CN115737905A - 一种负载纳米二氧化硅的人工骨膜及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种负载纳米二氧化硅的人工骨膜及其制备方法和应用，所述人工骨膜以聚已内酯与明胶复合后形成的水凝胶网络薄膜为基体，所述水凝胶网络的间隙中负载有纳米二氧化硅。本发明制备出的复合骨膜接近天然骨膜物理和生物特性，不仅有着天然的骨相似的结构，为细胞提供类似于细胞外基质的高度水化的3D网络结构和粗糙表面，有利于细胞的粘附和生长；而且在力学上还有着相似的性能，为骨细胞的生长提供合适的微环境，实现了诱导骨成分再生和结构再建，帮助损伤部位骨组织修复和功能稳定再建。与静电纺丝法相比，本发明方法简便，易于操作，不需要昂贵仪器，制备成本较低，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程材料技术领域，特别的涉及一种掺杂纳米二氧化硅颗粒的人工骨膜及其制备方法和应用。
背景技术
骨缺损是骨科临床的常见疾病，可由创伤、感染及肿瘤等多种因素引起，是骨科治疗的难题之一。目前，临床常用的治疗方法是骨移植，即利用骨支架填充骨缺损，并诱导骨再生。但骨支架植入后，其修复过程基本是一种被动的连接和填充过程，缺少对缺损环境的主动感知。部分支架虽辅以外源性细胞因子，能够起到一定的促进血管新生及骨再生的作用，但仍旧难以模拟体内骨重建过程，因而没有获得令人满意的治疗效果。
骨膜是被包裹在除关节以外几乎所有皮质骨外的高度血管化的致密结缔组织膜。天然骨膜由两部分构成，外层是富含丰富血管神经和胶原纤维的纤维层。纤维层主要包括胶原纤维，成纤维细胞以及微血管，其中胶原蛋白和其他细胞外基质纤维影响着整个骨膜的韧性，丰富的毛细血管网络为骨皮质提供了70-80％的血液供应；内层是富含成骨细胞具有促骨生长作用的形成层，这一层在增加身体早期生长过程中骨骼的直径和长度方面起着至关重要的作用。总的来说，骨膜作为祖细胞的储存库，通过旁分泌信号招募宿主细胞并刺激血管生成和骨生成。与单独骨支架移植相比，骨膜的移植能够在缺损部位富集更多细胞更密集的血管网络。并且骨膜还起到重要的屏障作用，减少感染发生，为骨修复提供良好的微环境。而自体骨膜移植面区坏死的问题，异体骨膜移植又存在免疫排斥反应。为了克服这些局限性，人工骨膜成为一种使受损骨组织再生的关键策略。
为了使骨修复材料与生物体的匹配性，以期植入生物材料的高度仿生是骨组织工程研究和临床应用的新策略。如发明专利CN114028619A公开了一种双层人工骨膜及其制备方法和应用，所述双层人工骨膜包括：致密层和疏松层，所述致密层的制备材料为丝素蛋白；所述疏松层贴合于所述致密层一表面，所述疏松层的制备材料为硒掺杂羟基磷灰石和I型胶原蛋白的复合材料；所述应用中，所述致密层朝向软组织，所述疏松层朝向所述骨损伤部位。发明专利CN111265722B公开了一种用于糖尿病骨修复的双层结构骨膜及其制备方法，其内层为壳聚糖/聚乙烯醇/毛蕊异黄酮经一定比例共混的多孔结构海绵状纳米纤维层，外层为聚对二氧环已酮纳米纤维层，经静电纺丝工艺复合制备而成。上述方法的双层骨膜仅在结构上接近天然骨膜，起到隔绝微生物入侵和隔绝非成骨细胞向缺损区域迁移的屏障作用，但成骨能力不足，且双层膜工艺较为复杂，两层膜之间存在粘连不牢的问题。另外现有人工骨膜尽管可以调整复合骨膜结构和组成来改变其机械性能，但可实现的刚度和韧性范围仍然有限，而过高或过低的杨氏模量会影响骨组织长入和人工骨膜-骨界面整合。因此，制备出兼具天然骨膜在骨缺损中良好的成骨能力和与之匹配的机械性能仍具有很大的挑战。
