CN113577392A - 一种复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜及其制备方法和应用，该人工骨膜采用聚乙烯醇/羧甲基纤维素钠作为凝胶基底材料，通过添加丝素蛋白和脱细胞骨膜基质水凝胶，形成结构均一的凝胶薄膜材料。本发明制备的人工骨膜接近天然骨膜物理和生物特性，具有较好的生物相容性，还为细胞提供类似于细胞外基质的高度水化的3D网络结构和粗糙表面，有利于细胞的粘附和生长，利于成骨细胞和骨原细胞的增殖和分化，进而可以促进新骨的形成，在力学上还有着骨膜相似的性能，还具有良好的抗溶血和抗凝血作用，这是一种非常有潜力的柔软组织修复的理想材料，在骨组织工程领域具有十分广泛的应用前景。

Description

一种复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及组织工程材料技术领域，特别的涉及一种复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜及其制备方法和应用。

背景技术

骨缺损是骨科临床的常见疾病，可由创伤、感染及肿瘤等多种因素引起，是骨科治疗的难题之一。当前此领域的研究多聚焦于骨替换材料的改进、良好种子细胞的选择及相应复合技术的开发。临床常用的治疗方法是骨移植，即利用骨支架填充骨缺损，并诱导骨再生。但骨支架植入后，其修复过程基本是一种被动的连接和填充过程，缺少对缺损环境的主动感知。部分支架虽辅以外源性细胞因子，能够起到一定的促进血管新生及骨再生的作用，但仍旧难以模拟体内骨重建过程，因而没有获得令人满意的治疗效果。

骨膜是一层覆盖于骨外表面的一层薄组织膜，将70～80％的血供输送到骨皮质，提供成骨细胞、前体细胞和骨膜干细胞，在骨形成和再生中发挥着重要作用。骨膜可以通过多种生物过程促进愈合，如细胞增殖和分化，或通过旁分泌信号，这些信号可以招募和激活宿主的骨祖细胞。因此，骨膜是骨骼的重要组成部分，具有强大的成骨潜能及隔离功能。已有研究报道，骨膜移植能够成功修复不同大小，特别是大段骨组织缺损。与单纯骨支架移植相比，骨膜的移植能够在缺损部位富集更多的骨修复细胞，能够诱导形成天然的骨结构和合适的血管网络，从而引导骨组织再生。同时，骨膜可在缺损局部形成屏障结构，减少感染和异位骨化的发生，为损伤的修复提供良好的局部微环境。但自体骨膜供体少且存在供区坏死等问题，异体骨膜易发生免疫排斥并且具有潜在的疾病传播风险。如果人造骨膜可以发挥与天然骨膜相似的功能，将有助于修复大段骨缺损。人工骨膜在体内具有良好的防止疤痕组织增生，促进血管再生的能力，能够通过外源-内源相结合的途径模拟骨膜的发育过程完成骨膜的修复，并通过骨膜固有的成骨机制来使骨缺损快速而均匀的修复。因而，有必要在体外制备能够模拟天然骨膜的结构与功能的人工骨膜，并且具有良好的发展前景。

如发明专利CN104096268A提供一种矿化胶原人工骨膜，该人工骨膜使用纳米钙磷盐与胶原纤维有序排列的矿化胶原制成，具有与天然骨膜一致的物质组成和微观及宏观结构。但矿化胶原蛋白膜存在机械性能差，湿润后力学性质会显著改变的问题，从而导致手术期溃散的风险及降解速率过快等不利影响。发明专利CN111569149A提供了一种共组装人工骨膜及其制备方法，所述共组装人工骨膜包括：由胶原蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶和丝素蛋白共组装制备得到的丝素蛋白/掺硅羟基磷灰石/胶原蛋白共组装人工骨膜；和/或：由丝素蛋白介导的掺硅羟基磷灰石溶胶和胶原蛋白共组装制备得到的胶原蛋白/掺硅羟基磷灰石/丝素蛋白共组装人工骨膜，但颗粒状羟基磷灰石存在难以塑形，骨膜下易游走，这影响了骨膜材料的修复效果；同时，羟基磷灰石脆性大，受力易破碎。且现有的人工骨膜在抗溶血性和抗凝血性远低于天然骨膜，限制其在实际临床上的应用。

