敏度的重要因素之一，它直接影响催化产物的浓度。因此，使用浓度为2.8×106CFU/mL的目标细菌，利用反应形成的镍线-细菌-纳米花-HRP复合体分别催化相同体积的TMB不同的循环次数：10、20、30、40、50。当循环次数从10增加到20时，灰度值从134.52减小到101.46，这是因为相同量的镍线-细菌-纳米花-HRP复合体在更长的催化时间里催化了更多的TMB，得到更多的TMBOX。增加循环次数为30次时，灰度值略有下降为95.95，继续增加循环次数为40和50，灰度值基本不变(93.14和92.05)。因此酶催化时间的最佳循环次数为30个循环(图13)。
3、系统性能评价
为评价该光学生物传感器的灵敏度、特异性等性能，本发明以鼠伤寒沙门氏菌为研究模型，开展了系统性能评价实验，包括不同浓度鼠伤寒沙门氏菌的检测、非目标细菌(金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌K12、)的检测和加标鸡肉样品的检测。
(1)沙门氏菌培养样品检测
本发明以鼠伤寒沙门氏菌为检测模型，利用该生物传感器在最优条件下对不同浓度(2.8×103-2.8×107CFU/mL)的沙门氏菌样品进行检测来建立数学模型。每个样本浓度进行3次平行实验，并使用PBS缓冲液作为空白对照。当鼠伤寒沙门氏菌的浓度从5.6×103CFU/mL增加到5.6×107CFU/mL时，TMBOX颜色从无色变为深蓝色。通过智能手机APP测量TMBOX的颜色以进行图像分析得到其灰度值。结果表明灰度值G与鼠伤寒沙门氏菌的浓度CB具有良好的线性关系，可表示为G＝-6.49×ln(CB)+200(R2＝0.99)，通过计算可以得到最低检测限为56CFU/mL，且检测时间低于1h(图7)。
(2)特异性检测
该光学生物传感器的特异性主要取决于抗鼠伤寒沙门氏菌的生物素化多克隆抗体和抗鼠伤寒沙门氏菌的单克隆抗体。本发明以106CFU/mL的鼠伤寒沙门氏菌作为目标细菌，106CFU/mL的金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌K12作为非目标细菌进行实验。空白对照、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和大肠杆菌K12的灰度值分别为152.7、154.0、148.6、152.2，远高于目标细菌的灰度值105.4，这表明该生物传感器具有良好的特异性(图14)。
(3)加标鸡肉样品中沙门氏菌检测
为了验证该生物传感器检测真实样品的能力，本发明利用该光学生物传感器对加标鸡肉样品进行不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌(2.8×103-2.8×107CFU/mL)实验。加标鸡肉样品的检测结果与培养样品检测结果趋势一致，并且通过计算可以得到浓度为2.8×103-2.8×107CFU/mL的加标鸡肉样品回收率为97.5％-101.8％，平均回收率为99.9％，这表明该光学生物传感器可用于鸡肉样品中鼠伤寒沙门氏菌的检测(图15)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.微生物分离检测系统，其特征在于，所述系统包括圆环形微流控芯片、旋转磁场装置、连接元件、步进电机、步进电机驱动器、固定装置、嵌入式装置和智能手机图像分析设备；
所述圆环形微流控芯片上设有n个纺锤状储液腔以及与各储液腔出口相连的弧形反应腔，储液腔用于储存加载的液体，弧形反应腔用于目标微生物的分离与检测；其中，n为大于等于2的整数；
所述旋转磁场装置与所述圆环形微流控芯片通过所述连接元件嵌合连接，圆环形微流控芯片中加载的磁性材料可在磁场带动下发生步移；所述连接元件包括中心轴、轴承和轴托；
所述旋转磁场装置包含的两个L型旋转轴可在所述步进电机的驱动下进行圆周运动；
所述步进电机驱动器控制所述步进电机运转；
所述固定装置为三层支架，上层可拆卸地固定有嵌合连接的圆环形微流控芯片和旋转磁场装置，中层可拆卸地固定有步进电机，下层可拆卸地固定有步进电机驱动器和嵌入式装置；其中，所述嵌入式装置为单片机；所述嵌合连接的圆环形微流控芯片和旋转磁场装置作为一个整体，通过轴托与步进电机可拆卸地连接；
