CN115105635A - 一种源于海螵蛸的仿生骨膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学技术领域，特别涉及一种源于海螵蛸的仿生骨膜及其制备方法。本发明提供的仿生骨膜由来源于乌贼的未修饰的海螵蛸有机质膜(CDOM)、羧甲基纤维素修饰钠的海螵蛸有机质膜(CDOM‑CMC‑Na)、海藻酸钠的海螵蛸有机质膜(CDOM‑SA)与聚乙烯醇修饰的海螵蛸有机质膜(CDOM‑PVA)和成骨相关水凝胶通过多层组装而得。本发明提供的海螵蛸仿生骨膜材料具有良好的生物相容性和生物活性，体外能有效促进成骨相关细胞的黏附、增殖和成骨分化以及内皮细胞的血管形成，体内结果表明可以促进骨缺损修复。

Description

一种源于海螵蛸的仿生骨膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学技术领域，特别涉及一种源于乌贼骨/海螵蛸的仿生骨膜及其制备方法。
背景技术
创伤、肿瘤及先天性疾病引起的骨损伤通常需要手术修复，骨再生过程中，从骨髓中去除骨祖细胞对骨再生的影响很小，而去除骨膜则会导致新骨形成减少 73％。骨损伤修复过程中，成纤维细胞迁移速率快于骨类细胞，若不加以干预，骨缺损区域会形成纤维囊，阻碍骨修复。而骨膜可以阻止软组织入侵，促进骨类细胞向缺损部位的迁移。因此，骨膜在骨的发育及再生中起到极其重要的作用，骨膜移植也成为骨组织工程中的重要研究对象。
天然骨膜主要包括自体骨膜、同种异体骨膜、动物小肠粘膜、脱细胞真皮等。但是天然骨膜来源及数量有限，自体移植需要承受额外的痛苦和创伤，同种异体骨膜移植又易传播病原体，动物小肠粘膜机械性能不及预期。这些限制因素使得天然骨膜应用受限，仿生骨膜则应运而生。
海螵蛸(Sepiae Endoconcha)来源于乌贼科动物的干燥内壳，即乌贼骨。海螵蛸味咸、涩，性温，归脾、肾经，具有固精止带，收敛止血，制酸止痛，收湿敛疮等功效，现代医学研究认为其具有成骨功效。海螵蛸结构主要分为两部分：背盾及腹部疏松多孔区域。背盾起重要的机械作用；腹部疏松多孔区域又称海绵体，主要由气室叠加而成，气室被墙式结构隔开，隔柱与隔片之间分别由有机基质膜相连接。前人研究发现，使用盐酸刻蚀碳酸钙后，海螵蛸中的有机基质膜即可得以提取。膜表面具有游离羧基，能够与钙等金属离子结合，可能是海螵蛸中碳酸钙的成核位点。与此同时，这些活性位点使得海螵蛸有机质膜被科研工作者们作为无机材料的生长模板得以研究，如Stephen Mann在海螵蛸有机质膜上衍生二氧化硅、钱卫平在该有机质膜上衍生出均匀的金、银纳米颗粒。因此，海螵蛸膜为矿物的有序生长提供了便利的环境。目前，海螵蛸有机质膜还未被应用于仿生骨膜，提取工艺相对原始，改性方法未见报道。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种源于乌贼骨/海螵蛸的仿生骨膜及其制备方法。本发明提供的海螵蛸仿生骨膜材料具有良好的生物相容性和生物活性，体外能有效促进成骨相关细胞的黏附、增殖和成骨分化以及内皮细胞的血管形成，体内结果表明可以促进骨缺损修复。
技术方案，为实现以上目的，本发明采用的技术步骤如下：
本发明将海螵蛸有机质膜和成骨相关水凝胶组装结合，以形成具有单层或多层结构的源于乌贼骨/海螵蛸的仿生骨膜。
一些方案中，所述海螵蛸有机质膜为不同方法提取的海螵蛸有机质膜或其改性衍生物。
本发明还提供了源于乌贼骨/海螵蛸的仿生骨膜的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：以海螵蛸为原料，使用盐酸法、磷酸法和EDTA法等提取海螵蛸有机质膜；
步骤2：使用海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙烯醇等聚合物对海螵蛸有机质膜改性；
步骤3：将成骨相关水凝胶与步骤1、步骤2所述未改性或改性的海螵蛸有机质膜进行单层或多层组装，即得所述源于乌贼骨/海螵蛸的仿生骨膜。
