CN113584100B - 一种裂解酶在制备低聚原花青素中的应用以及蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法 - Google Patents

一种裂解酶在制备低聚原花青素中的应用以及蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种裂解酶在制备低聚原花青素中的应用以及蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，涉及生物转化技术领域。所述裂解酶的氨基酸序列为SEQIDNO.1～5中的一种。蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，包括以下步骤：葡萄籽用水浸泡后进行爆破处理，得到爆破样品；对所得爆破样品进行脱脂，得脱脂样品；将所得脱脂样品和提取液混合进行提取，得到高聚原花青素粗提物；将所得高聚原花青素粗提物和裂解酶混合，无氧条件下反应，得低聚原花青素。本申请所述制备低聚原花青素的方法具有高聚原花青素降解工艺简单、反应条件温和、环境污染小以及低聚原花青素得率高等优点。

Description

一种裂解酶在制备低聚原花青素中的应用以及蒸汽爆破联合 裂解酶制备低聚原花青素的方法
技术领域
本发明涉及生物转化技术领域，尤其涉及一种裂解酶在制备低聚原花青素中的应用以及蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法。
背景技术
葡萄籽占葡萄总重量的3-6％，是葡萄酒、葡萄饮料等产业的主要副产品，自然资源丰富。据统计，中国每年的葡萄产量达到一千多万吨，主要用与葡萄酒和葡萄饮料等生产，而剩下的葡萄籽无法被充分利用，造成巨大的资源浪费。葡萄籽中含有大量的原花青素(含量3.9％)，葡萄籽中的原花青素主要存在于外珠被中，并被木质素、蛋白质、纤维素、以及半纤维素紧密包裹，此外原花青素还与细胞组分、基质等具有较强的相互作用。原花青素主要由儿茶素(Catechin，CA)、表儿茶素(Epicatechin，EC)、表儿茶没食子酸酯(Epicatechin 3-O-gallate，ECG)通过C4-C8或者C4-C6键聚合而成。然而葡萄籽中原花青素的50％以上为不可提取的原花青素(聚合度较高)，与细胞等其他组分相互作用较强，而可提取原花青素中的高聚原花青素(DP≥5)占比达到65％以上。因此将高聚原花青素转化为能被人吸收的低聚原花青素或单体意义重大。
原花青素(Procyanidin，PC)是一种类黄烷醇物质，是一类植物中广泛存在多酚类化合物。研究表明，原花青素是一种强大的抗氧化剂，其抗自由基氧化能力是维生素E的50倍，维生素C的20倍，是国际上公认的清除人体内自由基有效的天然抗氧化剂。此外，原花青素在预防和治疗由自由基引发的衰老等疾病以及治疗心脏病和癌症方面也表现出重要应用潜力。天然原花青素是由不同的单体形成的聚合度不一的混合物。根据聚合度(Degreeof polymerization，DP)的不同，将聚合度>4的称作高聚原花青素(Polymericprocyanidins，PPC)，聚合度≤4的称为低聚原花青素(Oligomeric procyanidins，OPC)。体内代谢研究显示，原花青素主要是通过肠道微生物的分解作用而被人体吸收，进一步研究发现，肠道微生物的分解作用只针对原花青素单体和二聚体，随着原花青素聚合度增多，分解作用将大大降低。因此，只有低聚的原花青素才能被人体吸收并发挥其抗氧化活性。
目前，PPC的降解方法主要有氧化降解法、酸性降解法、碱性降解法和氢化降解法等。中国专利CN1654463A公开了利用双氧水或氯酸钾作为氧化剂降解高聚原花青素，然而双氧水和氯酸钾在使用和储藏过程中不稳定、易分解，因而催化效率低下，且耗费较大，易引起原花青素酚羟基氧化形成副产物。此外，中国专利CN101012216A利用酸性催化剂如硫酸、盐酸或强酸性树脂等催化降解从葡萄籽等中提取的高聚原花青素，但是无论酸性还是碱性降解法，其中所用到的酸或碱都会对设备造成腐蚀，排放也会污染环境，并且会导致原花青素分子结构(尤其是具有生物活性的酚羟基)被破坏，导致活性降低。中国专利CN101544703A采用氢化降解金荞麦中高聚原花青素，主要通过在惰性气体并高压高温环境下进行反应，反应要求较高且操作不便。中国专利CN109096237A公开了利用一种季铵盐类离子液体催化降解高聚原花青素的方法，尽管离子液体催化是一种绿色过程，但是在离子液体的制备中会使用一些化学试剂，后者会产生较多污染；此外，高纯度离子液体的制备目前挑战也较大。总之，现有的高聚原花青素降解方法缺点明显，如成本太高、降解率低、污染环境等。因此，开发酶法降解高聚原花青素制备低聚原花青素对于低聚原花青素的规模化制备意义重大，可有效降低生产成本、减少环境污染并提高高聚原花青素的降解率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种裂解酶在制备低聚原花青素中的应用以及蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，克服了葡萄籽原花青素提取率低以及传统低聚原花青素生产中环境污染严重、底物转化率低、工艺复杂等不足。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种裂解酶在通过催化高聚原花青素C4-C8或C4-C6键断裂，制备低聚原花青素中的应用，所述裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1～5中的一种。