其中，所述圆环形微流控芯片的结构如下：
所述圆环形微流控芯片为中心具有圆孔的铜钱结构，圆孔的直径大于等于旋转磁场装置中圆柱形磁铁的直径，保证圆环形微流控芯片可以顺利穿过圆柱形磁铁；
所述圆环形微流控芯片由倒模而成的包含环形微通道的圆环形PDMS与圆环形玻璃片键合而成；
所述弧形反应腔被环形微通道上设有的2n个出气口隔开，形成n个独立的开放式弧形腔体，每个腔体的内侧两端各有一个出气口；
所述圆环形微流控芯片上设有n个呈中心辐射状排列的纺锤状储液腔，各储液腔之间的夹角为360°/n；
所述储液腔靠近芯片中心的一端设有进样孔，另一端为出口，且各储液腔的出口与弧形反应腔连通；
所述旋转磁场装置包括一个圆柱形磁铁、两个L型旋转轴、一根中心轴、两个轴承和一个固定环；
两个L型旋转轴通过穿过圆柱形磁铁的中心轴分别固定在圆柱形磁铁的两端，圆柱形磁铁的中心为空心，中心轴嵌套轴承刚好可以穿过该空心；
所述中心轴分为上半轴、中轴和下半轴；下半轴的长度大于上半轴；上半轴将一个L型旋转轴通过该旋转轴长端尾部上设有的开孔固定于圆柱形磁铁的一端，下半轴将另一个L型旋转轴通过该旋转轴长端尾部上设有的开孔固定于圆柱形磁铁的另一端；
两个L型旋转轴的尺寸相同；L型旋转轴的短端尾部为半圆形的收缩结构，用于聚集磁感线；
圆环形微流控芯片嵌套于圆柱形磁铁的中部，其中一个L型旋转轴位于芯片上方，另一个L型旋转轴位于芯片下方，且在两个L型旋转轴短端尾部之间形成一个气隙，该气隙的高度大于芯片的厚度；在该气隙处产生一个竖直的磁场，且该磁场对应作用于芯片上的弧形反应腔；
贯穿于圆柱形磁铁的中心轴的下半轴与步进电机轴通过轴托连接；
固定环用于固定圆柱形磁铁，使其在L型旋转轴发生转动时，圆柱形磁铁自身不转动，步进电机可通过中心轴带动L型旋转轴发生转动；
所述嵌入式装置用于控制反应时间和反应速度；
所述智能手机图像分析设备用于检测反应结果。
2.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述L型旋转轴的材质为铁，在每个L型旋转轴的短端尾部还带有两个条形小磁铁以增强磁场。
3.根据权利要求2所述的系统，其特征在于，所述中心轴、轴托和固定环均为非磁性材料或导磁材料。
4.根据权利要求1所述的系统，其特征在于，所述嵌入式装置为单片机；
步进电机驱动器接收来自单片机的脉冲信号，控制步进电机按照设定的方向移动。
5.根据权利要求2-4任一项所述的系统，其特征在于，圆环形微流控芯片的内径为18mm，外径为64mm；芯片上设有6个尺寸形状相同的纺锤状储液腔；储液腔进样孔的直径为0.8mm；环形微通道上设置的出气口的直径为0.6mm；
空心圆柱形磁铁的尺寸为：外径18mm，内径8mm，高28mm；
L型旋转轴的尺寸为：长38.5mm，宽5mm，高17mm；L型旋转轴的长端尾部设有孔径为3mm的开孔，中心轴的上半轴和下半轴可以穿过该开孔，将L型旋转轴固定于圆柱形磁铁上；
条形小磁铁的尺寸为：12.7mm×6.4mm×3.2mm；
中心轴的材质为光敏树脂；中心轴总长为46mm；中轴半径为2.5mm，长28mm；上半轴半径为1.5mm，长3mm；下半轴半径为1.5mm，长15mm；
轴承的材质为铁；尺寸为：外径8mm，内径5mm，高2mm；
轴托的材质为光敏树脂，轴托包括上托轴和下托轴与连接上下托轴的中心实心部分，其中，上托轴用来嵌套中心轴的下半轴，下托轴用来嵌套步进电机的轴；上托轴的半径为3mm，长7mm，开孔半径1.5mm；下托轴的半径为4mm，长10mm，开孔半径2.5mm。
6.利用权利要求5所述系统分离检测微生物的方法，其特征在于，所述方法包括：
S1、将修饰的免疫纳米镍线溶液、含有目标微生物的待测样品溶液、HRP-纳米花溶液、清洗液1、清洗液2和TMB显色液分别按圆环形微流控芯片的顺时针或逆时针方向从进样孔注入到各纺锤状储液腔中；然后通过离心力使储液腔中的液体进入到外围的弧形反应腔中，形成各自独立的液段；
S2、将形成液段的芯片置于旋转磁场中，进行如下操作：
①启动步进电机，带动L型旋转轴在纳米镍线液段进行循环移动，形成纳米镍线网；
②L型旋转轴带动纳米镍线网进入含有目标微生物的待测样品液段循环移动，将目标微生物捕获到纳米镍线网上形成磁性微生物；