本发明中，在具体实施例及效果实验考察中，步骤1制备的海螵蛸有机质膜，将其命名为CDOM，步骤2制备的海藻酸(SA)、羧甲基纤维素(CMC)或聚乙烯醇(PVA)改性的海螵蛸有机质膜，分别命名为CDOM-SA，CDOM-CMC， CDOM-PVA，本发明所述源于乌贼骨/海螵蛸的仿生骨膜命名为CDBP。
本发明中，步骤1所述海螵蛸有机质膜的提取方法为：
盐酸法：将海螵蛸块与盐酸溶液共混，降低气压并恒温，待碳酸钙全部被刻蚀后即得海螵蛸有机质膜。
磷酸法：将海螵蛸块与磷酸溶液共混，降低气压并恒温，待碳酸钙全部被刻蚀后即得海螵蛸有机质膜。
EDTA法：将海螵蛸块与乙二胺四乙酸二钠(EDTA)溶液共混，降低气压并恒温，待碳酸钙全部被刻蚀后即得海螵蛸有机质膜。
一些实施例中，所述盐酸溶液浓度为0.5～3mol·L-1，所述磷酸溶液浓度为 0.5～3mol·L-1，所述EDTA溶液浓度为0.5～3mol·L-1。
一些实施例中，所述海螵蛸块与盐酸溶液按质量/体积比为1:35～1:100(g mL-1)，所述海螵蛸块与磷酸溶液按质量/体积比为1:35～1:100(g mL-1)，所述海螵蛸块与EDTA溶液按质量/体积比为1:70～1:200(g mL-1)。
一些实施例中，所述气压为0.08～0.095MPa，所述温度为0～50℃。
本发明中，步骤2所述海螵蛸有机质膜的改性方法为：
海藻酸钠与羧甲基纤维素钠：取1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N- 羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS)活化剂分别与羧甲基纤维素钠(CMC-Na)或海藻酸钠(SA)水溶液混匀，并加入缓冲溶液，混匀后恒温孵育30min。将单层海螵蛸有机质膜分别加入上述活化溶液，恒温孵育24h。孵育后超纯水清洗三次，分别得到海藻酸钠改性海螵蛸有机质膜(CDOM-SA)和羧甲基纤维素钠改性海螵蛸有机质膜(CDOM-CMC-Na)；
一些实施例中，所述EDC/NHS活化剂的最终浓度分别为0.01～0.5mol·L-1，所述CMC-Na的最终浓度为0.5～2％，所述SA的最终浓度为0.2～1％，所述缓冲溶液品种为吗啉乙磺酸(MES)缓冲液或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液，所述缓冲液pH为5.0～7.0，所述孵育温度为15～40℃。
聚乙烯醇：取N,N'-羰基二咪唑(CDI)活化剂与PVA水溶液混匀，混匀后恒温孵育30min。将单层海螵蛸有机质膜加入上述活化溶液，恒温孵育24h。孵育完成后超纯水清洗三次，得聚乙烯醇改性海螵蛸有机质膜(CDOM-PVA)。
一些实施例中，所述CDI活化剂的最终浓度分别为0.1～40mol·L-1，所述 PVA的最终浓度为0.5～2％，所述孵育温度为15～40℃。
本发明中，步骤3所述源于乌贼骨/海螵蛸的仿生骨膜的制备方法为：
步骤3.1在无菌环境下，将未改性或改性的海螵蛸有机质膜铺平；
步骤3.2将成骨相关水凝胶涂覆于膜表面；
步骤3.3再次覆盖未改性或改性的海螵蛸有机质膜；
步骤3.4重复3.2和3.3数次。
一些实施方案中，步骤3.1所述无菌环境为生物安全柜或超净台；步骤3.1 所述未改性或改性的海螵蛸有机质膜为CDOM、CDOM-SA、CDOM-CMC和 CDOM-PVA。
一些实施方案中，步骤3.2所述成骨相关水凝胶使用量为0～2g。
一些实施方案中，步骤3.3所述未改性/改性的海螵蛸有机质膜为CDOM、 CDOM-SA、CDOM-CMC和CDOM-PVA。
一些实施方案中，步骤3.4所述重复次数为0～5次。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明将从海螵蛸中提取海螵蛸有机质膜CDOM，制备源于乌贼骨/海螵蛸的仿生骨膜CDBP，可拓展海螵蛸的医疗用途，提高海螵蛸的利用度，减少废弃海螵蛸对环境的污染。所制备的仿生骨膜CDBP具有良好的生物安全性与促成骨活性，具有重要的应用价值。