本发明提供了一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，包括以下步骤：
葡萄籽用水浸泡后进行爆破处理，得到爆破样品；
对所得爆破样品进行脱脂，得脱脂样品；
将所得脱脂样品和提取液混合进行提取，得到高聚原花青素粗提物；
将所得高聚原花青素粗提物和裂解酶混合，无氧条件下反应，得低聚原花青素。
优选的，所述葡萄籽为60～200目粉末。
优选的，所述浸泡时间为20～50min。
优选的，爆破处理具体为在2.5～3.5Mpa的压力下维持90～120s，0.00087s内将压力泄出。
优选的，脱脂处理中，所得爆破样品与石油醚的固液比为1～5g：20～100mL，在50～250rpm下震荡脱脂2～8h。
优选的，高聚原花青素粗提物的提取为脱脂样品与提取液以固液比1～3g：15～30mL混合，20～35℃，10～30kHZ，超声处理15～30min。
优选的，所述提取液为丙酮、水和乙酸的混合溶液，丙酮、水和乙酸的体积比为72.5～75:24.5～26.5:0.5～3。
优选的，超声处理后，在室温避光条件下，震荡提取1～2h。
优选的，所述反应的温度为25～50℃，时间为1～2h，pH值为5.0～7.0。
本发明提供了一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，克服了葡萄籽原花青素提取率低以及传统低聚原花青素生产中环境污染严重、底物转化率低、工艺复杂等不足。
本发明通过蒸汽爆破促进了葡萄籽中原花青素的释放，进一步提高原花青素的提取率至24.5mg/g，并联合裂解酶降解高聚原花青素制备低聚原花青素，高聚原花青素转化率高达82.8％。具有原花青素提取率高、高聚原花青素降解工艺简单、反应条件温和、环境污染小以及低聚原花青素得率高等优点。
附图说明
图1为原花青素单体及原花青素聚合体结构式(CA为儿茶素、EC为表儿茶素、ECG为表儿茶没食子酸酯、EGC为表没食子儿茶素、Procyanidin为原花青素类)
具体实施方式
本发明提供了一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，包括以下步骤：
葡萄籽用水浸泡后进行爆破处理，得到爆破样品；
对所得爆破样品进行脱脂，得脱脂样品；
将所得脱脂样品和提取液混合进行提取，得到高聚原花青素粗提物；
将所得高聚原花青素粗提物和裂解酶混合，无氧条件下反应，得低聚原花青素。
在本发明中，葡萄籽为粉末状，其粒径优选为60～200目，进一步优选为100～160目，更进一步优选为120～140目，再进一步优选为130目。
本发明中，葡萄籽浸泡时间优选为20～50min，进一步优选为25～45min，更进一步优选为30～40min，再进一步优选为35min。
本发明中，葡萄籽爆破压力优选为2.5～3.5Mpa，进一步优选为2.8～3.2Mpa，更进一步优选为3.0Mpa；压力维持时间优选为90～120s，进一步优选为100～110s，更进一步优选为102～107s，在进一步优选为105s。
本发明中，爆破样品脱脂优选采用石油醚进行，爆破样品与石油醚的固液比优选为1～5g：20～100mL，进一步优选为2～4g：40～80mL，更进一步优选为2.5～3.5g：50～70mL，再进一步优选为3g：60mL。
本发明中，脱脂优选在震荡条件下进行，震荡速率优选为50～250rpm，进一步优选为100～200rpm，更进一步优选为120～180rpm，再进一步优选为150rpm；脱脂时间优选为2～8h，进一步优选为3～7h，更进一步优选为4～6h，再进一步优选为5h。
本发明中，脱脂样品与提取液的固液比优选为1～3g:15～30mL，进一步优选为1g：15～25mL，更进一步优选为1:20mL。
本发明所述提取液中，丙酮、水和乙酸的体积比优选为72.5～75:24.5～26.5:0.5～3，进一步优选为73～75:24.5～25.5:0.5～1.5，更进一步优选为75:24.5:0.5。
本发明中，提取包括顺次进行的超声处理和避光震荡处理，所述超声处理温度优选为20～35℃，进一步优选为27～32℃，更进一步优选为28～31℃，再进一步优选为30℃；所述超声处理频率优选为10～30kHZ，进一步优选为15～25kHZ，更进一步优选为20kHZ；所述超声处理时间优选为15～30min，进一步优选为20～25min，更进一步优选为23min；所述避光震荡提取的时间优选为1～2h，进一步优选为1.5～1.7h，更进一步优选为1.5h。
