CN113584123A - 一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，包括如下步骤：1）制备新鲜的大肠杆菌菌悬液，备用；2）制备新鲜的大肠杆菌噬菌体原液，备用；3）制备含一定琼脂比例的半固体培养基；4）制备含步骤1）新鲜的大肠杆菌菌悬液的双层培养基，将双层培养基完全冷却凝固一段时间；5）将步骤2）新鲜的大肠杆菌噬菌体原液以气溶胶形式释放在密闭空间中，搅拌2‑5min后静置2‑5min；6）采集密闭空间中的大肠杆菌噬菌体气溶胶于步骤4）的双层培养基上；7）将采集到的大肠杆菌噬菌体气溶胶置于培养箱，正置培养后，计数培养后的噬菌斑。本发明设计合理，操作简便，高效稳定，适用于环境采样和消毒产品空间消毒效果检测领域。
Description
技术领域
本发明属于微生物分析检测技术领域。具体地，涉及一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法。
背景技术
新冠病毒疫情袭来，让人们“谈毒色变”。每一次重大的公共卫生事件都是医疗卫生科技进步的重要推动力量。可预见的是，现在及未来的很长一段时间内，国家和公众对于环境公共卫生问题的关注会日渐加强。
新冠疫情来势汹汹，促使公众对病毒的关注度大大提升，空气净化器和消毒机，已越来越受大众关注。目前，国内消毒产品空间去除微生物的标准主要有《GB 21551.3-2010家用和类似用途空气净化器的抗菌、除菌、净化功能空气净化器的特殊要求》及《消毒技术规范》(2002年版)，但上述标准中只有对产品的除细菌性能检测方法，并没有对于除病毒性能的检测方法。
噬菌体作为一类细菌病毒的总称，其形态结构、颗粒大小及生物学特征与肠道病毒相近。大肠杆菌噬菌体作为一种细菌病毒，对人体为非致病性，也不会对实验人员造成感染，其培养计数的方法也要比人体病毒简单方便很多。因此噬菌体可作为人体病毒替代物用于研究消毒产品的空间除病毒能力。但目前国内对于空间除病毒的检测方法还是处于空白阶段，有关空间除病毒的标准检测方法国内外都未见报道，经查阅均也没有发现对于除病毒性能的检测方法的研究报道及专利申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效稳定的大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法。
本发明所述的一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，包括如下步骤：
1)制备新鲜的大肠杆菌菌悬液，备用；
2)制备新鲜的大肠杆菌噬菌体原液，备用；
3)制备含一定琼脂比例的半固体培养基；
4)制备含步骤1)新鲜的大肠杆菌菌悬液的双层培养基，将双层培养基完全冷却凝固一段时间；
5)将步骤2)新鲜的大肠杆菌噬菌体原液以气溶胶形式释放在密闭空间中，搅拌2-5min后静置2-5min；
6)采集密闭空间中的大肠杆菌噬菌体气溶胶于步骤4)的双层培养基上；
7)将采集到的大肠杆菌噬菌体气溶胶置于培养箱，正置培养后，计数培养后的噬菌斑。
优选地，步骤1)中，所述大肠杆菌菌悬液的浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/mL。
优选地，步骤2)中，所述噬菌体为噬菌体Phi-X174或噬菌体phage MS2；所述噬菌体原液浓度为5.0×105～1.0×1010PFU/mL。
优选地，步骤3)中，所述半固体培养基为半固体营养琼脂培养基(NA)或半固体胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)；所述半固体培养基中琼脂比例为0.3％～0.8％，优选为0.4％～0.6％。
优选地，步骤4)中，所述双层培养基的制备方法：取步骤1)新鲜的大肠杆菌菌悬液1mL于完全凝固的NA营养琼脂或TSA胰蛋白胨大豆琼脂平板上，并将步骤3)含有一定琼脂比例的半固体培养基覆盖在NA营养琼脂或TSA胰蛋白胨大豆琼脂平板上面，摇匀静置。
优选地，步骤4)中，所述双层培养基完全冷却凝固时间为0～8h，优选为1～2h。
优选地，步骤5)中，所述密闭空间为≥1m3，所述密闭空间的温度控制在20～25℃，湿度控制在50～70％RH。