聚已内酯具有可降解性、无毒性、良好的机械性能，因此它已被用于修复各种组织缺陷。但聚已内酯通常存在较长的降解时期，并且具有疏水性，影响其对细胞的粘附增殖分化。明胶是胶原部分水解而得到的一类蛋白质，明胶与骨膜中胶原具有同源性，具有较好的生物相容性。明胶的分子结构上有大量的羟基，另外还有许多羧基和氨基，使得明胶具有极强的亲水性和反应活性，利于细胞在表面粘附和增殖。此外，胶原的降解对周围组织无不利影响。然而，胶原的特点是机械强度差，降解速度和组织再生速率难以匹配，因此限制了其使用。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明的目的在于提供了一种负载纳米二氧化硅的人工骨膜及其制备方法和应用，解决目前人工骨膜成骨能力不足以及与天然骨膜力学性能不匹配等问题。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种负载纳米二氧化硅的人工骨膜，所述人工骨膜以聚已内酯与明胶复合后形成的水凝胶网络薄膜为基体，所述水凝胶网络的间隙中负载有纳米二氧化硅；所述纳米二氧化硅的粒径为10nm～50nm。其中，聚已内酯与明胶复合后能形成稳定的水凝胶网络，由于纳米二氧化硅颗粒非常小，经过混合后，可以存在于水凝胶网络间的空隙，不易析出，负载牢靠，解决了纳米二氧化硅在聚合物基质中聚集及其与聚合物的相互作用难以控制的问题。本发明骨膜中的纳米二氧化硅不仅增强其力学性能，更重要的是，还使其具有较好的成骨能力。这是由于硅是与结缔组织发育和骨代谢相关过程所需的必需微量元素，有助于在成骨分化中促进骨基质沉积和矿化以及募集间充质干细胞。二氧化硅具有和羟基磷灰石相似的骨诱导能力，还可以解决羟基磷灰石与胶原复合支架的可再吸收性和脆性相关的问题。二氧化硅形成的水合二氧化硅为磷灰石的成核提供了有利的场所，具有磷灰石形成能力，有利于硬组织形成和矿化，所以具有较好的成骨能力。而纳米二氧化硅和传统的二氧化硅相比，纳米二氧化硅与聚已内酯、明胶相互作用后，使得人工骨膜具有复杂表面形貌和分级多孔结构，模拟骨膜细胞外基质中独特的微环境，提供各种结构、力学和生物线索，有助于间充质干细胞的存活、增殖和正确分化。此外，大多数含硅无机物被复合材料包裹，严重限制了硅离子的充分释放及其与周围细胞的直接相互作用。
作为优选的，所述聚已内酯、明胶和纳米二氧化硅的质量比为1～8:1～15:1～5。
作为优选的，所述人工骨膜的厚度为100μm～500μm。
本发明的另一个目的还在于，提供了上述负载纳米二氧化硅的人工骨膜的制备方法，包括以下步骤：
1)将明胶置于冰乙酸水溶液中加热搅拌至呈凝胶状得到明胶溶液；将聚已内酯置于冰乙酸中加热搅拌至呈凝胶状得到聚已内酯溶液；
2)将步骤1)中的明胶溶液与聚已内酯溶液混合后加热，搅拌均匀，再加入丙三醇继续搅拌得到混合溶液，然后依次加入纳米二氧化硅颗粒和交联剂搅拌均匀得到复合凝胶体系；这样，通过加入丙三醇，可以降低明胶的玻璃态转变温度，降低膜的脆性及改善韧性等性能。
3)将步骤2)得到的复合凝胶体系浇筑在模具中，经烘干成形后，即得到所述人工骨膜。
作为优选的，步骤1)所述冰乙酸水溶液中冰乙酸和水的体积比为4～1:1。
作为优选的，步骤1)和步骤2)中所述加热的温度为60℃～70℃。
作为优选的，所述明胶溶液与聚已内酯溶液体积比为5～1:1～5。
作为优选的，所述复合凝胶体系中纳米二氧化硅颗粒浓度为2.4～14.4mg/ml。
作为优选的，所述交联剂为戊二醛或京尼平；所述丙三醇与混合溶液的体积比为1～6:25。
本发明的另一个目的还在于，提供了上述人工骨膜或上述方法制备的人工骨膜在制备骨组织再生修复材料中的应用。
