CN113563418A - 一种原位响应ros的人工酶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种原位响应ros的人工酶及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113563418A
CN113563418A CN202110691641.6A CN202110691641A CN113563418A CN 113563418 A CN113563418 A CN 113563418A CN 202110691641 A CN202110691641 A CN 202110691641A CN 113563418 A CN113563418 A CN 113563418A
Authority
CN
China
Prior art keywords
formula
compound
cancer cell
cell
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110691641.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113563418B (zh
Inventor
王树
底宇飞
刘礼兵
吕凤婷
黄一鸣
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Chemistry CAS
Original Assignee
Institute of Chemistry CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Chemistry CAS filed Critical Institute of Chemistry CAS
Priority to CN202110691641.6A priority Critical patent/CN113563418B/zh
Publication of CN113563418A publication Critical patent/CN113563418A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113563418B publication Critical patent/CN113563418B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/081—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种原位响应ROS的人工酶及其制备方法与应用。本发明所提供的人工酶的结构式如式I所示。本发明通过四(3‑巯基丙酸)季戊四醇酯共价连接组氨酸残基，使咪唑基团在肿瘤细胞内形成聚集体，拉近了彼此聚集，咪唑基之间从而发生去质子化过程提高了催化酯水解活性，使“turn‑on”探针FN发荧光；然而在正常细胞内因活性氧含量较低，不发生聚集，所以不能催化酯水解，基于此实现对肿瘤细胞选择性诊断。本发明首次提供了响应胞内微环境及选择性诊断的人工酶。

Description

一种原位响应ROS的人工酶及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种原位响应ROS的人工酶及其制备方法与应用，属于人工酶和选择性诊断领域。
背景技术
天然酶因其催化效率高在工业和日常生活中据有很高的利用价值，然而天然酶大多是由蛋白质或者RNA构成，其只能在特定的环境下有较高的催化活性。由于酸化或加热引起的蛋白质变性，会造成酶的不可逆失活。此外天然酶分离困难，导致其难以得到纯品且价格昂贵，这些因素限制其发展，因此迫切需要发展出具有较强催化活性和耐受性的人工酶。将天然酶的刺激响应行为整合到人工酶中可能使酶反应活性的调控成为可能，但这是具有挑战性的，因为它需要将刺激响应与催化部分的结合和精确定位相结合。
发明内容
本发明的目的是提供一种人工酶(式Ⅰ所示化合物，简称PTT-SGH)及其制备方法与应用，PTT-SGH可响应细胞内源性ROS形成交联结构，原位提高催化酯水解活性，从而通过高对比度荧光选择性诊断肿瘤细胞。
本发明首先提供式Ⅱ所示化合物(即式Ⅰ所示化合物的前体，(3-Mal)-SGH))，
Figure BDA0003126386550000011
本发明提供的人工酶(PTT-SGH)，其结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0003126386550000021
本发明进一步提供了式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
式Ⅱ所示化合物与四(3-巯基丙酸)季戊四醇酯(PTT)进行迈克尔加成反应即得。
上述的制备方法中，所述迈克尔加成反应在无氧的条件下进行；
所述迈克尔加成反应的温度为23～27℃，时间为12～24h。
上述的制备方法中，所述迈克尔加成反应的溶剂为超干的DMSO或DMF；
所述迈克尔加成反应可采用催化量的正丙胺和TCEP进行催化(如式Ⅱ所示化合物的1％摩尔量的正丙胺、10％摩尔量的TCEP)。
式Ⅱ所示化合物与所述四(3-巯基丙酸)季戊四醇酯的摩尔比为1：2。
本发明提供的式Ⅰ所示化合物作为人工酶能够用于正常细胞和肿瘤细胞的成像，通过高对比度荧光实现肿瘤细胞的诊断；
所述正常细胞为人肺成纤维细胞HPF；
所述肿瘤细胞为人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7或人宫颈癌细胞Hela。
本发明通过四(3-巯基丙酸)季戊四醇酯共价连接组氨酸残基，使咪唑基团在肿瘤细胞内形成聚集体，拉近了彼此距离，咪唑基之间从而发生去质子化过程提高了催化酯水解活性，使“turn-on”探针FN发荧光。然而在正常细胞内因活性氧含量较低，不发生聚集，所以不能催化酯水解，基于此实现对肿瘤细胞选择性诊断。本发明首次提供了响应胞内微环境及选择性诊断的人工酶。
附图说明
图1为式I所示化合物PTT-SGH的表征。
图2为式I所示化合物PTT-SGH的细胞毒性。
图3为式I所示化合物PTT-SGH在细胞内催化酯水解后的CLSM图。
