CN101603069A - 一步法病毒气溶胶的采集及其浓度的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一步法病毒气溶胶的采集及其浓度的检测方法，属于生物医学领域。该方法包括以下步骤：(1)将与待检测的病毒气溶胶相配对的敏感细胞进行富集培养，得到富集有大量敏感细胞的培养体；(2)将待检测的病毒气溶胶直接采到步骤(1)所制备的处于敏感期的培养体之上，培养，使病毒与敏感细胞作用形成噬斑，通过噬斑数量计算待检测的病毒气溶胶的浓度。本发明方法将病毒气溶胶直接采到富集敏感细胞的培养体上，采样后立即培养，不需要经过洗脱、转移等中间环节，通过数噬斑判断计算采样的病毒气溶胶浓度，避免了现有方法即间接采样法中所存在的诸多缺点，具有快速敏感、准确可靠、抗干扰能力强、方便经济、简单实用，不污染环境等优点。

Description

一步法病毒气溶胶的采集及其浓度的检测方法

技术领域

本发明涉及一种对病毒气溶胶进行直接采样并检测其浓度的方法，属于生物医学领域。

背景技术

我国二十多年来医院感染皆以呼吸道感染为主，而且还有增加趋势。在呼吸道感染的病原体中病毒比细菌和真菌的种类多、毒力强、诊疗困难，且新的病毒不断出现。国际气溶胶学会早已提出，全球应加强对病毒性气溶胶感染的研究，虽然对呼吸道病原体的分析化验水平较高，方法较全，但如果采不到病毒气溶胶标本，就只能是纸上谈兵，为此病毒气溶胶采样的研究就显得十分重要了。

病毒气溶胶采样技术比细菌复杂、难度大、资料少，但应用广泛，在国防、科研及实践中都具有重要意义。目前对病毒气溶胶的采样主要是二步法，即先将采样介质涂抹于采样器皿上，再去进行病毒气溶胶采样，然后将带病毒的采样介质洗下来，把它放在敏感细胞上培养，通过数噬斑来计算采到的病毒气溶胶的数量。这种采样方式由于采样后需经过洗脱、转移等中间环节，灵敏度大大降低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种新的一步法病毒气溶胶的采集及检测方法，该方法将病毒气溶胶直接采到富集敏感细胞的环境中，采样后立即拿去培养，不需要经过洗脱、转移等中间环节，最后可通过数噬斑判断计算采样的病毒气溶胶数量，提高了检测的灵敏度和准确性。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一步法病毒气溶胶的采集及其浓度的检测方法，包括以下步骤：

(1)将与待检测的病毒相配对的敏感细胞进行富集培养，得到富集有大量敏感细胞的培养体；

(2)当步骤(1)所制备的富集有大量敏感细胞的培养体中的敏感细胞处于敏感期时，利用空气微生物采样器将待检测的病毒气溶胶直接采到该培养体上，培养，使病毒与敏感细胞作用形成噬斑，通过噬斑数量计算待检测的病毒气溶胶的浓度，计算式如下所示：

$C=\frac{1000N}{V\·t_s}---\left(1\right)$

式中，C——病毒气溶胶浓度，pfu/m³；N——采样到的病毒所形成的噬斑数，pfu(噬斑形成单位)；V——微生物采样器的采样流量，L/min；ts——采样时间，min。

举例说明如下：如用安德森采样器，采样2分钟得到5个病毒(数噬斑得来的)。则病毒气溶胶的浓度由下式计算：

至于与待检测的病毒相配对的敏感细菌具体是何种细菌，取决于待检测病毒的具体种类，例如，如果待检测的是f₂、MS-2、Qβ、T系列噬菌体，则与之相配对的敏感细菌是大肠杆菌；如果待检测的是28βФ噬菌体，则与之相配对的敏感细菌是沙门氏菌；如果待检测的是流感病毒，则与之相配对的敏感细胞是鸡胚纤维母细胞；如果待检测的是炭疽杆菌、霍乱弧菌、鼠疫杆菌(注意严格防护)或其他菌种相对应的噬菌体，则与之相配对的敏感细菌是相应的炭疽杆菌、霍乱弧菌、鼠疫杆菌或其他菌体。总之，本领域技术人员可根据待检测病毒的具体种类很容易确定与之相配对的敏感细胞，并按照本领域的常规方法制备富集有该敏感细菌的培养体。