优选地，步骤6)中，所述采集的工艺条件为：采用六级筛孔采样器进行采集，采集的采样体积为5～300L。
优选地，步骤7)中，所述正置培养时间为18～24h,培养温度为36±1℃。
与现有的大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法相比，本发明具有以下的有益效果：
1)本发明通过在采集前，制备成含有新鲜大肠杆菌菌悬液的双层培养基并待其完全冷却凝固一段时间后，再在密闭空间中，将大肠杆菌噬菌体原液雾化成气溶胶释放出来，再利用装有上述双层培养基的六级筛孔微生物采样器采集空间中的大肠杆菌噬菌体气溶胶，然后将采集完后的大肠杆菌噬菌体气溶胶正置培养后进行计数的特定顺序的步骤，在采集前通过制备上述双层培养基，后续采集到的大肠杆菌噬菌体气溶胶能高效地附着在上述双层培养基上，以保证采集的大肠杆菌噬菌体气溶胶能更好地着床于培养基上，有效地入侵宿主完成复制、合成与释放过程；从而使得最后采集培养出来的大肠杆菌噬菌体气溶胶的噬菌斑清晰可辨，在平皿上噬菌斑边界明显，错落有致，便于计数统计。
2)本发明所述大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，设计合理，操作简便，高效稳定，适用于环境采样和消毒产品空间消毒效果检测领域，填补了国内对于空间除病毒的检测技术领域的技术空白。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
噬菌体原液浓度测试方法参照：Adams MH.Bacteriophages.New York:Interscience Publishers,1959。
理论雾化噬菌体浓度C1计算公式：
注：
C1：理论雾化噬菌体浓度，PFU/m3；
C0：噬菌体原液浓度,PFU/mL；
Vf:雾化量，mL/min；
t：时间，min；
V：空间体积，m3。
实际回收浓度C2(PFU/m3)计算公式：
回收率R(％)的计算方法：
实施例1
一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，包括如下步骤：
1)制备新鲜的大肠杆菌菌悬液，所述大肠杆菌菌悬液的浓度为6.6×109CFU/mL；
2)制备新鲜的大肠杆菌噬菌体Phi-X174原液；所述噬菌体Phi-X174原液浓度为2.9×107PFU/mL；
3)制备含有0.4％琼脂比例的半固体营养琼脂培养基(NA)；
4)制备含步骤1)新鲜的大肠杆菌菌悬液的双层培养基：取步骤1)新鲜的大肠杆菌菌悬液1mL于完全凝固的NA营养琼脂平板上，并将步骤3)含有0.4％琼脂比例的半固体营养琼脂培养基(NA)覆盖在营养琼脂平板上面，摇匀静置；将制备得到的双层培养基完全冷却凝固1h；
5)将步骤2)新鲜的大肠杆菌噬菌体原液以气溶胶形式释放在20m3密闭空间中(温度控制在24℃，湿度控制在60％RH)，搅拌3min后静置3min；
6)采用六级筛孔采样器进行采集，采样体积为7.1L，采集密闭空间中的大肠杆菌噬菌体气溶胶于步骤4)的双层培养基上；
7)将采集到的大肠杆菌噬菌体气溶胶置于36±1℃培养箱，正置培养24h后，计数培养后的噬菌斑，具体性能指标的测试结果如表1所示。
实施例2
一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，包括如下步骤：
1)制备新鲜的大肠杆菌菌悬液，所述大肠杆菌菌悬液的浓度为7.8×109CFU/mL；
2)制备新鲜的大肠杆菌噬菌体phage MS2原液；所述噬菌体phage MS2原液浓度为1.3×108PFU/mL；
3)制备含有0.4％琼脂比例的半固体胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)；
4)制备含步骤1)新鲜的大肠杆菌菌悬液的双层培养基：取步骤1)新鲜的大肠杆菌菌悬液1mL于完全凝固的TSA胰蛋白胨大豆琼脂平板上，并将步骤3)含有0.4％琼脂比例的半固体胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)覆盖在胰蛋白胨大豆琼脂平板上面，摇匀静置；将制备得到的双层培养基完全冷却凝固1h；
5)将步骤2)新鲜的大肠杆菌噬菌体原液以气溶胶形式释放在20m3密闭空间中(温度控制在24℃，湿度控制在60％RH)，搅拌3min后静置3min；