本发明中，所述无氧条件下反应的温度优选为25～50℃，进一步优选为30～45℃，更进一步优选为35～40℃，再进一步优选为37℃；反应时间优选为1～2h，进一步优选为1.2～1.8h，更进一步优选为1.5h；所述反应pH值优选为5.0～7.0，进一步优选为5.5～6.5，更进一步优选为6。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将130目的葡萄籽粉加入到去离子水中浸泡35min。然后，将处理后的葡萄籽粉进行蒸汽爆破处理，在3.0MPa压力下维持105s，后在0.00087s内完成泄压，完成爆破。爆破结束后，收集爆破样品。向3.00g爆破后的葡萄籽样品加入60mL石油醚，后在150rpm的震荡条件下脱脂5h。脱脂结束后，通过减压蒸发去除石油醚得到脱脂葡萄籽粉样品。取1.00g脱脂后的葡萄籽样品置于20mL体积比为75：24.5：0.5的丙酮：超纯水：乙酸溶液，并在30℃，20kHZ，超声23min。超声结束后，室温遮光条件下震荡1.5h，粗提物中高聚原花青素含量为24.4％。经计算，原花青素提取率高达22mg/g。取上述高聚原花青素粗提物加入没食子酸盐脱羧酶(裂解酶)，在37℃，pH为6.0条件下，反应1.5h，最终得到低聚原花青素。经检测，产物中的高聚原花青素含量降至4.2％，低聚原花青素含量高达24.54％，底物转化率高达82.8％。
实施例2
将60目的葡萄籽粉加入到去离子水中浸泡20min。然后，将处理后的葡萄籽粉进行蒸汽爆破处理，在2.5MPa压力下维持90s，后在0.00087s内完成泄压，完成爆破。爆破结束后，收集爆破样品。向1.00g爆破后的葡萄籽样品加入20mL石油醚，后在50rpm的震荡条件下脱脂2h。脱脂结束后，通过减压蒸发去除石油醚得到脱脂葡萄籽粉样品。取1.00g脱脂后的葡萄籽样品置于15mL体积比为72.5：24.5：3的丙酮：超纯水：乙酸溶液，并在20℃，10kHZ，超声15min。超声结束后，室温遮光条件下震荡1h，粗提物中高聚原花青素含量为21.4％。经计算，原花青素提取率高达20.3mg/g。取上述高聚原花青素粗提物加入2,4-二乙酰基间苯三酚水解酶(裂解酶)，在25℃，pH为5.0条件下，反应1h，最终得到低聚原花青素。经检测，产物中的高聚原花青素含量降至6.2％，低聚原花青素含量高达22.12％，底物转化率高达74.6％。
实施例3
将200目的葡萄籽粉加入到去离子水中浸泡50min。然后，将处理后的葡萄籽粉进行蒸汽爆破处理，在3.5MPa压力下维持120s，后在0.00087s内完成泄压，完成爆破。爆破结束后，收集爆破样品。向5.00g爆破后的葡萄籽样品加入100mL石油醚，后在250rpm的震荡条件下脱脂8h。脱脂结束后，通过减压蒸发去除石油醚得到脱脂葡萄籽粉样品。取3.00g脱脂后的葡萄籽样品置于30mL体积比为73：26.5：0.5的丙酮：超纯水：乙酸溶液，并在35℃，30kHZ，超声30min。超声结束后，室温遮光条件下震荡2h，粗提物中高聚原花青素含量为24.4％。经计算，原花青素提取率高达19.6mg/g。取上述高聚原花青素粗提物加入原儿茶脱羧酶(裂解酶)，在50℃，pH为7.0条件下，反应2h，最终得到低聚原花青素。经检测，产物中的高聚原花青素含量降至9.2％，低聚原花青素含量高达14.54％，底物转化率高达70.5％。
实施例4
将130目的葡萄籽粉加入到去离子水中浸泡35min。然后，将处理后的葡萄籽粉进行蒸汽爆破处理，在3.0MPa压力下维持105s，后在0.00087s内完成泄压，完成爆破。爆破结束后，收集爆破样品。向3.00g爆破后的葡萄籽样品加入60mL石油醚，后在150rpm的震荡条件下脱脂5h。脱脂结束后，通过减压蒸发去除石油醚得到脱脂葡萄籽粉样品。取1.00g脱脂后的葡萄籽样品置于20mL体积比为75：24.5：0.5的丙酮：超纯水：乙酸溶液，并在30℃，15kHZ，超声23min。超声结束后，室温遮光条件下震荡1.5h，粗提物中高聚原花青素含量为25.2％。经计算，原花青素提取率高达24.5mg/g。取上述高聚原花青素粗提物加入邻焦儿茶酸脱羧酶(裂解酶)，在37℃，pH为6.0条件下，反应1.5h，最终得到低聚原花青素。经检测，产物中的高聚原花青素含量降至5.5％，低聚原花青素含量高达22.2％，底物转化率高达78.2％。
实施例5