因此，如何制备一种机械性能相匹配、具备良好的生物相容性、抗溶血性和抗凝血性的人工骨膜，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明的目的在于提供了一种复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜及其制备方法和应用，解决现有人工骨膜与天然骨膜的杨氏模量不匹配、生物相容性低，以及植入材料可引起的溶血和凝血等问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜，所述人工骨膜以聚乙烯醇和羧甲基纤维素钠共混的水凝胶形成的薄膜材料作为基体，所述的水凝胶中交联有丝素蛋白，且所述水凝胶中还均匀分散有脱细胞骨膜基质。羧甲基纤维素钠(Carboxymethylcellulose,CMC)是一种通过天然的纤维素通过化学改性后得到的较好水溶性的纤维素醚，它具有保水性能好、成膜后形状稳定、分散均匀的特点。天然骨膜经过处理后有效去除了骨膜组织中的细胞成分，消除了异种组织的免疫原性，保留了骨膜细胞外基质的活性成分，为骨修复提供良好的微环境。丝素蛋白相对于自体骨的主要成分胶原来说，拥有与胶原相似的促细胞粘附、铺展、生长和分化的作用。

作为优选的，所述人工骨膜的厚度为20μm～1000μm，孔隙率为30％～80％。

作为优选的，所述丝素蛋白、脱细胞骨膜基质、聚乙烯醇、羧甲基纤维钠的质量比为1～3:1～5:1～5:1～3。

作为优选的，所述丝素蛋白采用以下步骤制得：选取中等级蚕茧，粉碎清洗，然后加入碳酸钠溶液沸煮2～3h后，37℃烘干，再加入氯化钙、无水乙醇和水组成的混合盐液，水浴加热至丝素全部溶解，过滤取上清，再经透析、离心和冷冻干燥，即得到丝素蛋白。

作为优选的，所述蚕茧与碳酸钠溶液的质量体积比为1g:20mL～30mL。

作为优选的，所述混合盐液中氯化钙、无水乙醇和水的摩尔比为1:2:6～10。

本发明的另一个目的，还在于提供了一种上述复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜的制备方法，包括以下步骤：

1)将聚乙烯醇和羧甲基纤维素钠混匀得到聚乙烯醇-羧甲基纤维素钠溶液；

2)将丝素蛋白溶液溶于脱细胞骨膜基质溶液中，然后加入步骤1)得到的聚乙烯醇-羧甲基纤维素溶液中，再加入交联剂，混合均匀得到复合凝胶体系；

3)将步骤2)得到的复合凝胶体系注入自制模具中，经冷冻干燥后，即得到所述人工骨膜。

作为优选的，所述交联剂为25wt％戊二醛或5wt％京尼平。

本发明的另一个目的在于，还提供了上述人工骨膜或上述方法制备的人工骨膜在骨组织再生修复中的应用。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明提供的人工骨膜采用聚乙烯醇/羧甲基纤维素钠作为凝胶基底材料，通过添加丝素蛋白和脱细胞骨膜基质水凝胶，形成结构均一的凝胶薄膜材料。本发明通过向聚乙烯醇中掺入羧甲基纤维素钠改善了聚乙烯醇薄膜的物理特性，使得该基底薄膜组装的人工骨膜具有良好的力学性能、保水性能好、成膜后形状稳定、分散均匀的优点。丝素蛋白和脱细胞骨膜基质是天然的生物材料，具有良好的生物相容性，其可以为成骨细胞和骨原细胞提供了良好的生物微环境，利于成骨细胞和骨原细胞的增殖和分化，进而促进新生骨的形成。

2、本发明制备的复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜是以聚乙烯醇和羧甲基纤维素钠共混凝胶形成的薄膜材料作为基体，进一步通过交联剂将丝素蛋白交联到聚乙烯醇/羧甲基纤维素钠水凝胶中，然后将脱细胞骨膜基质混匀到已获得的水凝胶溶液中，经冷冻干燥处理后得到。该丝素蛋白/骨膜基质/聚乙烯醇-羧甲基纤维素钠人工骨膜无抗原性，具有较好的生物相容性。还为细胞提供类似于细胞外基质的高度水化的3D网络结构和粗糙表面，有利于细胞的粘附和生长，利于成骨细胞和骨原细胞的增殖和分化，可以促进新的骨的形成。且本发明制备的人工骨膜接近天然骨膜物理和生物特性，不仅有着天然的骨相似的结构，在力学上还有着相似的性能，而且具有良好的抗溶血和抗凝血作用，这是一种非常有潜力的柔软组织修复地理想材料。

3、本发明提供的人工骨膜是以不同浓度配比丝素蛋白/脱细胞的骨膜基质与聚乙烯醇-羧甲基纤维素钠凝胶基底相复合，在复合过程中，各材料之间都存在着相互反应及化学键的断裂重组，而不是简单地物理混合。本发明制备方法简单且成本较低，易于操作和控制，在骨组织工程领域具有十分广泛的应用前景。

