CN113564210A - 一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法，涉及甘草内生真菌的应用，尤其涉及一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法。是要解决现有方法生产CBD的产率不高的技术问题。方法：一：取干燥的工业大麻叶，粉碎，过筛，将大麻叶粉末置于容器内，加水，密封，灭菌作为底物；二：将甘草内生真菌RP4接种于PDA的斜面培养基，恒温培养，得到活化后的甘草内生真菌RP4，与无菌水混合，得到菌悬液；三：将菌悬液加入到底物中，置于空气浴摇床中进行发酵培养，即完成工业大麻的发酵。采用甘草内生真菌RP4发酵工业大麻后可以高效生产CBD原料，最大化利用工业大麻资源。此外，经甘草内生真菌RP4发酵后的工业大麻发酵，抗氧化活性显著增强。

Description

一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法
技术领域
本发明涉及甘草内生真菌的应用，尤其涉及一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法。
背景技术
大麻(Cannabis sativa L.)为桑科(Moraceae)大麻属(Cannabis)的一年生草本植物。其中，植物体内THC含量低于0.3％的大麻称为工业大麻。大麻二酚(CBD)作为工业大麻中的非成瘾性成分，是CB1和CB2受体的拮抗剂，不仅可以有效改善THC对机体产生的致幻作用，还以其独特的调节精神作用、治疗精神疾病、抗肿瘤、抗菌等方面的活性，吸引了众多学者的关注，现已逐渐成为食品、药品领域中的热点化合物。
CBD最初提取分离自工业大麻植株，但纯度以及含量较低。此后，随着对CBD需求量的增加，研究学者开始致力于CBD的化学合成，但化学合成的CBD产率不高，而且还有副产物生成。
尽管有多种高CBD、低THC的大麻种子资源，但无论应用传统的提取分离工艺直接从工业大麻植株中进行CBD的分离，还是以化学合成的方法生产CBD原料，其产率依然无法满足需求，是有待解决的关键性问题。
发明内容
本发明是要解决现有方法生产CBD的产率不高的技术问题，提供一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法。
本发明利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法，包括以下步骤：
步骤一：取干燥的工业大麻叶，粉碎，过筛，将大麻叶粉末置于容器内，加水，密封，然后进行高压灭菌处理，灭菌后取出作为底物，其中底物的质量浓度为0.1～0.5g/mL；
步骤二：将甘草内生真菌RP4接种于PDA的斜面培养基，恒温培养，得到活化后的甘草内生真菌RP4，然后将活化后的甘草内生真菌RP4与无菌水混合，得到菌体浓度为1×107CFU·mL-1的菌悬液；
步骤三：将菌悬液加入到底物中，置于空气浴摇床中进行发酵培养，时间为12h～108h，即完成工业大麻的发酵。
步骤二所述甘草内生真菌RP4为枝顶孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2012048，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。并已经于其他专利文件中公开。
本发明还提供所述甘草内生真菌在发酵工业大麻提高大麻二酚含量中的应用。
本发明还提供所述甘草内生真菌在发酵工业大麻提高大麻抗氧化活性中的应用。
本发明的有益效果：
本发明发现了甘草内生真菌RP4的新用途，即可用于作为发酵菌株，发酵工业大麻。
采用甘草内生真菌RP4作为发酵菌株，以该菌株发酵工业大麻后，可定向提高其CBD含量。因此，采用甘草内生真菌RP4发酵工业大麻后可以高效生产CBD原料，最大化利用工业大麻资源。此外，经甘草内生真菌RP4发酵后的工业大麻发酵，其抗氧化活性显著增强，说明工业大麻发酵后有望作为抗氧化剂进行开发利用。
附图说明
图1为CBD和THC HPLC色谱图；
图2为工业大麻发酵前后活性成分的变化曲线色谱图；
图3为工业大麻发酵前后对DPPH自由基的清除能力；
图4为工业大麻发酵前后对DPPH的半数清除率(IC50)。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法，包括以下步骤：
步骤一：取干燥的工业大麻叶，粉碎，过筛，将大麻叶粉末置于容器内，加水，密封，然后进行高压灭菌处理，灭菌后取出作为底物，其中底物的质量浓度为0.1～0.5g/mL；
步骤二：将甘草内生真菌RP4接种于PDA的斜面培养基，恒温培养，得到活化后的甘草内生真菌RP4，然后将活化后的甘草内生真菌RP4与无菌水混合，得到菌体浓度为1×107CFU·mL-1的菌悬液；
步骤三：将菌悬液加入到底物中，置于空气浴摇床中进行发酵培养，时间为12h～108h，即完成工业大麻的发酵。
本实施方式步骤二所述甘草内生真菌RP4为枝顶孢菌(Acremoniumdichromosporum)RP4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M2012048，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。并已经于其他专利文件中公开。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中过筛为过40～80目筛。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一所述高压灭菌处理的条件为121℃，20～60min。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中大麻叶粉末与水的质量比为1:(5～20)。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中恒温培养条件为：28℃，0.5～4.5d。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三空气浴摇床中培养条件为25～37℃，120～150r·min-1。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三的发酵产物进行冻干，作为工业大麻发酵产品。其它与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中菌悬液的体积和底物的质量比为1mL:2g。其它与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式甘草内生真菌在发酵工业大麻提高大麻二酚含量中的应用。所述甘草内生真菌为枝顶孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2012048，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
具体实施方式十：本实施方式甘草内生真菌在发酵工业大麻提高大麻抗氧化活性中的应用。所述甘草内生真菌为枝顶孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2012048，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
本实施例利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法，包括以下步骤：
步骤一：取干燥的工业大麻叶，粉碎，过40目筛。精确称取10g大麻叶粉末，置于100mL的三角瓶内，加水(料液比为1：10)，密封后，进行高压灭菌处理，于121℃，0.1MPa灭菌30min，取出作为底物，底物的质量浓度为0.2g/mL；
步骤二：将甘草内生真菌RP4接种于PDA斜面培养基，28℃恒温培养3d，得到活化后的甘草内生真菌RP4，将活化后的甘草内生真菌RP4与5mL无菌水混合，充分振荡摇匀后，于显微镜下观察计数(采用血球计数板计数法)，稀释为浓度1×107CFU·mL-1的菌悬液，备用；
步骤三：取5mL菌悬液，加入到10g底物中(平行样品10份)，置于空气浴摇床中进行发酵培养，培养温度为28℃，转速为130r·min-1，培养时间为60h，取出，冻干，作为工业大麻发酵样品。
对本实施例制备得到的工业大麻发酵样品进行以下检测，以验证本发明的效果：
(一)HPLC法检测工业大麻发酵前后CBD的含量
HPLC法的色谱条件见表1。
表1色谱条件
Figure BDA0003222276400000041
①对照品溶液的制备：精密称取CBD对照品，采用色谱纯甲醇配成每1mL含0.1mg的对照品溶液，备用。
②供试品溶液的制备：分别精密称取未发酵工业大麻及工业大麻发酵样品1.0g，加入95％乙醇(料液比1：50)，以50℃超声提取40min，过滤，减压浓缩至近干(50℃)，适量蒸馏水溶解，以乙酸乙酯进行萃取3次(3×100mL)，合并萃取液，减压回收(50℃)，残渣以1mL色谱甲醇溶解，作为供试品溶液，备用。
③分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，进行HPLC分析(n＝3)，计算并分析结果。
(二)抗氧化作用检测
采用DPPH法对工业大麻发酵前后的抗氧化活性进行对比分析。
①对照品溶液的制备
精确称取Vc 2mg，加一定量甲醇溶解后定容至20mL，即得100μg·mL-1的对照品液，并按比例依次将其浓度稀释至50μg·mL-1、25μg·mL-1、12.5μg·mL-1、6.25μg·mL-1，备用。
②供试品溶液的制备
分别取工业大麻样品、甘草内生真菌RP4发酵样品各2g，加入95％乙醇(料液比1：50)，以50℃超声提取40min，过滤，减压回收(50℃)，残渣加10mL甲醇溶解，即得200μg·mL-1的供试品液，并按比例依次将其浓度稀释至100μg·mL-1、50μg·mL-1、25μg·mL-1、12.5μg·mL-1、6.25μg·mL-1，备用。
③DPPH溶液的配制：精确称取DPPH 5.9mg，加一定量甲醇溶解后定容至100mL，振荡均匀，即制备得到质量浓度为0.15mmol·L-1的DPPH溶液。
④DPPH自由基清除能力的测定：分别吸取不同质量浓度的对照品溶液和供试品溶液各2mL，并以甲醇溶剂作为空白对照组。依次加入DPPH溶液4mL，振荡至完全混匀，避光反应30min后，取出，于检测波长为517nm的条件下检测各样品溶液的吸光度值(n＝3)，其清除率的计算公式如下：
Figure BDA0003222276400000051
其中，Ai表示待测样品与DPPH溶液的吸光度值；Aj表示待测样品与甲醇溶剂的吸光度值；A0表示甲醇与DPPH溶液的吸光度值。
(三)检测结果及分析
1、色谱条件下CBD的分离结果
图1为CBD和THC HPLC色谱图，其中A为生药样品；B为CBD、THC对照品。由图1可知，在色谱条件下，CBD、THC得到较好的分离。
2、工业大麻发酵前后CBD的含量变化
图2为工业大麻发酵前后活性成分的变化曲线，其中A为工业大麻发酵样品；B为工业大麻生药样品2-CBD,4-THC。分析图2结果可知，工业大麻发酵后其活性成分存在增减变化。其中，峰1、峰5所对应的活性化合物含量降低；峰2、峰3、峰4所对应的化合物含量升高。
3、工业大麻发酵样品中CBD含量测定结果
以甘草内生真菌RP4作为发酵菌株，分别与不同部位、不同产地的工业大麻进行发酵，CBD及THC含量动态变化结果见表2。
表2内生真菌RP4发酵不同工业大麻结果
Figure BDA0003222276400000061
注：P<0.01，发酵前后物质含量差异极显著**；P<0.05，发酵前后物质含量差异显著*。
由表2可知，采用内生真菌RP4分别对不同部位、不同产地的工业大麻进行发酵，其CBD含量均显著提高。由于工业大麻中CBD的含量以叶和花为最高，常被广泛应用，而其他部位往往易被忽视。本发明以内生真菌RP4对工业大麻不同部位进行发酵，结果表明，叶、根以绥化市工业大麻发酵样品中的CBD含量为最高，可分别增高3.12倍和2.28倍，茎以哈尔滨市江北区工业大麻发酵样品中的CBD含量为最高，可增高3.42倍；此外，以内生真菌RP4发酵不同地区工业大麻，其发酵前后CBD的含量也各不相同，推测可能与其土壤环境、种植方法均有一定联系。因此，以内生真菌RP4发酵不同工业大麻用于生产CBD，对于合理利用工业大麻资源具有重要意义。
尽管工业大麻发酵后其THC含量也有所增加，但其含量仍在国家管控范围内。
4、抗氧化作用结果
采用DPPH法，以Vc作为阳性对照品，对工业大麻发酵前后样品进行抗氧化活性对比研究，其结果见图3和图4。
图3为工业大麻发酵前后对DPPH自由基的清除能力，其中●表示Vc，◆表示发酵样品，▼表示生药样品。图4为工业大麻发酵前后对DPPH的半数清除率(IC50)，其中A表示生药样品，B表示发酵样品。
根据图3和图4可知，当供试品浓度在6.25～100μg·mL-1的范围内变化时，内生真菌RP4发酵样品对DPPH自由基的清除率均伴随其浓度的增大而增大，存在一定的量效关系。并且，当样品质量浓度为100μg·mL-1时，内生真菌RP4发酵样品对DPPH自由基的清除率达到68.24％，根据量效关系计算得出，内生真菌RP4发酵样品对DPPH的半数清除率(IC50值)为19.15±0.08μg·mL-1，远远高于工业大麻生药样品。经过对比分析，经过内生真菌RP4发酵后的工业大麻供试品的抗氧化能力远远高于生药供试品。
结论：采用甘草内生真菌RP4作为发酵菌株，以该菌株发酵工业大麻后，可定向提高其CBD含量。因此，采用甘草内生真菌RP4发酵工业大麻后可以高效生产CBD原料，最大化利用工业大麻资源。此外，工业大麻发酵后存在活性成分的增减变化，且其抗氧化活性显著增强，说明工业大麻发酵后有望作为抗氧化剂进行开发利用。

Claims (10)

1.一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤一：取干燥的工业大麻叶，粉碎，过筛，将大麻叶粉末置于容器内，加水，密封，然后进行高压灭菌处理，灭菌后取出作为底物，其中底物的质量浓度为0.1～0.5g/mL；
步骤二：将甘草内生真菌RP4接种于PDA的斜面培养基，恒温培养，得到活化后的甘草内生真菌RP4，然后将活化后的甘草内生真菌RP4与无菌水混合，得到菌体浓度为1×107CFU·mL-1的菌悬液；
步骤三：将菌悬液加入到底物中，置于空气浴摇床中进行发酵培养，时间为12h～108h，即完成工业大麻的发酵；
步骤二所述甘草内生真菌RP4为枝顶孢菌(Acremonium dichromosporum)RP4，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No：M 2012048，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。
2.根据权利要求1所述的一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法，其特征在于步骤一中过筛为过40～80目筛。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法，其特征在于步骤一所述高压灭菌处理的条件为121℃，20～60min。
4.根据权利要求3所述的一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法，其特征在于步骤一中大麻叶粉末与水的质量比为1:(5～20)。
5.根据权利要求4所述的一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法，其特征在于步骤二中恒温培养条件为：28℃，0.5～4.5d。
6.根据权利要求5所述的一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法，其特征在于步骤三空气浴摇床中培养条件为25～37℃，120～150r·min-1。
7.根据权利要求6所述的一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法，其特征在于步骤三的发酵产物进行冻干，作为工业大麻发酵产品。
8.根据权利要求7所述的一种利用甘草内生真菌发酵工业大麻的方法，其特征在于步骤三中菌悬液的体积和底物的质量比为1mL:2g。
9.如权利要求1所述甘草内生真菌在发酵工业大麻提高大麻二酚含量中的应用。
10.如权利要求1所述甘草内生真菌在发酵工业大麻提高大麻抗氧化活性中的应用。
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