相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供的人工骨膜通过将聚已内酯与明胶复合，改善了明胶和聚已内酯原有缺点，使得该基体薄膜组成的人工骨膜不仅具有较好的生物相容性和良好的机械性能，还可支持细胞在表面粘附和增殖。再通过加入丙三醇，降低明胶的玻璃态转变温度，降低膜的脆性及改善韧性等性能。进一步，在水凝胶网络的间隙中负载纳米二氧化硅，不仅进一步增强了人工骨膜的力学性能，使其获得具有类似天然骨膜的力学。更重要的是，与聚已内酯、明胶相互作用使得人工骨膜具有复杂表面形貌和分级多孔结构，模拟骨膜细胞外基质中独特的微环境，利于成骨细胞和骨原细胞的增殖和分化，进而促进新生骨的形成。与大多数含硅无机物复合材料相比，纳米二氧化硅能让硅离子充分释放并与周围细胞的直接相互作用，具有更强的成骨能力。
2、本发明提供的人工骨膜两种材料共混改性，在复合过程中，各材料之间都存在着相互反应及化学键的断裂重组，而不是简单地物理混合，制备出的复合骨膜接近天然骨膜物理和生物特性，不仅有着天然的骨相似的结构，为细胞提供类似于细胞外基质的高度水化的3D网络结构和粗糙表面，有利于细胞的粘附和生长；而且在力学上还有着相似的性能，为骨细胞的生长提供合适的微环境，实现了诱导骨成分再生和结构再建，帮助损伤部位骨组织修复和功能稳定再建。与静电纺丝法相比，本发明方法简便，易于操作，不需要昂贵仪器，制备成本较低，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的人工骨膜的大体观察图，从右到左依次是实施例1，实施例2，实施例3和对比例1。
图2为本发明制备的人工骨膜的力学性能图；A为应力曲线；B为杨氏模量。
图3为本发明制备的人工骨膜和明胶、聚已内酯的傅里叶红外光谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中所用试剂未特别说明均市售可得。
一、一种负载纳米二氧化硅的人工骨膜的制备方法
实施例1
一种负载纳米二氧化硅的人工骨膜，采用以下方法制得：
1)将600mg明胶加入10ml冰乙酸的水溶液(冰乙酸：水＝8：2)中，并置于60℃的磁力加热搅拌器中搅拌1h，呈凝胶状得到明胶溶液。
2)将3.2g聚己内酯加入20ml冰乙酸中，并置于60℃的水浴锅中水浴加热，使用磁力搅拌器不断搅拌至凝胶呈透明状得到聚己内酯溶液。
3)取10ml步骤1)得到的明胶溶液与2ml步骤2)得到的聚已内酯溶液混合加热60℃，在磁力搅拌器中搅拌30min后，再加入0.5ml丙三醇，继续搅拌30min。
4)向步骤3)得到的溶液依次加入180mg纳米二氧化硅颗粒和10μL戊二醛，搅拌均匀得到复合凝胶体系。
5)将步骤4)得到的复合凝胶体系浇筑在培养皿中，经48h烘干成形后，消毒杀菌，密封保存得到所述人工骨膜。
实施例2～3、对比例1与实施例1的操作步骤相同，仅凝胶复合体系中纳米二氧化硅的添加量不同，具体见表1所示。
表1
二、性能检测
1、将实施例1～3和对比例1得到的人工骨膜材料进行观察，结果如图1所示。
从图中可以看出，本发明所制备的人工骨膜厚度均在100μm～500um，呈淡黄色。对比例1制备的人工骨膜表面光滑，与之相比，本发明制备的人工骨膜具有一定的粗糙度和亲水性，利于细胞的粘附增殖分化。
2、使用长春机械科学研究院有限公司的微机控制力学试验机(DNS20型)对实施例1～3和对比例1得到的三组支架进行力学性能检测，结果如图2所示。