附图说明

图1为本发明制备的人工骨膜的照片，A为对比例1，B为实施例1，C为实施例2。

图2为本发明制备的人工骨膜的力学性能图；A为应力曲线；B为杨氏模量。

图3为本发明制备的人工骨膜的溶血性(A)和凝血性(B)。

图4为本发明制备的人工骨膜的红外光谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中所用试剂未特别说明均市售可得。

实施例1

1、一种复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜，采用以下方法制得：

1)选取中等级蚕茧，粉碎清洗，按1g:25mL加入碳酸钠溶液(0.4％g/mL)沸煮2.5h，沸煮结束后用沸水洗三次，再将丝素样品用抽滤机抽干，放入烘干箱中37℃烘干。配制氯化钙/无水乙醇/水(摩尔比为1:2:8)混合盐液，80℃水浴加热30min，至丝素全部溶解。过滤取上清，将丝素溶液灌入透析袋(分子量8000-14000)中，用双蒸水透析三天，每12h换一次双蒸水。透析完成后，离心取上清液，即得到丝素蛋白溶液。冷冻干燥，保存在4℃环境下备用。

2)从健康大鼠中取其骨膜，再将其浸浴于浓度为3％(m/v)的Triton X-100溶液(需用0.22μm的滤膜过滤除菌)中，以50r/min的速度震荡12h，每隔4h换一次水；12h后用蒸馏水清洗骨膜2-3次后再置于3％(m/v)的Triton X-100溶液中震荡12h；再将所述骨膜用甲醇进行脱脂处理24h(期间更换甲醇溶液2次)，然后使用浓度为2μL/mL(v/v)的DNA酶稀释液在37℃处理所述骨膜2h。最后依次用无水乙醇和水清洗、干燥，即得到脱细胞的骨膜。再用磷酸缓冲盐将所得的脱细胞骨膜进行多次洗涤，将脱细胞骨膜剪成小块并进行冻干，然后将其研磨成粉末，并溶于0.5M乙酸溶液中，加入浓度为10mg/mL胃蛋白酶溶液，置于37℃消化48h，过滤掉残余物，将消化后的溶液用预冷的10M NaOH调节pH至7.4，得到脱细胞骨膜基质溶液，呈乳白色透明凝胶。

3)将聚乙烯醇和羧甲基纤维素钠按照5:3的质量比进行混合，得到聚乙烯醇-羧甲基纤维素钠溶液。

4)将丝素蛋白溶解于脱细胞骨膜基质凝胶中，不断搅拌，混合均匀。然后加入步骤3)中的聚乙烯醇-羧甲基纤维素钠溶液，使用玻璃棒搅拌均匀，得到混合溶液。然后向所述混合溶液中加入20μL25wt％戊二醛，用玻璃棒搅拌均匀得到凝胶复合体系，其中，丝素蛋白浓度为1mg/mL，脱细胞骨膜基质浓度为1.25mg/mL。将所述凝胶复合体系快速倒入到24孔板中(缓慢加入，保证没有气泡，形状均匀)，放置在-20℃条件下2h，再放置在37℃烘箱中以合适的速度挥发使液相转变为固相，形成结构均一有一定形状厚度的凝胶薄膜材料即人工骨膜。最后通过紫外放射消毒后，将其无菌密封后干燥保存。

2、实施例2～3、对比例1与实施例1的操作步骤相同，仅凝胶复合体系中丝素蛋白浓度和脱细胞骨膜基质浓度不同，具体见表1所示。

表1

二、性能检测

1、将实施例1～2和对比例1得到的人工骨膜材料进行观察，结果如图1所示。

从图中可以看出，本发明所制备的人工骨膜厚度均在10～100μm，由于丝素蛋白的掺入，该人工骨膜略有淡黄色显现。对比例1制备的人工骨膜表面光滑，与之相比，本发明实施例中随着脱细胞骨膜基质的添加量不断增加，使得制备的人工骨膜表面愈加粗糙，移植物表面粗化可增加移植物骨界面的物理学特性。在较差的骨质和骨量区，粗糙表面的移植物较之光滑表面的移植物取得了更高的骨接触百分比，而界面的骨移植物接触百分比是影响骨结合强度的关键因素之一。此外，移植物表面粗糙度的增加可增加种植体表面积和潜在的骨生长进入种植体表面的机械锁结力。粗糙面的沟嵴形态可对组织起引导作用，如阻止上皮向下生长及引导骨在移植物特定区域形成。增加表面粗糙度也增加了种植体材料的湿润度，而湿润度影响沉积在种植体表面的蛋白质的构形和构象，促进细胞早期黏附。