作为参考，所述的培养体可分别按照以下两种方法制备：

(1)用于感染性病毒的采样：将与待检测的病毒气溶胶相配对的敏感细胞，加到装有培养该敏感细胞的培养液的采样器皿上贴壁(如玻璃平皿、琼脂条等)，通过繁殖形成富集有大量敏感细胞的培养体；上述所得到的培养体主要用于感染性病毒在室内的采样，当在脏的环境中采样，采样时宜在上述培养体中加入浓度约为4万单位/ml青霉素或链霉素的抗菌素去抑制空气中的杂菌(如培养液中有抗菌素不必再加入)。采样时间以不出现杂菌为宜。

(2)对于噬菌体的采样：将与待检测的病毒气溶胶相配对的敏感细胞斜面培养20小时，用营养肉汤冲洗转移，在肉汤中37℃震荡培养3小时，再将其制成约1-5亿个菌/ml的菌液，取少许，加到装有营养琼脂的采样器皿上部，再以最快速度加入等量溶化了的50℃营养琼脂液(要求：既不能烫死敏感细菌，又不能使溶化了的营养琼脂在未铺平时凝固)，立即混匀，制成薄薄一层菌垫，加入的菌液与营养琼脂液等量，形成半固体，其量约为原培养基的1/10；待半固体凝固后，立即用于细菌的病毒(即噬菌体)的采样。采样后放入37℃恒温箱培养4-6小时左右，数噬斑。

按照上述方法对病毒气溶胶进行采样时，宜注意以下几点：(1)待采样的病毒气溶胶是感染性病毒：若是在干净环境中采样则可以直接拿去培养(该培养方法也是本领域技术人员所熟知)；如果在脏的环境中采样，采样时要在上述培养体中加适当浓度的抗菌素去抑制空气中的杂菌(如培养液中有抗菌素不必再加入)。(2)待采样的病毒气溶胶是噬菌体：不必加任何东西，不用任何处理即可去采样培养，显示噬斑。

本发明具有快速、敏感、抗干扰能力强、准确可靠、方便经济、简单实用的优点，是对病毒气溶胶进行采样的理想方法，便于大规模推广使用。其主要特点表现为：①快速：最快的4-6小时即可出结果，它比二步法至少可节省一半的时间；②敏感：因为此法的先决条件就是将细菌或病毒气溶胶与敏感细胞配对，不用再去冲洗、转移病毒，更不会产生损失或失活，因而敏感，只要采到一个病毒，即可显示一个噬斑；③抗干扰能力强：本发明将空气中的病毒(噬菌体)直接采到敏感细胞上，不怕空气中其他杂菌，因为在4-6小时即可出结果，在这样短的时间里杂菌还未来得及繁殖，噬斑已经很明显了，因此不怕杂菌干扰；④准确可靠：上面已提及只要有病毒碰到敏感细胞，就会有噬斑，因此准确可靠；⑤省时省力：不用将采到的病毒用介质再冲洗下来，省时省力，至少可节省一半的时间及工作量。⑥对人体无害，不怕污染环境，它是模拟感染性病毒防恐防生物战的理想标本。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些小的修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料

(1)T系列噬菌体T₁、大肠菌B株-中国科学院微生物所菌种保存管理中心；

(2)味精噬菌体、味精发酵菌(T6B菌)-可从全国各大味精厂购买得到；

(3)流感病毒(疫苗株)-购自兰州生物制品所；

(4)Sindbis病毒、鸡胚纤维母细胞-购自军事医学科学院五所；

实施例1

将对T系列噬菌体敏感的大肠菌B株制成半固体：大肠菌B株斜面培养20小时，用营养肉汤冲洗转移，在肉汤中37℃震荡培养3小时，再将其制成约1-5亿个菌/ml的菌液，取少许，加到装有营养琼脂的采样器皿上部，再以最快速度加入等量溶化了的50℃营养琼脂液(要求：既不能烫死敏感细菌，又不能使溶化了的营养琼脂在未铺平时凝固)，立即混匀，制成薄薄一层菌垫，加入的菌液与营养琼脂液等量，形成半固体，其量约为原培养基的1/10；待半固体凝固后，立即用于细菌的病毒(即噬菌体)的采样；

采样前将上述达到敏感时期的大肠菌B株的培养体置于空气微生物采样器(如购自辽阳应用技术研究所的LWC-1采样器)中，再用该空气微生物采样器去采样，将采集的T系列噬菌体气溶胶样品直接放入37℃温箱培养，4-6小时后计数噬斑，判断计算所采样的T系列噬菌体的气溶胶浓度。一个具体的实例是：用LWC-1采样器采6分钟，得到30个噬斑(1个噬菌体形成1个噬斑)，噬菌体的浓度按下式计算；