将130目的葡萄籽粉加入到去离子水中浸泡35min。然后，将处理后的葡萄籽粉进行蒸汽爆破处理，在3.0MPa压力下维持105s，后在0.00087s内完成泄压，完成爆破。爆破结束后，收集爆破样品。向3.00g爆破后的葡萄籽样品加入60mL石油醚，后在150rpm的震荡条件下脱脂5h。脱脂结束后，通过减压蒸发去除石油醚得到脱脂葡萄籽粉样品。取1.00g脱脂后的葡萄籽样品置于20mL体积比为75：24.5：0.5的丙酮：超纯水：乙酸溶液，并在30℃，25kHZ，超声23min。超声结束后，室温遮光条件下震荡1.5h，粗提物中高聚原花青素含量为21.4％。经计算，原花青素提取率高达20.3mg/g。取上述高聚原花青素粗提物加入没食子酸盐脱羧酶(裂解酶)，在37℃，pH为6.0条件下，反应1.5h，最终得到低聚原花青素。经检测，产物中的高聚原花青素含量降至7.5％，低聚原花青素含量高达19.6％，底物转化率高达69.4％。
由以上实施例可知，本发明提供了一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法。本发明通过蒸汽爆破促进了葡萄籽中原花青素的释放，进一步提高原花青素的提取率至24.5mg/g，并联合酶法降解高聚原花青素制备低聚原花青素，高聚原花青素转化率高达82.8％。该方法具有原花青素提取率高、高聚原花青素降解工艺简单、反应条件温和、环境污染小以及低聚原花青素得率高等优点，具有工业化应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 威海百合生物技术股份有限公司；北京化工大学
<120> 一种裂解酶在制备低聚原花青素中的应用以及蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Thr Ala Pro Ile Gln Asp Leu Arg Asp Ala Ile Ala Leu Leu Gln
1 5 10 15
Gln His Asp Asn Gln Tyr Leu Glu Thr Asp His Pro Val Asp Pro Asn
20 25 30
Ala Glu Leu Ala Gly Val Tyr Arg His Ile Gly Ala Gly Gly Thr Val
35 40 45
Lys Arg Pro Thr Arg Ile Gly Pro Ala Met Met Phe Asn Asn Ile Lys
50 55 60
Gly Tyr Pro His Ser Arg Ile Leu Val Gly Val His Ala Ser Arg Gln
65 70 75 80
Arg Ala Ala Leu Leu Leu Gly Cys Glu Ala Ser Gln Leu Ala Leu Glu
85 90 95
Val Gly Lys Ala Val Lys Lys Pro Val Ala Pro Val Val Val Pro Ala
100 105 110
Ser Ser Ala Pro Cys Gln Glu Gln Ile Phe Leu Ala Asp Asp Pro Asp
115 120 125
Phe Asp Leu Arg Thr Leu Leu Pro Ala Pro Thr Asn Thr Pro Ile Asp
130 135 140
Ala Gly Pro Phe Phe Cys Leu Gly Leu Ala Leu Ala Ser Asp Pro Asp
145 150 155 160
Asp Ala Ser Leu Thr Asp Val Thr Ile His Arg Leu Cys Val Gln Gly
165 170 175
Arg Asp Glu Leu Ser Met Phe Leu Ala Ala Gly Arg His Ile Glu Val
180 185 190
Phe Arg Gln Lys Ala Glu Ala Ala Gly Lys Pro Leu Pro Ile Thr Ile
195 200 205
Asn Met Gly Leu Asp Pro Ala Ile Tyr Ile Gly Ala Cys Phe Glu Ala
210 215 220
Pro Thr Thr Pro Phe Gly Tyr Asn Glu Leu Gly Val Ala Gly Ala Leu
225 230 235 240
Arg Gln Arg Pro Val Glu Leu Val Gln Gly Val Ser Val Pro Glu Lys
245 250 255
Ala Ile Ala Arg Ala Glu Ile Val Ile Glu Gly Glu Leu Leu Pro Gly
260 265 270
Val Arg Val Arg Glu Asp Gln His Thr Asn Ser Gly His Ala Met Pro
275 280 285
Glu Phe Pro Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Asn Pro Ser Leu Pro Val Ile
290 295 300
Lys Val Lys Ala Val Thr Met Arg Asn Asn Ala Ile Leu Gln Thr Leu
305 310 315 320