6)采用六级筛孔采样器进行采集，采样体积为7.1L，采集密闭空间中的大肠杆菌噬菌体气溶胶于步骤4)的双层培养基上；
7)将采集到的大肠杆菌噬菌体气溶胶置于36±1℃培养箱，正置培养24h后，计数培养后的噬菌斑，具体性能指标的测试结果如表1所示。
实施例3：
一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，步骤3)制备含有0.8％琼脂比例的半固体营养琼脂培养基(NA)，其他均同实施例1。
实施例4：
一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，步骤3)制备含有0.3％琼脂比例的半固体营养琼脂培养基(NA)，其他均同实施例1，具体性能指标的测试结果如表1所示。
实施例5：
一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，步骤4)完全冷却凝固时间为4h，其他均同实施例1，具体性能指标的测试结果如表1所示。
实施例6：
一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，步骤4)完全冷却凝固时间为8h，其他均同实施例1，具体性能指标的测试结果如表1所示。对比例1：
一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，包括如下步骤：
1)制备新鲜的大肠杆菌菌悬液，所述大肠杆菌菌悬液的浓度为6.6×109CFU/mL；
2)制备新鲜的大肠杆菌噬菌体Phi-X174原液；所述噬菌体Phi-X174原液浓度为2.9×107PFU/mL；
3)制备灭菌的去离子水或者PBS溶液；
4)制备灭菌的营养琼脂培养基(NA)；
5)将步骤2)新鲜的大肠杆菌噬菌体原液以气溶胶形式释放在20m3密闭空间中(温度控制在24℃，湿度控制在60％RH)，搅拌3min后静置3min；
6)采用液体撞击式采样器进行采集，采样体积为7.1L，将密闭空间中的大肠杆菌噬菌体气溶胶于步骤3)制备的去离子水或者PBS溶液中，通过梯度稀释后，按照1:1比例取1mL步骤1)中的大肠杆菌菌悬液与之混合，置于36±1℃培养箱静置30min；
7)将步骤6)的噬菌体混合液倒入干净的平板内，并将提前准备好步骤4)适温的NA迅速覆盖上去，然后置于36±1℃培养箱，正置培养24h后，计数培养后的噬菌斑，具体性能指标的测试结果如表1所示。
对比例2：
一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的固体撞击式采样法，其他步骤均同实施例1，不同之处是：在固体培养基上涂布宿主后采集，包括如下步骤：
1)制备新鲜的大肠杆菌菌悬液，所述大肠杆菌菌悬液的浓度为6.6×109CFU/mL；
2)制备新鲜的大肠杆菌噬菌体Phi-X174原液；所述噬菌体Phi-X174原液浓度为2.9×107PFU/mL；
3)制备灭菌的营养琼脂培养基(NA)；
4)涂布含步骤1)新鲜的大肠杆菌菌悬液的固体培养基：取步骤1)新鲜的大肠杆菌菌悬液0.5mL于完全凝固的NA营养琼脂平板上，待培养基表面无明显流动水迹后使用；
5)将步骤2)新鲜的大肠杆菌噬菌体原液以气溶胶形式释放在20m3密闭空间中(温度控制在24℃，湿度控制在60％RH)，搅拌3min后静置3min；
6)采用六级筛孔采样器进行采集，采样体积为7.1L，采集密闭空间中的大肠杆菌噬菌体气溶胶于步骤4)的固体培养基上；
7)将采集到的大肠杆菌噬菌体气溶胶置于36±1℃培养箱，正置培养24h后，计数培养后的噬菌斑，具体性能指标的测试结果如表1所示。
对比例3：
一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，步骤3)制备含有0.2％琼脂比例的半固体营养琼脂培养基(NA)，其他均同实施例1，具体性能指标的测试结果如表1所示。
对比例4：
一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，步骤3)制备含有1.0％琼脂比例的半固体营养琼脂培养基(NA)，其他均同实施例1，具体性能指标的测试结果如表1所示。
表1
从表1的性能指标的测试结果可知：