图4为式I所示化合物PTT-SGH在混合细胞中选择性催化酯水解后的CLSM图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的“turn-on”探针FN根据参考文献Li,G.,Liu,Y.,Song,J.etal.A Fluorescein-Based Colorimetric and Fluorescent Probe for Hydrazine andits Bioimaging in Live Cells.J Fluoresc,2017,27:323–329.中公开的方法制备合成。
实施例1：制备目标化合物(式I所示化合物)
97.8mg化合物四(3-巯基丙酸)季戊四醇酯(Pentaerythritol tetra(3-mercaptopropionate)，简称PTT)、45.0mg化合物式II(由强耀生物科技有限公司合成，其与PTT的摩尔比为1：2)、如式Ⅱ所示化合物的1％摩尔量的正丙胺、10％摩尔量的TCEP溶解在3mL的无水DMF中，通氩气除氧30分钟，反应在常温无氧条件下搅拌24小时。加足量的水稀释后，通氩气用截留分子量为100～500Da的透析袋透析3天至小分子除去。冻干得到无色透明固体PTT-SGH。HR-MS(ESI,[M+H]+):Calcd.for C35H51N6O16S4:939.22389,found:939.22400.如图1，可以看出，本实施例得到了目标化合物。
实施例2：式I所示化合物(PTT-SGH)对细胞的毒性
人肺癌细胞A549接种在96孔板内，密度为8×103个/孔，放入37℃细胞培养箱中过夜，待其贴壁。加入不同浓度的式I所示化合物(PTT-SGH)，培养36小时后。接下来，加入混有MTT(0.5mg/mL，100μL/孔)的培养基，当在37℃细胞培养箱中放置4小时后，吸去上清，每孔加入100μL DMSO。然后用酶标仪读取570nm处的吸收值。
同样的操作应用于人乳腺癌细胞MCF-7、人宫颈癌细胞Hela、人肺成纤维细胞HPF。
各种条件下的细胞活性如图2所示，可以看出，对肿瘤细胞如：人肺癌细胞A549人乳腺癌细胞MCF-7、人宫颈癌细胞Hela，正常细胞人肺成纤维细胞HPF，PTT-SGH在100μM以下的浓度均有很好的细胞相容性。
实施例3：式I所示化合物(PTT-SGH)在人肺癌细胞A549、人肺成纤维细胞HPF中分别催化酯水解
人肺癌细胞A549接种在玻璃底的CLSM皿，密度为1×105个/皿，放入37℃细胞培养箱中过夜，待其贴壁。接下来，对照组中加入混有100μM PTT的DMEM，而实验组则加入100μMPTT-SGH，在37℃细胞培养箱中放置24小时后，每组都加入10μM FN，在37℃细胞培养箱中孵育10小时。最后去CLSM拍摄。
同样的操作应用于人肺成纤维细胞HPF。
式I所示化合物PTT-SGH在细胞内催化酯水解后CLSM图如图3(a)所示，然后用ImageJ定量每张图片的荧光数值，计算得图3(b)，可以看出，癌细胞A549实验组的荧光亮度比其对照组强，也比正常细胞HPF组荧光亮度强，说明PTT-SGH只在ROS含量高的癌细胞A549中可以很好的催化酯水解，使FN产生荧光；在ROS含量少的正常细胞HPF中不会催化酯水解。
实施例4：式I所示化合物(PTT-SGH)在人肺癌细胞A549、人肺成纤维细胞HPF混合培养下选择性催化酯水解
将人肺癌细胞A549、人肺成纤维细胞HPF以2：1的比例接种在玻璃底的CLSM皿，待其贴壁。接下来，对照组中加入混有100μM PTT的DMEM，而实验组则加入混有100μM PTT-SGH的DMEM，在37℃细胞培养箱中放置24小时后，每组都加入10μM FN，在37℃细胞培养箱中孵育10小时。最后用CLSM拍摄。
CLSM图如如图4所示，由该图可以看出，对照组都没有荧光。对于实验处理组：正常长纤维状的细胞HPF细胞没有荧光，较小的梭型癌细胞A549荧光很强，说明PTT-SGH只在ROS含量高的A549中可以很好的催化酯水解，使FN产生荧光。所以PTT-SGH配合FN能实现对肿瘤细胞的选择性诊断。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及核心技术，并不是对本申请的范围限制。对于本领域的技术人员来说，凡在本申请原理以内的任何修改，替换，改进等，均在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.式Ⅱ所示化合物，
Figure FDA0003126386540000011
2.式Ⅰ所示化合物，
Figure FDA0003126386540000012
3.权利要求2所述化合物的制备方法，包括如下步骤：
权利要求1所述式Ⅱ所示化合物与四(3-巯基丙酸)季戊四醇酯进行迈克尔加成反应即得。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述迈克尔加成反应在无氧的条件下进行；
所述迈克尔加成反应的温度为23～27℃，时间为12～24h。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于：所述迈克尔加成反应的溶剂为DMSO或DMF；
式Ⅱ所示化合物与所述四(3-巯基丙酸)季戊四醇酯的摩尔比为1：2。
6.权利要求2所述化合物在作为或制备细胞成像试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
所述细胞成像试剂用于正常细胞和癌细胞的成像；
所述正常细胞为人肺成纤维细胞HPF；
所述癌细胞为人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7或人宫颈癌细胞Hela。
8.权利要求2所述化合物在作为或制备选择性诊断肿瘤细胞的人工酶中的应用。
所述人工酶通过高对比度荧光实现诊断。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF-7或人宫颈癌细胞Hela。
CN202110691641.6A 2021-06-22 2021-06-22 一种原位响应ros的人工酶及其制备方法与应用 Active CN113563418B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110691641.6A CN113563418B (zh) 2021-06-22 2021-06-22 一种原位响应ros的人工酶及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110691641.6A CN113563418B (zh) 2021-06-22 2021-06-22 一种原位响应ros的人工酶及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113563418A true CN113563418A (zh) 2021-10-29