从图中可以看出，对比例1和实施例1～3制得的人工骨膜材料的平均拉伸杨氏模量分别为0.38MPa、0.68MPa、1.58MPa和0.59Mpa，这说明了添加纳米二氧化硅能够有效的改善人工骨膜的力学特性，随着纳米二氧化硅的添加，人工骨膜的力学性能先增加后减小。经统计分析得出，当纳米二氧化硅的添加量在2.4～14.4mg/ml时制备的人工骨膜的杨氏模量与未添加纳米二氧化硅制备的人工骨膜的杨氏模量存在显著的差异，且与天然骨膜的杨氏模量相近，可以认为力学性能接近，为骨细胞的生长提供合适的微环境。相反，过高或过低的杨氏模量往往会引起应力遮挡，影响骨组织长入和人工骨膜-骨界面整合。
3、利用美国Perkin Elmer公司的傅立叶变换红外光谱仪对实施例1、实施例3和对比例1制得的人工骨膜材料进行红外光谱分析，结果如图3所示。
从图中可以明显看出，在3257cm-1处出现的谱带来自于酯键中的羰基伸缩(C＝O)。明胶光谱中出现的2981cm-1处的谱带来自于C-H的伸缩。本发明制备的复合骨膜既含有聚已内酯和明胶的的特征吸收峰，又有新的峰产生(PCL:聚已内酯，SiO2:纳米二氧化硅)，这说明材料在复合过程中每种材料之间都存在着相互反应及化学键的断裂重组，而不是简单的物理混合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不以本发明为限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种负载纳米二氧化硅的人工骨膜，其特征在于，所述人工骨膜以聚已内酯与明胶复合后形成的水凝胶网络薄膜为基体，所述水凝胶网络的间隙中负载有纳米二氧化硅；所述纳米二氧化硅的粒径为10nm～50nm。
2.根据权利要求1所述负载纳米二氧化硅的人工骨膜，其特征在于，所述聚已内酯、明胶和纳米二氧化硅的质量比为1～8:1～15:1～5。
3.根据权利要求1所述负载纳米二氧化硅的人工骨膜，其特征在于，所述人工骨膜的厚度为100μm～500μm。
4.一种如权利要求1～3任一项所述负载纳米二氧化硅的人工骨膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将明胶置于冰乙酸水溶液中加热搅拌至呈凝胶状得到明胶溶液；将聚已内酯置于冰乙酸中加热搅拌至呈凝胶状得到聚已内酯溶液；
2)将步骤1)中的明胶溶液与聚已内酯溶液混合后加热，搅拌均匀，再加入丙三醇继续搅拌得到混合溶液，然后依次加入纳米二氧化硅颗粒和交联剂搅拌均匀得到复合凝胶体系；
3)将步骤2)得到的复合凝胶体系浇筑在模具中，经烘干成形后，即得到所述人工骨膜。
5.根据权利要求4所述负载纳米二氧化硅的人工骨膜的制备方法，其特征在于，步骤1)所述冰乙酸水溶液中冰乙酸和水的体积比为4～1:1。
6.根据权利要求4所述负载纳米二氧化硅的人工骨膜的制备方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中所述加热的温度为60℃～70℃。
7.根据权利要求4所述负载纳米二氧化硅的人工骨膜的制备方法，其特征在于，所述明胶溶液与聚已内酯溶液体积比为5～1:1～5。
8.根据权利要求4所述负载纳米二氧化硅的人工骨膜的制备方法，其特征在于，所述复合凝胶体系中纳米二氧化硅颗粒浓度为2.4～14.4mg/ml。
9.根据权利要求4所述负载纳米二氧化硅的人工骨膜的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述交联剂为戊二醛或京尼平；所述丙三醇与混合溶液的体积比为1～6:25。
10.如权利要求1或2任一项所述人工骨膜或权利要求5～9任一项所述方法制备的人工骨膜在制备骨组织再生修复材料中的应用。
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