Val Gly Pro Gly Glu Glu His Thr Thr Leu Ala Gly Leu Pro Thr Glu
325 330 335
Ala Ser Ile Trp Asn Ala Val Glu Ala Ala Ile Pro Gly Phe Leu Gln
340 345 350
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355 360 365
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385 390 395 400
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Val Asp Pro Arg Pro Phe Ala Pro Glu Tyr Phe Ala Arg Leu Glu Lys
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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50 55 60
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Phe Asp Leu Arg Thr Leu Leu Pro Ala Pro Thr Asn Thr Pro Ile Asp
130 135 140
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165 170 175
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290 295 300
Lys Val Lys Ala Val Thr Met Arg Asn Asn Ala Ile Leu Gln Thr Leu
305 310 315 320
Val Gly Pro Gly Glu Glu His Thr Thr Leu Ala Gly Leu Pro Thr Glu
325 330 335
Ala Ser Ile Trp Asn Ala Val Glu Ala Ala Ile Pro Gly Phe Leu Gln
340 345 350
Asn Val Tyr Ala His Thr Ala Gly Gly Gly Lys Phe Leu Gly Ile Leu
355 360 365
Gln Val Lys Lys Arg Gln Pro Ala Asp Glu Gly Arg Gln Gly Gln Ala
370 375 380
Ala Leu Leu Ala Leu Ala Thr Tyr Ser Glu Leu Lys Asn Ile Ile Leu
385 390 395 400
Val Asp Glu Asp Val Asp Ile Phe Asp Ser Asp Asp Ile Leu Trp Ala
405 410 415
Met Thr Thr Arg Met Gln Gly Asp Val Ser Ile Thr Thr Ile Pro Gly
420 425 430
Ile Arg Gly His Gln Leu Asp Pro Ser Gln Thr Pro Glu Tyr Ser Pro
435 440 445
Ser Ile Arg Gly Asn Gly Ile Ser Cys Lys Thr Ile Phe Asp Cys Thr
450 455 460
Val Pro Trp Ala Leu Lys Ser His Phe Glu Arg Ala Pro Phe Ala Asp
465 470 475 480
Val Asp Pro Arg Pro Phe Ala Pro Glu Tyr Phe Ala Arg Leu Glu Lys
485 490 495
Asn Gln Gly Ser Ala Lys
500
<210> 3
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Arg Gly Lys Ile Ala Leu Glu Glu His Val Ser Thr Pro Glu Asn
1 5 10 15
Asn Arg Leu Trp Asp Ser Thr Gly Glu Ala Asn Arg Asn Gly Ser Glu
20 25 30
Tyr Met Gln Asp Val Glu Arg Arg Leu Leu Asp Arg Ser Ile Gln Leu
35 40 45
Glu Glu Met Ala Gln Arg Asn Ile Asp His Val Ile Leu Ser Leu Thr
50 55 60
Ser Pro Gly Ala Gln Ser Ile Leu Asp Lys Ala Lys Ala Val Ser Phe
65 70 75 80