实施例1与实施例2表明，本发明能高效采集空间中不同类型的大肠杆菌噬菌体气溶胶，不同之处在于实施例2采用高浓度的噬菌体原液(1.3×108PFU/mL)，回收过量，经过培养后噬菌斑重叠，造成无法统计真实噬菌斑数，这也反映出本发明采集办法回收率高，高效稳定。
实施例1、实施例5与实施例6表明，双层培养基完全冷却凝固能够长时间保持高效稳定回收。
实施例1、实施例3、实施例4、对比例3、对比例4表明，琼脂含量在低含量(0.2％)以及高含量(1.0％)对回收率造成较大影响，对比例3中由0.2％的琼脂比例制成的双层培养基质地过软，导致培养基容易破裂，因此也无法准确统计噬菌斑的数量，不建议使用。对比例4中1.0％琼脂比例制成的双层培养基质地过硬，不利于噬菌体气溶胶着床入侵宿主，导致回收率偏低。
对比例1采用液体撞击式采样法，一方面实验步骤多，实验较容易受污染；另一方面，由于液体采样回收率低，对于低浓度的气溶胶颗粒，甚至有可能会无法采集到。
对比例2采用固体撞击式采样法，虽然涂布在固体培养基上采集噬菌体气溶胶也有明显的效果，但是一方面由于涂布的菌悬液比较难干，等待实验的时间会比较长；另一方面这个方法由于细节较多，因此成功率不高，建议由熟练工操作。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备新鲜的大肠杆菌菌悬液，备用；
2）制备新鲜的大肠杆菌噬菌体原液，备用；
3）制备含一定琼脂比例的半固体培养基；
4）制备含步骤1）新鲜的大肠杆菌菌悬液的双层培养基，将双层培养基完全冷却凝固一段时间；
5）将步骤2）新鲜的大肠杆菌噬菌体原液以气溶胶形式释放在密闭空间中，搅拌2-5min后静置2-5min；
6）采集密闭空间中的大肠杆菌噬菌体气溶胶于步骤4）的双层培养基上；
7）将采集到的大肠杆菌噬菌体气溶胶置于培养箱，正置培养后，计数培养后的噬菌斑。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，其特征在于，步骤1）中，所述大肠杆菌菌悬液的浓度为1.0×109~1.0×1010 CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，其特征在于，步骤2）中，所述噬菌体为噬菌体Phi-X174或噬菌体phage MS2；所述噬菌体原液浓度为5.0×105~1.0×1010PFU/mL。
4.根据权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，其特征在于，步骤3）中，所述半固体培养基为半固体营养琼脂培养基（NA）或半固体胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）；所述半固体培养基中琼脂比例为0.3%~0.8%，优选为0.4%~0.6%。
5.根据权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，其特征在于，步骤4）中，所述双层培养基的制备方法：取步骤1）新鲜的大肠杆菌菌悬液1mL于完全凝固的NA营养琼脂或TSA胰蛋白胨大豆琼脂平板上，并将步骤3）含有一定琼脂比例的半固体培养基覆盖在NA营养琼脂或TSA胰蛋白胨大豆琼脂平板上面，摇匀静置。
6.根据权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，其特征在于，步骤4）中，所述双层培养基完全冷却凝固时间为0~8h，优选为1~2h。
7.根据权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，其特征在于，步骤5）中，所述密闭空间为≥1m3，所述密闭空间的温度控制在20~25℃，湿度控制在50~70%RH。
8.根据权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，其特征在于，步骤6）中，所述采集的工艺条件为：采用六级筛孔采样器进行采集，采集的采样体积为5~300L。
9.根据权利要求1所述的大肠杆菌噬菌体气溶胶的采集方法，其特征在于，步骤7）中，所述正置培养时间为18~24h,培养温度为36±1℃。
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