计算结果为：噬菌体气溶胶的浓度为125个病毒/米³。

实施例2

将对味精噬菌体敏感对数期的味精发酵菌(T6B菌)加到等量的培养该菌的50℃的带有专用培养基(专用培养基配方：蛋白胨1％-2％、牛肉膏0.3％-0.5％、氯化钠0.5％、玉米浆0.1％-0.2％、葡萄糖1％-2％、琼脂1.8％、Ph＝6.8-7.0)的玻璃平皿或无毒平皿上，制成薄薄一层菌垫，立即用JWL-1型采样器采集味精噬菌体气溶胶，采样后直接放36℃培养6-12小时后计数噬斑数。(用JWL-1型采样器3分钟采到18个噬菌体，按下式计算噬菌体数)

计算结果为噬菌体气溶胶的浓度为240个噬菌体/米³。

实施例3

用8-9日龄鸡胚，通过常规细胞培养法，去头、爪、内脏，按病毒专业常规法，用Hanks液洗，用1％的胰酶消化，并加入生长液，经过滤，计数，配成150-200万个细胞/ml的浓度，然后按每个噬斑瓶(60cm²)加入12ml的比例，加入各种不同大小洁净的采样器皿中，于37℃培养24小时，制成单层贴壁细胞。然后去采空气中的流感或Sindbis病毒气溶胶。主要在试验室中采样，接着加入1.8％的琼脂覆盖，37℃培养48小时后，计数噬斑。计算病毒气溶胶的浓度。如用JWL-1型采样器，采5分钟，采到15个病毒，则结算结果为：

注：Hanks液、消化液和生长液的具体组成成分和配制详见文献(《医用实验病毒学》，主编：杜平，1985年出版)。

Claims (10)

1、一步法病毒气溶胶的采集及其浓度的检测方法，包括以下步骤：

(1)、将与待检测的病毒相配对的敏感细胞进行富集培养，得到富集有大量敏感细胞的培养体；

(2)、当步骤(1)所制备的富集有大量敏感细胞的培养体中的敏感细胞处于敏感期时，采用空气微生物采样器将待检测的病毒气溶胶直接采到该培养体上，培养，使病毒与敏感细胞作用形成噬斑，计数噬斑数量，按照以下公式计算待检测病毒气溶胶的浓度：

$C=\frac{1000N}{V\·t_s}---\left(1\right)$

式中，C：病毒气溶胶浓度，单位：pfu/m³；N：采样到的病毒所形成的噬斑数；V：微生物采样器的采样流量，单位：L/min；ts：采样时间，单位：min。

2、按照权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的培养体按照以下方法制备：将与待检测的感染性病毒气溶胶相配对的敏感细胞，加到装有培养该敏感细胞的培养液的采样器皿上贴壁培养，通过繁殖形成富集有大量敏感细胞的培养体，用于感染性病毒的采样。

3、按照权利要求1的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述的培养体按照以下方法制备：将与待检测的噬菌体气溶胶相配对的敏感细胞斜面培养20小时，用营养肉汤冲洗转移，在肉汤中37℃震荡培养，再将其制成约1-5亿个菌/ml的菌液；取少许菌液加到装有营养琼脂的采样器皿上部，再迅速加入等重量的溶化了的温度为50℃的营养琼脂，立即混匀，制成薄薄一层菌垫，形成半固体；待半固体凝固后，立即用于噬菌体的采样。

4、按照权利要求1或3的检测方法，其特征在于：所述待检测的病毒气溶胶选自f₂、MS-2、Qβ或T系列噬菌体；所述的相对应的敏感细菌是大肠杆菌。

5、按照权利要求1或3的检测方法，其特征在于：所述待检测的病毒气溶胶为28βΦ噬菌体；所述的相对应的敏感细菌是沙门氏菌。

6、按照权利要求1或3的检测方法，其特征在于：所述待检测的病毒气溶胶为味精噬菌体；所述的相对应的敏感细菌是味精发酵菌(T6B菌)。

7、按照权利要求1或3的检测方法，其特征在于：所述待检测的病毒气溶胶是炭疽杆菌、霍乱弧菌、鼠疫杆菌或其他菌种对应的噬菌体；所述的相对应的敏感细菌是炭疽杆菌、霍乱弧菌、鼠疫杆菌或其他菌种。

8、按照权利要求1或2的检测方法，其特征在于：所述待检测的病毒气溶胶是流感病毒气溶胶；所述的相对应的敏感细胞是鸡胚纤维母细胞。

9、按照权利要求1或2的检测方法，其特征在于：所述待检测的病毒气溶胶是Sindbis病毒；所述的相对应的敏感细胞是鸡胚纤维母细胞。

10、按照权利要求1或2的检测方法，其特征在于：所述待检测的病毒气溶胶是特定感染性病毒；所述的敏感细胞是与该感染性病毒相配对的特定敏感细胞。