Ala Arg Asp Thr Asn Asp Phe Ile Val Asp Asn Tyr Val Lys Pro Asn
85 90 95
Pro Asp Lys Phe Ser Ala Phe Ala Thr Leu Ala Leu Gln Asn Pro Glu
100 105 110
Ala Ala Ala Glu Glu Leu Glu Arg Ala Val Lys Lys Leu Gly Met Lys
115 120 125
Gly Ala Leu Ile Asn Gly Tyr Thr Asn Val Lys Asp Ser Glu His Gly
130 135 140
Leu Tyr Leu Asp Asp Glu Ser Met Leu Val Phe Trp Asp Lys Val Asn
145 150 155 160
Glu Leu Asn Val Pro Val Tyr Leu His Pro Arg Glu Pro Leu Glu Gly
165 170 175
Pro Ala Arg Gly Ile Tyr Thr Gly Tyr Glu Ser Leu Ile Gly Ser Ala
180 185 190
Trp Gly Phe Ala Gln Glu Thr Ala Val His Ala Ile Arg Leu Met Met
195 200 205
Ser Gly Leu Phe Asp Arg Tyr Pro Asn Leu Asn Leu Val Leu Gly His
210 215 220
Leu Gly Glu Gly Leu Val His Met Leu Pro Arg Thr Gln His Arg Leu
225 230 235 240
Tyr Arg Gln Arg Phe Gly Cys Gly Leu Gly Lys Ala Glu Lys Pro Leu
245 250 255
Met His Tyr Leu Gln Asn Asn Phe Ile Val Thr Thr Ser Gly His Phe
260 265 270
Asn Thr His Ser Leu Asn Asn Ala Ile Glu Val Met Gly Ala Asp Arg
275 280 285
Val Met Phe Ser Val Asp Tyr Pro Tyr Glu Asp Ile His Gln Ala Cys
290 295 300
Asp Trp Phe Asp Pro Leu Glu Met Asp Glu Gly Leu Lys Glu Lys Ile
305 310 315 320
Ala Trp Gly Asn Ala Ser Arg Val Phe Asn Ile Lys
325 330
<210> 4
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asn Tyr Pro Ala Glu Pro Phe Arg Ile Lys Ser Val Glu Thr Val
1 5 10 15
Ser Met Ile Pro Arg Asp Glu Arg Leu Lys Lys Met Gln Glu Ala Gly
20 25 30
Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Asn Ser Lys Asp Ile Tyr Ile Asp Leu Leu
35 40 45
Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser Asp Lys Gln Trp Ala Gly Met
50 55 60
Met Met Gly Asp Glu Ala Tyr Ala Gly Ser Glu Asn Phe Tyr His Leu
65 70 75 80
Glu Arg Thr Val Gln Glu Leu Phe Gly Phe Lys His Ile Val Pro Thr
85 90 95
His Gln Gly Arg Gly Ala Glu Asn Leu Leu Ser Gln Leu Ala Ile Lys
100 105 110
Pro Gly Gln Tyr Val Ala Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Tyr
115 120 125
His Gln Glu Lys Asn Gly Ala Val Phe Val Asp Ile Val Arg Asp Glu
130 135 140
Ala His Asp Ala Gly Leu Asn Ile Ala Phe Lys Gly Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Lys Leu Gln Lys Leu Ile Asp Glu Lys Gly Ala Glu Asn Ile Ala
165 170 175