③L型旋转轴带动磁性微生物进入HRP-纳米花液段循环移动，进行微生物标记，形成纳米花微生物；
④L型旋转轴带动纳米花微生物进入清洗液1液段循环移动，然后进入清洗液2液段循环移动；
⑤经过清洗后的纳米花微生物在L型旋转轴的带动下进入TMB显色液段循环移动进行酶催化反应；
⑥L型旋转轴带动纳米花微生物进入起始的纳米镍线液段，终止反应，电机停止运行；
⑦反应结束后，通过智能手机图像分析设备对产物颜色进行分析，从而实现对目标微生物的定性和定量检测。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述修饰的免疫纳米镍线溶液的制备方法包括：
(1)将1M六水氯化镍溶液75μL和乙二醇15mL混合加入烧杯中，加热至100℃；
(2)逐滴滴加0.5mL一水合肼至上述混合物，温度保持在100℃；
(3)继续加热30min，直到深灰色产物形成并漂浮在溶液表面；
(4)收集生成的深灰色产物即纳米镍线，用去离子水结合磁分离清洗3次，无水乙醇结合磁分离清洗2次；
(5)将清洗后的纳米镍线分散在含0.03％w/v聚乙烯吡咯烷酮的乙醇中，得到1mg/mL的纳米镍线溶液；
(6)将纳米镍线溶液进行超声混匀，使其形成均散体系；取500μL纳米镍线溶液加入反应瓶内，用超纯水清洗2次；
(7)将100μL H2O2、100μL NH4OH和500μL去离子水加入上述清洗后的纳米镍线中，将上述混合溶液置于80℃中水浴30min，得到修饰有羟基的纳米镍线；
(8)磁力架回收修饰有羟基的纳米镍线，并用超纯水清洗1次，无水乙醇清洗1次，然后置于烘箱中烘干；
(9)用无水乙醇配制1％[3-(甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐溶液，用1％[3-(甲氧基硅烷基)丙基]琥珀酸酐溶液重悬烘干后的修饰有羟基的纳米镍线，之后置于混匀仪上室温过夜反应，得到修饰有羧基的纳米镍线；
(10)次日用磁力架回收修饰有羧基的纳米镍线，用无水乙醇洗涤3次，再用超纯水清洗2次，然后加入1M，pH 9的NaOH溶液500μL，反应5h以上；
(11)用超纯水清洗被碱液重悬的修饰有羧基的纳米镍线3次，再用pH 7.4的PB溶液清洗1次；
(12)加入500μg EDC和NHSS，反应1h，活化羧基；
(13)用pH 7.4的PB溶液清洗修饰有活化羧基的纳米镍线2次；
(14)用420μL pH 7.4的PB溶液复溶修饰有活化羧基的纳米镍线，然后加入1.2mg/mL链霉亲和素溶液41.67μL和200μg脱脂乳，室温反应1h；
(15)用pH 7.4的PB溶液清洗修饰有活化羧基的纳米镍线2次，然后加入1％脱脂乳500μL封闭1h，得到链霉亲和素化镍线；
(16)在500μL PBS溶液中加入60μg链霉亲和素化镍线，磁分离清洗2次，去除脱脂乳溶液；
(17)然后用500μL PBS溶液复溶纳米镍线并加入4μg捕获抗体，室温孵育45min；其中，所述捕获抗体可特异性识别并结合所述目标微生物；
(18)磁分离清洗，去除多余的未结合抗体，即得。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述HRP-纳米花溶液的制备方法包括：
(1)将浓度为3.35mg/mL的针对所述目标微生物的检测抗体溶液20μg、5mg/mL HRP酶溶液180μg加入到1mL的3mM PBS溶液中；
(2)再将20μL的200mM CaCl2溶液加入步骤(1)的混合液中，室温孵育12h后，15000rpm离心5min，收集沉淀，用超纯水清洗3次，离心得到HRP-纳米花材料，用400μL超纯水复溶，即得。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述清洗液1、清洗液2为PBST液。
10.根据权利要求7-9任一项所述的方法，其特征在于，所述目标微生物为鼠伤寒沙门氏菌；
步骤S1中各储液腔的加样量为20μL；离心条件为：650～700rpm离心3s。
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