2、使用长春机械科学研究院有限公司的微机控制力学试验机(DNS20型)对实施例1～2和对比例1得到的三组支架进行力学性能检测，结果如图2所示。

从图中可以看出，对比例1和实施例1～2制得的人工骨膜材料的平均压缩杨氏模量分别为218.31±2.85MPa、51.31±5.45MPa和41.94±1.12Mpa(正常骨膜杨氏模量约为33Mpa)，这说明了添加脱细胞骨膜基质能够有效的改善人工骨膜的力学特性，使其与正常骨膜的杨氏模量相差不大，为骨细胞的生长提供合适的微环境。相反，过高的杨氏模量往往会引起应力遮挡，影响骨组织长入和人工骨膜-骨界面整合。

3、对对比例1和实施例1～2制备的三组人工骨膜进行常规的溶血性和凝血性测定，结果如图3所示。

从图3A中可以看出，随着脱细胞骨膜基质的增加后，人工骨膜的溶血率大大降低，表明通过加入脱细胞骨膜基质可以极大地缓解人工骨膜与红细胞接触时造成的副作用。凝血性测定可以看出(图3B)，所制备的SF/PEM人工骨膜的凝血指数随着脱细胞骨膜基质凝胶的浓度的增加而降低，表明该人工骨膜通过加入适量的脱细胞骨膜基质具有更好的抗凝血能力。

4、利用美国Perkin Elmer公司的傅立叶变换红外光谱仪对实施例1～2和对比例1制得的人工骨膜材料进行红外光谱分析，结果如图4所示。

从图中可以明显看出，在波长为3292cm^-1的地方有5组都存在明显的吸收峰，为氢键结合的-OH吸收所致；在2936cm^-1处出现C-H吸收峰，在1637cm^-1处出现酰胺I(C＝O)吸收峰。可见，本发明的人工骨膜有新的吸收峰产生(PEM：脱细胞骨膜基质，SF：丝素蛋白，CMC-Na：羧甲基纤维钠，PVA：聚乙烯醇)，这说明人工骨膜材料在复合过程中每种材料之间都存在着相互反应及化学键的断裂重组，而不是简单的物理混合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜，其特征在于，所述人工骨膜以聚乙烯醇和羧甲基纤维素钠共混的水凝胶形成的薄膜材料作为基体，所述的水凝胶中交联有丝素蛋白，且所述水凝胶中还均匀分散有脱细胞骨膜基质。

2.根据权利要求1所述复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜，其特征在于，所述人工骨膜的厚度为20μm～1000μm，孔隙率为30％～80％。

3.根据权利要求1所述复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜，其特征在于，所述丝素蛋白、脱细胞骨膜基质、聚乙烯醇和羧甲基纤维钠的质量比为1～3:1～5:1～5:1～3。

4.根据权利要求1所述复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜，其特征在于，所述丝素蛋白采用以下步骤制得：选取中等级蚕茧，粉碎清洗，然后加入碳酸钠溶液沸煮2～3h后，37℃烘干，再加入氯化钙、无水乙醇和水组成的混合盐液，水浴加热至丝素全部溶解，过滤取上清，再经透析、离心和冷冻干燥，即得到丝素蛋白。

5.根据权利要求4所述复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜，其特征在于，所述蚕茧与碳酸钠溶液的质量体积比为1g:20mL～30mL。

6.根据权利要求4所述复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜，其特征在于，所述混合盐液中氯化钙、无水乙醇和水的摩尔比为1:2:6～10。

7.一种如权利要求1～6任一项所述复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将聚乙烯醇和羧甲基纤维素钠混匀得到聚乙烯醇-羧甲基纤维素钠溶液；

2)将丝素蛋白溶液溶于脱细胞骨膜基质溶液中，然后加入步骤1)得到的聚乙烯醇-羧甲基纤维素溶液中，再加入交联剂，混合均匀得到复合凝胶体系；

3)将步骤2)得到的复合凝胶体系注入自制模具中，经冷冻干燥后，即得到所述人工骨膜。

8.根据权利要求7所述复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜的制备方法，其特征在于，所述脱细胞骨膜基质溶液的pH值为7.0～7.5。

9.根据权利要求7所述复合脱细胞骨膜基质的人工骨膜的制备方法，其特征在于，所述交联剂为戊二醛或京尼平。

10.如权利要求1～6任一项所述人工骨膜或权利要求8～9任一项所述方法制备的人工骨膜在骨组织再生修复中的应用。

Images