Tyr Ile Cys Leu Ala Val Thr Val Asn Leu Ala Gly Gly Gln Pro Val
180 185 190
Ser Met Ala Asn Met Arg Ala Val Arg Glu Leu Thr Ala Ala His Gly
195 200 205
Ile Lys Val Phe Tyr Asp Ala Thr Arg Cys Val Glu Asn Ala Tyr Phe
210 215 220
Ile Lys Glu Gln Glu Gln Gly Phe Glu Asn Lys Ser Ile Ala Glu Ile
225 230 235 240
Val His Glu Met Phe Ser Tyr Ala Asp Gly Cys Thr Met Ser Gly Lys
245 250 255
Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu Cys Met Asn Asp Asp
260 265 270
Glu Met Phe Ser Ser Ala Lys Glu Leu Val Val Val Tyr Glu Gly Met
275 280 285
Pro Ser Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg Asp Met Glu Ala Met Ala Ile
290 295 300
Gly Leu Arg Glu Ala Met Gln Tyr Glu Tyr Ile Glu His Arg Val Lys
305 310 315 320
Gln Val Arg Tyr Leu Gly Asp Lys Leu Lys Ala Ala Gly Val Pro Ile
325 330 335
Val Glu Pro Val Gly Gly His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Arg Phe
340 345 350
Cys Glu His Leu Thr Gln Asp Glu Phe Pro Ala Gln Ser Leu Ala Ala
355 360 365
Ser Ile Tyr Val Glu Thr Gly Val Arg Ser Met Glu Arg Gly Ile Ile
370 375 380
Ser Ala Gly Arg Asn Asn Val Thr Gly Glu His His Arg Pro Lys Leu
385 390 395 400
Glu Thr Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Tyr Ala His
405 410 415
Met Asp Val Val Ala Asp Gly Ile Ile Lys Leu Tyr Gln His Lys Glu
420 425 430
Asp Ile Arg Gly Leu Lys Phe Ile Tyr Glu Pro Lys Gln Leu Arg Phe
435 440 445
Phe Thr Ala Arg Phe Asp Tyr Ile
450 455
<210> 5
<211> 347
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Met Lys Leu Lys Leu Ser Arg Arg Lys Leu Leu Arg Ser Ile Pro Leu
1 5 10 15
Leu Thr Gly Ser Ala Leu Leu Ser His Ser Leu Leu Asn Asn Val Tyr
20 25 30
Ala Thr Ser Gly Ser Ser Val Tyr Asn Asn Ser Ser Val Thr Glu Asn
35 40 45
Leu Phe Asn Ala Gly Ala Ser Leu Asn Lys Thr Leu Ile Thr Tyr Phe
50 55 60
Gln Val Pro Met Gln Lys Arg Leu Arg Val Asn Glu Ile Glu Ile Gln
65 70 75 80
Gly Lys Pro Tyr Ser His Phe Phe Asn Ser Arg Leu Asp Ala Pro Leu
85 90 95
Glu Met Val Thr Ser Leu Glu Lys Gly Pro Leu Ala Lys Asn His Ile
100 105 110
Leu Pro Pro Thr Ile Glu Gly Leu Lys Val Leu Leu Glu Asp Phe Asp
115 120 125
Lys Tyr Pro Pro Ser Gly Tyr Gly Val Val Glu Asp Gly Pro Cys Ala
130 135 140
Tyr Ala Gln Ser Gln His Leu Phe Pro Gly Val Thr Thr Asp Met Phe
145 150 155 160
Arg Trp Trp Phe Thr Trp His Pro Val Glu Ser Glu Arg Tyr Tyr Leu
165 170 175
Trp Phe Pro His Ala His Ile His Asn Ser Val Ala Asp Pro Lys Arg
180 185 190
Leu Ala Asp Ser Ser Leu Ser Tyr Asp Lys Arg Leu Tyr Gly Asn Pro
195 200 205
Asn His Ile Ile Glu Tyr Ile Gly Glu Asn Tyr Leu Asp Gly Ile Ile
210 215 220
Asn Phe Asp Ala Pro Glu Ser Leu Gly Leu Asp Ser Glu Leu Leu Arg
225 230 235 240
Arg Asn Asn Phe Thr Phe Asn Ala Ser Gly Ile Ile Thr Pro Tyr Asp
245 250 255
His Arg Leu Thr Pro Leu Val Met Met Ile His Leu Gly Arg Asp Thr
260 265 270
Pro Ala Gly Met Gln Met Ile Asn Arg Tyr Trp Ile Gly Thr His Pro
275 280 285
Ser Trp Asn Arg Phe Ser Asn Phe Pro Asn Gly Ala Lys Leu Ser Glu
290 295 300
Glu Tyr Ile Thr Arg Ala Gly Met Asn Ala Glu Ser Leu Glu Leu Phe
305 310 315 320
Ala Tyr Glu Met Ala Val His Asp Met Thr Glu Phe Thr Ser Leu Gly
325 330 335
Arg Phe Leu Pro His Ile Tyr Lys Glu Phe Ala
340 345

Claims (10)

1.一种裂解酶在通过催化高聚原花青素C4-C8或C4-C6键断裂，制备低聚原花青素中的应用，所述裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5中的一种。
2.一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
葡萄籽用水浸泡后进行爆破处理，得到爆破样品；
对所得爆破样品进行脱脂，得脱脂样品；
将所得脱脂样品和提取液混合进行提取，得到高聚原花青素粗提物；
将所得高聚原花青素粗提物和裂解酶混合，无氧条件下反应，得低聚原花青素；
所述裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，葡萄籽为60~200目粉末。
4.根据权利要求2或3所述的一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，浸泡时间为20~50min。
5.根据权利要求2所述的一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，爆破处理具体为在2.5~3.5Mpa的压力下维持90~120s，0.00087s内将压力泄出。
6.根据权利要求5所述的一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，脱脂处理中，所得爆破样品与石油醚的固液比为1~5g：20~100mL，在50~250rpm下震荡脱脂2~8h。
7.根据权利要求6所述的一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，高聚原花青素粗提物的提取为脱脂样品与提取液以固液比1~3g：15~30mL混合，20~35℃，10~30kHZ，超声处理15~30min。
8.根据权利要求7所述的一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，所述提取液为丙酮、水和乙酸的混合溶液，丙酮、水和乙酸的体积比为72.5~75:24.5~26.5:0.5~3。
9.根据权利要求7所述的一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，超声处理后，在室温遮光条件下，震荡提取1~2h。
10.根据权利要求2所述的一种蒸汽爆破联合裂解酶制备低聚原花青素的方法，其特征在于，所述反应的温度为25~50℃，时间为1~2h，pH值为5.0~7.0。
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