附图说明
图1示扫描电镜表征海螵蛸有机质膜的表面结构；
图2示海螵蛸有机质膜的亲水性能表征，其中，2-a为水接触角照片，2-b 为水接触角量化结果；
图3示海螵蛸有机质膜的应力-应变曲线；
图4示海螵蛸有机质膜的红外光谱图，其中，4-a为CDOM-CMC的红外表征，4-b为CDOM-PVA的红外表征，4-c为CDOM-SA的红外表征，4-d为CDOM 的红外表征；
图5示FDA/PI染色法考察MC3T3-E1在CDBP表面的存活状态，标尺为 300μm；
图6示CDBP与CDOM对不同细胞的促增殖作用，其中，6-a为对MC3T3-E1 细胞的促增殖作用，6-b为对HUVEC细胞的促增殖作用，6-c为对L929细胞的促增殖作用；
图7示CDBP与CDOM对MC3T3-E1细胞形成钙结节的影响，标尺为150 μm；
图8示术后4周和8周大鼠颅骨缺损恢复情况；
图9示颅骨切片的免疫组化染色表征，其中，9-a为HE染色20×，9-b为 HE染色100×，9-c为Masson染色20×，9-d为Masson染色100×，9-e为CD31 免疫组化染色100×。
具体实施方式
本发明公开了一种源于乌贼骨/海螵蛸的仿生骨膜及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1本发明海螵蛸仿生骨膜CDBP的制备
步骤1：海螵蛸有机质膜CDOM的提取，包括以下步骤：
取0.08g的海螵蛸小块数个，与3mL浓度为2mol·L-1磷酸反应，压力维持在0.09MPa，30℃，待碳酸钙全部被刻蚀后即得海螵蛸有机质膜，记为 CDOM-H3PO4。
步骤2：使用海藻酸钠(SA)对海螵蛸有机质膜改性，包括以下步骤：
取1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS) 活化剂分别与海藻酸钠(SA)水溶液混匀，并加入吗啉乙磺酸(MES)缓冲液定容至40mL，使活化剂EDC/NHS终浓度为0.2mol·L-1，海藻酸钠(SA)溶液终浓度分别为0.5％，37℃孵育30min，得到活化海藻酸钠SA溶液。
将步骤1的单层CDOM-H3PO4放入直径为5.5mm的培养皿中，加入10mL 活化海藻酸钠SA溶液，37℃孵育24h。孵育完成后超纯水清洗三次，记为 CDOM-SA。
步骤3：将成骨相关水凝胶(保赫曼Hydrosorb Gel德湿洁水凝胶敷料)与 CDOM-SA进行多层组装制备CDBP，包括以下步骤：
在超净台中，将CDOM-SA铺平于培养皿中，将0.1g成骨相关水凝胶涂覆于膜表面，并再次覆盖CDOM-SA，即得仿生骨膜CDBP。
实施例2本发明海螵蛸仿生骨膜CDBP的制备
步骤1：海螵蛸有机质膜CDOM的提取，包括以下步骤：
取0.08g的海螵蛸小块数个，与3mL浓度为2mol·L-1盐酸反应，压力维持在0.09MPa，30℃，待碳酸钙全部被刻蚀后即得海螵蛸有机质膜，记为 CDOM-HCl。
步骤2：使用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)对海螵蛸有机质膜改性，包括以下步骤：
取1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺(EDC/NHS) 活化剂分别与羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液混匀，并加入吗啉乙磺酸(MES) 缓冲液定容至40mL，使活化剂EDC/NHS终浓度为0.2mol·L-1，羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液终浓度分别为1％，37℃孵育30min，得到活化羧甲基纤维素钠溶液。
将步骤1的单层CDOM-HCl放入直径为5.5mm的培养皿中，加入10mL 活化羧甲基纤维素钠溶液，37℃孵育24h。孵育完成后超纯水清洗三次，记为 CDOM-CMC-Na。
步骤3：将成骨相关水凝胶(保赫曼Hydrosorb Gel德湿洁水凝胶敷料)与CDOM-CMC-Na进行多层组装制备CDBP，包括以下步骤：
在超净台中，将CDOM-CMC-Na铺平于培养皿中，将0.1g成骨相关水凝胶涂覆于膜表面，并再次覆盖CDOM-CMC-Na，即得仿生骨膜CDBP。
实施例3本发明海螵蛸仿生骨膜CDBP的制备
步骤1：海螵蛸有机质膜CDOM的提取，包括以下步骤：
取0.08g的海螵蛸小块数个，与6mL浓度为2mol·L-1EDTA反应，压力维持在0.09MPa，30℃，待碳酸钙全部被刻蚀后即得海螵蛸有机质膜，记为 CDOM-EDTA。
步骤2：使用聚乙烯醇(PVA)对海螵蛸有机质膜改性，包括以下步骤：
聚乙烯醇改性方法为：取N,N'-羰基二咪唑(CDI)活化剂与聚乙烯醇水溶液混匀，所述CDI活化剂的最终浓度分别为10mol·L-1，所述PVA的最终浓度为1％，混匀后37℃恒温孵育30min，得到活化聚乙烯醇溶液；
将步骤1的单层CDOM-EDTA放入直径为5.5mm的培养皿中，加入10mL 活化聚乙烯醇溶液，37℃孵育24h。孵育完成后超纯水清洗三次，记为 CDOM-PVA。
步骤3：将成骨相关水凝胶(保赫曼Hydrosorb Gel德湿洁水凝胶敷料)与 CDOM-PVA进行多层组装制备CDBP，包括以下步骤：
在超净台中，将CDOM-PVA铺平于培养皿中，将0.1g成骨相关水凝胶涂覆于膜表面，并再次覆盖CDOM-PVA，即得仿生骨膜CDBP。
实施例4理化性能测验
1、测试对象：实施例1、实施例2和实施例3分别制备得到的CDOM-H3PO4、 CDOM-EDTA、CDOM-HCl和CDBP。
2、扫描电镜
将海螵蛸有机质膜经过冷冻干燥和脆断处理后，表面喷金。调节扫描电镜仪器参数，高电压(HV)为“15.00kV”，探头(DET)为“高真空二次电子成像图模式(ETD)”，放大倍数分别为“1000、5000、50000”，观察膜表面结构并拍摄照片，结果见图1。
3、水接触角测试
将海螵蛸有机质膜冷冻干燥后，平整地固定在接触角测量仪样品台上，滴落 16μL水滴至膜表面，待液滴稳定后使用接触角测量仪拍摄照片并量取水滴角度，结果见图2。
4、机械性能表征
分别将海螵蛸有机质膜的上下两端夹在万能拉力测试机上，记录膜的初始长、宽及厚度。调节仪器参数，测试方向为“拉伸”，控制模式为“定速度”，拉伸速度为“50mm/min”。测试完成后，计算得到膜的应力-应变曲线，结果见图 3。
5、红外表征
将海螵蛸有机质膜冷冻干燥后，取少量样品置于傅立叶红外光谱仪的金刚石 ATR模块中并压紧，调节参数，检测器“DTGS”，波数范围“4000～500cm-1”，扫描次数32，分辨率4cm-1，检测膜的红外光谱以表征其官能团，结果见图4。
由图1可知，CDOM正面有条纹状凸起，形成沟壑纹路结构，同时非凸起区域较光滑致密。海螵蛸腹侧的海绵体结构主要包括隔柱与隔片，隔柱对上下的隔片起支撑作用，且隔柱与隔片构造相似，即中心为碳酸钙，外侧包围一层有机质。隔柱与隔片中的碳酸钙被刻蚀掉后共同形成了海螵蛸有机质膜，而膜上的纹路正来源于隔柱外侧的有机质。CDOM的背面有纤维状成分，构成不规则网格状结构，有散在气孔，尤其在图1中CDOM-EDTA的背面图(比例尺3μm)中可观察的更清晰。
由图2可知，海螵蛸有机质膜的水接触角范围主要在40.11～98.08°之间。其中，CDOM-EDTA的接触角整体偏大，CDOM-HCl亲水侧的接触角在三种膜间最小，可达40.11°。此外，CDOM-HCl亲疏水测的接触角相差最大，疏水测的接触角为98.08°，是亲水侧的2.45倍。综合以上，CDOM在干燥条件下亲水性整体较好。而在润湿状态下，CDOM可充分吸水膨胀，极其有利于细胞的贴附和生长。
由图3可知，CDOM-EDTA与CDOM-H3PO4的机械性能相近，最大应力在 2.5～3MPa左右，对应的应变在6％左右。而CDOM-HCl的机械性能则明显较强，最大应力在4.68MPa，对应的应变在8.20％。
由图4-d可知，三种CDOM的红外光谱峰型基本一致，说明其在官能团组成上基本相同。其中，-OH(醇)的基频在3274cm-1左右，一般-OH(醇)的峰型尖锐，但由于壳聚糖分子内存在大量氢键，在其影响下，-OH(醇)变为-OH 伸缩振动吸收峰与-NH的伸缩振动吸收峰，二者重叠使峰增宽。2933cm-1处为 -C-H的伸缩振动吸收峰，1633cm-1与1533cm-1处为-NH2的变形振动吸收峰。1373cm-1处为-C-H-的弯曲振动吸收峰，其左侧小峰1432cm-1处为＝CH2的变形振动吸收峰。1305cm-1处为酰胺中的-C-N-伸缩振动吸收峰。1156cm-1处为环上 -C-O吸收峰，1027cm-1处为-OH(醇)的变角振动吸收峰。在900cm-1处为β- 糖苷键的特征吸收峰，证明海螵蛸有机质膜中壳聚糖成分为β型。由图4-a～4-c 可知，CMC-Na、PVA与SA分别接枝与CDOM表面。
综上所述，CDOM具有合适的表面形态、亲水性能以及机械性能，是制备 CDBP的良好基质材料。
实施例5 CDBP体外性能测验
1、细胞活死染色
将实施例1制备得到的CDBP用α-MEM完全培养基预孵1h，并平整地贴于玻璃底细胞培养皿(直径20mm)底部，将小鼠前成骨细胞MC3T3-E1以1×105个/孔的密度种板，培养1、3、5d后进行染色，结果见图5。
2、CDBP促增殖作用
将小鼠前成骨细胞MC3T3-E1、人脐静脉内皮细胞HUVEC、小鼠成纤维细胞L929以1×103个/孔的密度种于实施例1制备得到的CDBP上。分别培养1.5、 3、5d后，吸除培养板内培养基，并在避光条件下向孔中加入配制好的CCK-8 反应液，37℃孵育1.5h后在450nm下检测OD值，结果见图6。
3、CDBP促成骨分化效应
将小鼠前成骨细胞MC3T3-E1以2×104个/孔的密度种于6孔板、实施例1 制备得到的CDOM与CDBP上，待细胞融合度达到60％后将培养基更换为成骨诱导培养基。每三天换液一次(半量换液)，诱导21d后对钙结节进行茜素红染色。吸除孔内培养基，用超纯水清洗1-2次，加入固定液1mL/孔，固定20min 后用超纯水清洗2次，加入茜素红染液1mL/孔，室温染色30min。用超纯水将多余的染液洗净，显微镜下拍照，结果见图7。
由图5可知，CDBP上可观察到MC3T3-E1细胞触角呈明显的伪足状，充分向四周伸展，细胞形态良好，且贴附较为牢固。细胞总体生长状况良好，且凋亡细胞数量很少，说明CDBP具有良好的生物相容性。CDBP上细胞数量随着时间增加而增多，说明CDBP具有促进MC3T3-E1细胞增殖效应。
由图6可知，CDBP在第1.5天时对MC3T3-E1及HUVEC均有明显的促增殖作用，此作用对MC3T3-E1可以持续到第3天；CDBP对L929无毒性也无促增殖作用。CDBP在在第5天时均无明显促增殖作用，为细胞已铺满孔底，生长空间受限所致。
由图7可知，CDBP组钙结节更为明显，CDOM组则相对较小，而空白组则无明显钙结节形成。此实验证明CDBP不仅可以促进MC3T3-E1细胞的成骨分化，且可促进其分化后功能成熟并形成利于新骨形成的钙结节，在细胞层面证明了海螵蛸有机质膜利于骨缺损的修复。
综上所述，CDBP相比CDOM具有更好的生物相容性与体外促成骨分化效应。
实施例6 CDBP体内效应评价
1、大鼠颅骨缺损模型用于CDBP促成骨效应评价
大鼠采用异氟烷麻醉，沿头盖骨正中，眼后至耳前区在头皮上作1.5～2.0cm 的矢状切口，分离软组织，5mL注射器吸取生理盐水插入骨膜与颅顶骨之间，剥离骨膜，用电动环钻在鼠颅骨的左侧造成直径4.5mm的骨全层缺损，待术区骨片松动后，将松动的骨片提出。将已灭菌处理的实施例1制备得到的CDOM、 CDBP覆盖在颅骨缺损处，采用4-0的带线缝合针缝合，软组织层层复位。空白组钻孔造成颅骨与骨膜缺损后不做其他处理，直接缝合。
2、micro-CT影像学分析
4周与8周后取大鼠颅骨标本进行Micro-CT扫描，将颅骨平稳固定在鼠床后，调节仪器参数为：电流382μA，电压65kV，分辨率9μm，扫描结束后对图像进行重构。分别用软件DataViewer调整CT图中颅骨位置，CTvox处理得到 3D图，结果见图8。
3、HE染色、Masson染色及CD31免疫组化染色
将颅骨放入10％EDTA-2Na溶液中脱钙20天，然后将颅骨放入70％、80％、 90％、95％以及100％乙醇溶液中梯度脱水，使用二甲苯溶液浸泡颅骨至透明，并对样本进行石蜡包埋。以5μm厚度切片，并依次使用二甲苯及无水乙醇将切片脱蜡，分别进行HE染色、Masson染色及CD31免疫组化染色，结果见图9。
由图8可知，第4周时，空白组与CDOM组均有部分新骨形成，空白组仅围绕缺损区由边缘向内形成了少量新骨，而CDBP组的新骨则已将缺损区覆盖近1/2。到第8周时，各组均比4周时有更多新骨形成，空白组的缺损区修复近 1/2，而CDBP组则几乎已被新骨全部覆盖。观察右侧纵切图可知，8周时，CDBP 组的新骨与正常骨组织相比整体略薄，少量靠近缺损区边缘的位置厚度已与正常骨组织相近，空白组则仍有大段缺损。这说明CDBP可以促进体内新骨形成，缩短骨修复进程。
由图9-a～9-d可知，各组新生骨组织均由缺损区边缘向中心生长。空白组4 周时已形成部分新骨，但新骨中仍有大量纤维组织残留，骨密度较低。而CDBP 组4周时的新骨中纤维组织明显较少，骨质更致密，且骨缺损区域的总长度相对缩短。到第8周时，空白组的缺损区减少，但仍有大段缺损，两侧新骨并未连接，且新骨厚度较薄，并掺杂较多纤维组织。而CDBP组8周时新骨已明显将缺损区域连接起来，纤维组织更少，骨质更致密，且可观察到骨化中心存在。在骨的发育过程中，最先开始形成新骨的部位称为骨化中心。在骨化中心内部，间充质细胞大量增殖，并分化为骨祖细胞、成骨细胞，从而形成新骨，骨组织以此为中心逐渐增多。骨化中心的存在说明该组仍处于快速形成新骨的阶段。
由图9-e可知，空白4周组仅有少量阳性区域，且面积较小，说明仅有少量小血管形成。而CDBP组4周在纤维组织与新骨内部均有阳性区域存在，数量明显较多，且在纤维组织内部有个别阳性区域面积较大，说明该组在新骨与纤维组织内部均有较多血管形成，且个别血管横截面积更大，可更好地为骨缺损区域提供良好血运。8周时，空白组已有个别大血管形成，血运明显改善，CDBP组由于新生骨组织已大量形成，纤维组织较少，但新骨与纤维组织中仍均存在较多新生血管，且仍有大血管的存在，证明该组仍存在良好血运，对骨缺损修复有积极意义。
综上所述，本发明提供的海螵蛸仿生骨膜CDBP具有显著地促进骨损伤修复的能力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (14)

1.一种源于海螵蛸的仿生骨膜，其特征在于，它由海螵蛸有机质膜与成骨相关水凝胶进行多层组装而成。
2.根据权利要求1所述的源于海螵蛸的仿生骨膜，其特征在于，所述海螵蛸有机质膜包括来源于乌贼的未修饰的海螵蛸有机质膜、羧甲基纤维素修饰钠的海螵蛸有机质膜、海藻酸钠的海螵蛸有机质膜与聚乙烯醇修饰的海螵蛸有机质膜。
3.权利要求1或2所述的源于海螵蛸的仿生骨膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：以海螵蛸为原料，使用盐酸法、磷酸法或EDTA法提取海螵蛸有机质膜；
步骤2：使用海藻酸钠、羧甲基纤维素钠或聚乙烯醇聚合物对海螵蛸有机质膜进行改性；
步骤3：将成骨相关水凝胶与步骤1未改性海螵蛸有机质膜或步骤2改性的海螵蛸有机质膜进行单层或多层组装，即得所述源于海螵蛸的仿生骨膜。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1所述海螵蛸有机质膜的提取方法为：
盐酸法：将海螵蛸块与盐酸溶液共混，降低气压并恒温，待碳酸钙全部被刻蚀后即得海螵蛸有机质膜；
磷酸法：将海螵蛸块与磷酸溶液共混，降低气压并恒温，待碳酸钙全部被刻蚀后即得海螵蛸有机质膜；
EDTA法：将海螵蛸块与乙二胺四乙酸二钠溶液共混，降低气压并恒温，待碳酸钙全部被刻蚀后即得海螵蛸有机质膜。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述盐酸溶液浓度为0.5～3mol·L-1；所述磷酸溶液浓度为0.5～3mol·L-1；所述乙二胺四乙酸二钠溶液浓度为0.5～3mol·L-1。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，以g·mL-1计，所述海螵蛸块与盐酸溶液按质量/体积比为1:35～1:100；所述海螵蛸块与磷酸溶液按质量/体积比为1:35～1:100；所述海螵蛸块与乙二胺四乙酸二钠溶液按质量/体积比为1:70～1:200。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述气压为0.08～0.095MPa，所述温度为0～50℃。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述海螵蛸有机质膜的改性方法为：
海藻酸钠和羧甲基纤维素钠改性方法为：取1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺活化剂分别与羧甲基纤维素钠或海藻酸钠水溶液混匀，并加入缓冲溶液，混匀后恒温孵育30min，得到活化溶液；将单层海螵蛸有机质膜分别加入上述活化溶液，恒温孵育24h；孵育后用超纯水清洗，分别得到海藻酸钠改性海螵蛸有机质膜和羧甲基纤维素钠改性海螵蛸有机质膜；
聚乙烯醇改性方法为：取N,N'-羰基二咪唑活化剂与聚乙烯醇水溶液混匀，混匀后恒温孵育30min，得到活化溶液；将单层海螵蛸有机质膜加入上述活化溶液，恒温孵育24h，孵育完成后超纯水清洗，得聚乙烯醇改性海螵蛸有机质膜。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，海藻酸钠改性海螵蛸有机质膜和羧甲基纤维素钠改性海螵蛸有机质膜的制备中，所述1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺/N-羟基丁二酰亚胺活化剂的最终浓度分别为0.01～0.5mol·L-1；所述羧甲基纤维素钠的最终浓度为0.5～2％；所述海藻酸钠的最终浓度为0.2～1％；所述缓冲溶液为吗啉乙磺酸缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液，所述缓冲液pH为5.0～7.0，所述孵育温度为15～40℃。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，聚乙烯醇改性海螵蛸有机质膜的制备中，所述N,N'-羰基二咪唑活化剂的最终浓度为0.1～40mol·L-1，所述聚乙烯醇的最终浓度为0.5～2％，所述孵育温度为15～40℃。
11.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3所述源于海螵蛸的仿生骨膜的制备方法为：
步骤3.1在无菌环境下，将未改性或改性的海螵蛸有机质膜铺平；
步骤3.2将成骨相关水凝胶涂覆于膜表面；
步骤3.3再次覆盖未改性或改性的海螵蛸有机质膜；
步骤3.4重复3.2和3.3数次。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤3.2所述成骨相关水凝胶使用量为0～2g。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤3.4所述重复次数为0～5次。
14.权利要求3～13任一项所述的制备方法制得的源于海螵蛸的仿生骨膜在制备促进骨缺损修复材料中的应用。
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