CN113563418B CN113563418B (zh) 2023-03-03

Family

ID=78162493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110691641.6A Active CN113563418B (zh) 2021-06-22 2021-06-22 一种原位响应ros的人工酶及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113563418B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102038932A (zh) * 1999-10-01 2011-05-04 Dmi生物科学公司 金属-结合性化合物及其用途
CN102382175A (zh) * 2011-11-02 2012-03-21 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 肺癌细胞特异靶向多肽、其制备方法及应用
US20150030854A1 (en) * 2013-07-26 2015-01-29 Snu R&Db Foundation Vitamin b6-coupled poly(ester amine) as gene carrier and application in cancer gene therapy
CN109602739A (zh) * 2019-01-18 2019-04-12 苏州大学 青蒿琥酯在制备抑制肿瘤细胞耐药性药物中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102038932A (zh) * 1999-10-01 2011-05-04 Dmi生物科学公司 金属-结合性化合物及其用途
CN102382175A (zh) * 2011-11-02 2012-03-21 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 肺癌细胞特异靶向多肽、其制备方法及应用
US20150030854A1 (en) * 2013-07-26 2015-01-29 Snu R&Db Foundation Vitamin b6-coupled poly(ester amine) as gene carrier and application in cancer gene therapy
CN109602739A (zh) * 2019-01-18 2019-04-12 苏州大学 青蒿琥酯在制备抑制肿瘤细胞耐药性药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113563418B (zh) 2023-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106554499B (zh) 一种含二硫键的聚(β-氨基酯)类聚合物基因载体及其合成方法和应用
CN113563418B (zh) 一种原位响应ros的人工酶及其制备方法与应用
Wakabayashi et al. Poly (ethylene glycol)-based biofunctional hydrogels mediated by peroxidase-catalyzed cross-linking reactions
US7446099B2 (en) Compositions and methods for biodegradable polymer-peptide mediated transfection
CN104004804A (zh) 一种博来霉素族衍生物的微生物发酵制备方法
Moriyama et al. Enzyme-mediated preparation of hydrogels composed of poly (ethylene glycol) and gelatin as cell culture platforms
CN117731693A (zh) 基于掺杂的多酶活性纳米材料在治疗炎症性疾病中的应用
CN110713601A (zh) 基于生物正交反应的可快速固化水凝胶、其制法与应用
CN109675051B (zh) 一种抗肿瘤肽-阿霉素衍生物及其制备方法和抗肿瘤药物
CN111678900A (zh) 基于酪氨酸酶催化的细胞膜和细胞壁荧光标记方法及应用
CN111154015A (zh) 卟啉封端的纳米级荧光聚轮烷及其制备方法和应用
CN114209850B (zh) 一种负载阿霉素靶向碳点的制备及应用
CN113769115B (zh) 一种上转换纳米诊疗一体化平台探针及其制备方法
CN108685850A (zh) 模块化组装的组合生物药物联合递送系统及应用
CN109880108B (zh) 一种聚乙烯亚胺接枝米糠多糖铁的制备方法及基因载体
KR20170110296A (ko) 종양 유래 세포 배양용 배지 조성물 및 배양방법
CN113583189B (zh) 一种多羟基聚氨酯蛋白质转染试剂、制备方法及其应用
CN112168980B (zh) 一种基因激活型抗菌生物活性骨修复材料及其制备方法和应用
CN104356199B (zh) 一种硬脂酰修饰的多肽类可降解基因载体及其制备方法与应用
CN1331836C (zh) 一种具有生物活性的c60反丁二酸及其合成方法
CN108794054A (zh) 一种新型白酒窖池生物砖的制备方法
US11946073B2 (en) Method for non-enzymatic 3D culture and amplification of mesenchymal stem cells
CN106749680A (zh) 多肽修饰的纳米粒子及其制备方法和控制细胞中基因表达的方法
CN113082054B (zh) 一种干细胞转染的基因递送载体及其制备方法和用途
CN117624658A (zh) 一种具有谷胱甘肽响应性的透明质酸聚合物点及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant