CN113552098A - 一种基于介孔膜尺寸效应的病原菌生物传感分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于介孔膜尺寸效应的病原菌生物传感分析方法，属于病原菌检测技术领域。提供一种能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头，所述光纤探头的一端为分离段，所述分离段的外表面具有一层介孔膜。本发明通过在光纤表面上的介孔膜来实现病原微生物和荧光标记生物识别分子的原位分离，利用倏逝波诱导激发荧光的方法来完成病原菌的快速灵敏检测。不仅可以避免传统生物传感器固定生物识别分子造成诸多不足，提高生物识别分子与病原菌的亲和反应效率；也无需苛刻的再生条件，无需采用夹心法的检测方式，可以大大简化病原菌检测步骤，减少检测时间和反应试剂的使用，有效降低检测成本，而且也有利于实际样品病原菌的快速灵敏检测。

Description

一种基于介孔膜尺寸效应的病原菌生物传感分析方法
技术领域
本发明公开了一种基于介孔膜尺寸效应的病原菌生物传感分析方法，属于病原菌检测技术领域。
背景技术
病原菌引起的各种传染病是当今危害人类健康与生命安全最为严重的一类疾病。统计表明，世界上每年因传染性疾病死亡的人数占总死亡人数的1/4以上，发展中国家的情况更为严重。近年来，尽管研发的疫苗和抗生素在遏制病原菌传染病方面取得了巨大的成功，但是新的和药耐性药病原菌却层出不穷。病原菌传统培养检测法是一个金标准方法，但检测周期长、程序复杂。同时，由于病原菌种类日益增多，且不少病原菌尚无可行的分离培养方法。而对于临床检验和环境污染应急检测来说，最为关键的要求之一是尽可能简化分析处理过程、尽快获得检测结果和减少所需样品量。传统培养法显然难以这样的要求。随着分子生物学、免疫学等现代生物学的飞速发展，分子生物学技术及免疫分析技术被广泛应用于病原菌的检测，如PCR技术、酶联免疫分析技术等。理论上，这些方法可以检测几乎所有病原菌，并且可有效提高病原菌检测的时效性及灵敏度，但是这些分析技术仍然需要较长时间(一般都大于2h)、繁杂的前处理过程、易受杂质干扰、所需的样品量较大、存在假阳/阴性结果等不足之处。因此，为实现病原菌感染疾病快速鉴定与诊断和病原菌污染快速监控预警，发展适用于病原菌现场即时检测、高灵敏、高特异性、快速经济的新技术至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种介孔膜光纤探头及其制备方法和应用。
本发明提供一种能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头，所述光纤探头的一端为分离段，所述分离段的外表面具有一层介孔膜。
其中，所述介孔膜的孔径为100nm。
其中，所述光纤探针为英光纤探针。
其中，所述石英光纤探针光纤纤芯的折射率为1.456，光纤的数值孔径为0.22，光纤的芯径为600μm，所述分离段的芯径为225μm,光纤探头的长度为5.5cm，所述分离段的长度为2.5cm。
本发明还涉及一种能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头的制备方法，包括：
1)去除光纤探头上的一端的涂覆层；
2)将去光纤探头去除涂覆层的部分浸泡在腐蚀液中，形成表面具有介孔膜的分离段；
3)去除光纤探头剩余的涂覆层，得到本发明的能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头。
其中，所述步骤1)中的光纤探头的长度为5.5cm，所述去除涂覆层的长度为2.5cm，芯径为600μm；
其中，所述步骤2)中的所述腐蚀液为质量分数为50％的HF水溶液、浸泡温度为25℃；所述分离段的芯径为225nm，所述介孔膜的孔径为100nm。
其中，所述光纤探头由石英光纤制成。
所述的能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头或所述制备方法制备的能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头在制备病原菌检测产品或者病原菌检测设备中的应用也应在本发明的保护范围之内。
所述的能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头或所述制备方法在检测环境样品中病原菌中的应用也应在本发明的保护范围之内。
为了实现上述应用，本发明提供了一种可特异性识别大肠杆菌O157:H7外膜蛋白的核酸适配体，其核苷酸序列如序列1所示为5’-GCGGGAATAGGATGCGGCTGGAAGGAGAGGTGTTGGTGGGTGGTG-3’，
本发明提供了一种可特异性识别沙门氏菌的核酸适配体，其核苷酸序列如序列2所示为5’-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3’，
本发明提供了一种可特异性识别大肠杆菌O157:H7的抗体。
上述所述核酸适配体和抗体均可用荧光染料Cy5.5进行修饰。
本发明还提供一种利用所述病原菌生物传感器检测大肠杆菌O157:H7的方法，具体包括：(1)样品制备：无菌操作，在25℃下，将大肠杆菌O157:H7菌液与500nM核酸适配体混合反应15min；(2)样品检测：先通入磷酸盐缓冲液20s，将(1)所得的样品通入病原菌生物传感器中(17s)，样品在样品池中反应30s，再次通入磷酸盐缓冲液20s，完成样品检测，即样品检测2min后能够得到荧光信号值。根据所得的大肠杆菌O157:H7检测标准曲线，将检测到的荧光信号值对应得到菌体浓度。本发明提供的方法适用于大肠杆菌O157:H7快速检测，可实现样品中大肠杆菌O157:H7最短17min检测，检测限为350CFU/mL。
本发明还提一种供利用所述病原菌生物传感器检测沙门氏菌的方法，具体方法：(1)样品制备：无菌操作，在4℃下，将沙门氏菌菌液与400nM核酸适配体混合反应45min；(2)样品检测：先通入磷酸盐缓冲液20s，将(1)所得的样品通入病原菌生物传感器中(17s)，样品在样品池中反应30s，再次通入磷酸盐缓冲液20s，完成样品检测，即样品检测2min后能够得到荧光信号值。根据所得的沙门氏菌检测标准曲线，将检测到的荧光信号值对应得到菌体浓度。本发明提供的方法适用于沙门氏菌快速检测，可实现样品中沙门氏菌最短50min检测，检测限为10CFU/mL，详见实施例3。
本发明还提一种供利用所述病原菌生物传感器检测大肠杆菌O157:H7的方法，具体方法：(1)样品制备：无菌操作，将大肠杆菌O157:H7菌液与抗体混合反应15min；(2)样品检测：先通入磷酸盐缓冲液20s，将(1)所得的样品通入病原菌生物传感器中(17s)，样品在样品池中反应30s，再次通入磷酸盐缓冲液20s，完成样品检测，即样品检测2min后能够得到荧光信号值。根据所得的大肠杆菌O157:H7检测标准曲线，将检测到的荧光信号值对应得到菌体浓度。本发明提供的方法适用于大肠杆菌O157:H7快速检测，可实现样品中大肠杆菌O157:H7最短20min检测，检测限为500CFU/mL。
本发明通过调控介孔膜的孔径大小，实现荧光标记生物识别分子和病原菌在均相溶液中的有效筛分。因此，本发明通过在光纤表面上自组装的介孔膜来实现病原微生物和荧光标记生物识别分子的原位分离，利用倏逝波诱导激发荧光的方法来完成病原菌的快速灵敏检测。这样不仅可以避免传统生物传感器固定生物识别分子造成诸多不足，提高生物识别分子与病原菌的亲和反应效率；也无需苛刻的再生条件，无需采用夹心法的检测方式，这样不仅可以大大简化病原菌检测步骤，减少检测时间和反应试剂的使用，有效降低检测成本，而且也有利于实际样品病原菌的快速灵敏检测。
附图说明
图1是本发明的介孔膜结构示意图；
图2是本发明中检测原理示意图；
图3是不同腐蚀条件得到的光纤探头的稳定性测试结果图；
图4是光纤表面形貌表征，其中A为原子力显微镜表征；B为Merlin扫描电子显微镜表征。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如图1所示，激光在光纤中传播时，在光纤表面发生全反射而产生倏逝波，倏逝波随着渗入深度的增加而呈指数衰减，渗入深度约为100nm，在生物识别分子上标记的荧光探针会被倏逝波激发，产生荧光信号被光纤收集，再次传回探测器。而在光纤表面制作的介孔膜孔径约为100nm，菌体大小约为微米级别，而核酸适配体、抗体等生物识别分子大小均为几十纳米以下，能够将菌体和生物识别分子进行有效分离，应用介孔膜尺寸效应而对病原微生物进行检测。
如图2所示为检测的过程原理。样品为菌液与一定浓度的生物识别分子结合的溶液。过程A为当溶液环境中并不存在样品时，检测时并未有荧光信号产生，此时所得的信号值是由背景光造成的，该过程一般为20s。过程B是将样品通入样品池中，样品在光纤表面发生扩散，游离的生物识别分子被缓慢吸附到光纤介孔膜的孔洞中，而结合有生物识别分子的菌体被孔洞阻拦在光纤外，因此，荧光信号值会缓慢上升，至不再有明显上升，该过程一般为17s。C过程为游离的生物识别分子已经全部被吸附到光纤孔洞中，能够被激发的荧光已都被有效激发，此时荧光信号值不变，该过程一般为30s。D过程是将样品池中的样品进行清洗，将样品冲去，此时被吸附的生物识别分子和菌体被冲洗离开光纤表面，此时，能够激发的荧光变少，荧光信号值降低，该过程一般为10s。E过程是为了保证样品池中不再含有能够引起荧光信号变化的物质，此时的荧光信号值仅由于背景光的影响，该过程一般为20s。
实施例1
介孔膜光纤探头的制备：
在对石英光纤进行腐蚀时通常发生的反应有：SiO2(s)+4HF(aq)→SiF4(g)+2H2O(l)，生成的SiF4可以继续和过量的HF作用，生成氟硅酸：SiF4(g)+2HF(aq)＝H2[SiF6](aq)。基于上述反应原理，通过如下方法进行介孔膜光纤探头的制备。
1号介孔膜光纤探头的制备
1)取芯径为600μm，折射率为1.45，将5.5cm长的石英光纤，去除一端2.5cm长的涂覆层。
2)将10mLHF溶液(HF溶液为质量分数50％的HF水溶液)加入用于光纤腐蚀的小瓶中，用封口膜将瓶口封好，放置在25℃的环境中；将石英光纤插入其中，去除涂覆层的一头向下，使溶液没过所有去除涂覆层的区域；用显微镜观察光纤的芯径；腐蚀至光纤的芯径为225nm为止，此时得到表面形成介孔膜的分离段；
3)使用刀片去除光纤探头上剩余的涂覆层，得到介孔膜光纤探头。
2号介孔膜光纤探头的制备
与1号介孔膜光纤探头的制备方法相比，将步骤2中的10mLHF溶液替换成HF溶液与HNO3溶液(HNO3溶液为硝酸质量分数为68％的水溶液)的混合液，其中HF溶液与HNO3溶液的体积比为10:1，其它步骤不变，得到2号介孔膜光纤探头。
3号介孔膜光纤探头的制备
与1号介孔膜光纤探头的制备方法相比，将步骤2中的10mLHF溶液替换成HF溶液与HNO3溶液(HNO3溶液为硝酸质量分数为68％的水溶液)的混合液，其中HF溶液与HNO3溶液的体积比为4:1，其它步骤不变，得到3号介孔膜光纤探头。
4号介孔膜光纤探头的制备
与1号介孔膜光纤探头的制备方法相比，将步骤2中的10mLHF溶液替换成HF溶液与HNO3溶液(HNO3溶液为硝酸质量分数为68％的水溶液)的混合液，其中HF溶液与HNO3溶液的体积比为5：2，其它步骤不变，得到4号介孔膜光纤探头。
5号介孔膜光纤探头的制备
与1号介孔膜光纤探头的制备方法相比，将步骤2中的10mLHF溶液替换成HF溶液与超纯水的混合液，其中HF溶液与超纯水的体积比为3:2，其它步骤不变，得到5号介孔膜光纤探头。
6号介孔膜光纤探头的制备
与1号介孔膜光纤探头的制备方法相比，将步骤2中的10mLHF溶液替换成HF溶液与超纯水的混合液，其中HF溶液与超纯水的体积比为1:4，其它步骤不变，得到6号介孔膜光纤探头。
7号介孔膜光纤探头的制备
与1号介孔膜光纤探头的制备方法相比，将步骤2中的反应环境温度设为15℃，其它步骤不变，得到7号介孔膜光纤探头。
8号介孔膜光纤探头的制备
与1号介孔膜光纤探头的制备方法相比，将步骤2中的反应环境温度设为35℃，其它步骤不变，得到9号介孔膜光纤探头。
将上述不同制备条件制得的1-9号光纤探头进行性能表征，主要包括荧光信号的收集效果，形貌状态，孔径大小等。
荧光信号收集效果表征：使用倏逝波全光纤生物传感器，采用Cy5.5作为待测样品的目标荧光染料分子，其最大激发/发射波长分别为675/694nm，斯托克位移约为20～35nm。激光器采用635nm的半导体尾纤激光器作为光源，同时选择中心波长为430nm滤光片，在694nm处的透射率大于90％。用同一Cy5.5溶液(Cy5.5溶液为将荧光染料Cy5.5溶于少量的二甲基亚砜，溶解后加入纯水稀释)作为样品，不同光纤探头对其进行检测，结果如图3所示。形貌状态和孔径大小表征：使用Merlin扫描电子显微镜和原子力显微镜对制备的介孔膜光纤探头进行表征，结果如图4所示。
从图3和图4综上述数据，可以看出1号光纤在对荧光溶液检测稳定性最优，且光纤表面具有分布均匀且孔径大小约为100nm的介孔。对荧光溶液进行检测时，1～8号光纤中，6～7号光纤对荧光检测时响应的信号较大，但其检测的稳定性较差，而1～4号光纤在检测时，其信号值相差不大，1号光纤检测稳定性明显优于其他光纤，且从图4中可以看出，1号光纤表面腐蚀得到的孔径约为100nm，并且在光纤表面得到了分布均匀的介孔结构。在常温25℃下使用50％HF溶液腐蚀光纤能够得到较完整的介孔膜，孔径约为100nm，并且在检测过程中稳定性较好。
使用得到的1号介孔膜光纤探头，应用倏逝波生物传感器(EW 1000，北京瑞联安科技有限公司)组成本发明的基于介孔膜尺寸效应的病原菌生物传感器。
实施例2
1.使用本发明的基于介孔膜尺寸效应的病原菌生物传感器，结合核酸适体对大肠杆菌O157:H7(购于国家标准品网)在均相条件下进行检测。
将接有大肠杆菌的液体培养基(LB液体培养基，具体成分：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl，纯水配置)基放置在37℃下水浴恒温震荡12h。震荡12h后，取出，将振荡好的菌液加入到100mL LB液体培养基中，在37℃下水浴恒温震荡24h，即可进行实验。为进行大肠杆菌的准确计数，通常采用平板菌落计数法确定菌液浓度。
分别使用500nM的大肠杆菌核酸适体(购于上海生工生物，其序列如序列1所示为5’-GCGGGAATAGGATGCGGCTGGAAGGAGAGGTGTTGGTGGGTGGTG-3’)分别同103,104,…,109CFU/mL的大肠杆菌O157:H7在25℃下反应15min，然后将反应后的样品通入仪器进行检测。
检测过程具体为：进样，通入PBS缓冲溶液30s，再将预反应后的样品通入样品池中(17s)，停止进样后，游离在溶液中的核酸适体会吸附到光纤表面的孔洞中，结合有核酸适体的菌体也会吸附到光纤表面，吸附时间为30s；清洗，用极端pH的0.5％SDS溶液对纳米光纤探头表面进行清洗(30s)，再用PBS缓冲溶液清洗(30s)，将残留的SDS溶液冲洗干净，整个检测周期完成。
对数据进行归一化处理，利用origin软件按照四参数Logistics模型对归一化信号与菌液浓度的关系进行拟合，得到大肠杆菌O157:H7的标准曲线，为
Figure BDA0002464910430000061
式中：x为E.coli O157:H7的浓度；y为x对应的荧光信号归一化值。大肠杆菌O157:H7的标准曲线，R2＝0.980，该实验的检测范围为1.3×103～7.9×106CFU/mL，最低检测限为350CFU/mL。
2.应用病原菌生物传感器，检测不同基质中的大肠杆菌O157:H7
将一勺池、自来水、A2O工艺处理工艺各个阶段出水，使用高温灭菌锅121℃高温灭菌，并通过0.22μm孔径的膜过滤后，将扩增培养的菌液使用离心机在10000rmp下离心8min，使用处理后的实际样品清洗3次，配成浓度为1×105CFU/mL(相当于使用实际样品替换1中的培养基)的菌液。分别将不同基质的菌液和500nM核酸适体在25℃下预反应15min，然后进行检测。测试结果如表2所示。结果表明该方法在不同基质中的检测结果相差不大。
表2 不同基质中的大肠杆菌O157:H7浓度
Figure BDA0002464910430000071
实施例3
使用本发明的基于介孔膜尺寸效应的病原菌生物传感器，结合核酸适体配体对沙门氏菌在均相条件下进行检测。
将接有沙门氏菌(购于国家标准品网)的液体培养基(LB液体培养基，具体成分：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl，用纯水配置)放置在37℃下水浴恒温震荡12h。震荡12h后，取出，将振荡好的菌液加入到100mL LB液体培养基中，在37℃下水浴恒温震荡24h，即可进行实验。为进行沙门氏菌的准确计数，通常采用平板菌落计数法确定菌液浓度。
使用400nM沙门氏菌核酸适配体(购于上海生工生物，其序列如序列2所示为5’-TATGGCGGCGTCACCCGACGGGGACTTGACATTATGACAG-3’)在4℃下，与一系列不同浓度的菌液2.5,2.5×10,…,2.5×108CFU/mL反应45min，将样品通入仪器中进行检测。对数据进行归一化处理，利用origin软件按照四参数Logistics模型对归一化信号与菌液浓度的关系进行拟合，得到标准曲线。沙门氏菌的标准曲线
Figure BDA0002464910430000072
式中：x为沙门氏菌的浓度；y为x对应的荧光信号归一化值。R2＝0.975，该实验的检测范围为50～109CFU/mL，最低检测限为10CFU/mL。
实施例4
使用本发明的基于介孔膜尺寸效应的病原菌生物传感器，结合抗体对大肠杆菌O157:H7在均相条件下进行检测。
将接有大肠杆菌的液体培养基(LB液体培养基，具体成分：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl，用纯水配置)放置在37℃下水浴恒温震荡12h。震荡12h后，取出，将振荡好的菌液加入到100mL LB液体培养基中，在37℃下水浴恒温震荡24h，即可进行实验。为进行大肠杆菌的准确计数，通常采用平板菌落计数法确定菌液浓度。
将荧光标记的抗大肠杆菌O157:H7抗体(购于abcam)与一系列不同浓度的大肠杆菌O157:H7菌液103,104,…,109CFU/mL反应，将样品通入仪器中进行检测对数据进行归一化处理，利用origin软件按照四参数Logistics模型对归一化信号与菌液浓度的关系进行拟合，得到标准曲线。大肠杆菌O157:H7的标准曲线
Figure BDA0002464910430000081
式中：x为E.coli O157:H7的浓度；y为x对应的荧光信号归一化值。R2＝0.998，该实验的检测范围为1.4×103～1.4×107CFU/mL，最低检测限为500CFU/mL。
现有技术中，在T.Liu et al,2014的专利中，T.Liu等利用倏逝波光纤免疫传感器检测金黄色葡萄糖球菌，在光纤探头上贴合银反射，包被上金黄色葡萄糖球菌抗体，然后再将CdTe-多克隆抗体偶联物连接到抗体上，介绍了以类夹心法为原理的检测方法，检测过程复杂，使用的反应试剂复杂，再生条件苛刻。Shih等人开发了一种利用酶联免疫法原理的比色试纸检测大肠杆菌，该试纸能够在5h内最低检测出105cell/mL，检测范围为105～109cell/mL，该方法所消耗的时间为5h，且检测范围较高。Zhang等人研究了使用葡萄糖氧化酶(GOx)和漆酶进行信号双扩增的大肠杆菌O157:H7检测的新型灵敏化学发光(CL)免疫测定。该方法基于鲁米诺-H2O2-漆酶反应的表征。与基于辣根过氧化物酶的生物传感器相比，漆酶在强碱性介质中表现出高催化活性，与鲁米诺体系相容。将捕获抗体固定在磁珠(MB)表面上。通过生物素-抗生物素蛋白识别将检测抗体与GOx连接。因此，MB-捕获抗体-大肠杆菌O157:H7-检测抗体-GOX的生物缀合催化底物葡萄糖，从而产生H2O2。然后通过测量H2O2形成后的CL强度来检测大肠杆菌O157:H7。在最佳条件下，大肠杆菌O157:H7的校准曲线从4.3×103CFU/mL到4.3×105CFU/mL近似线性，总测定时间<2.0h。该检测的检出限为1.2×103CFU/mL，显着低于酶联免疫吸附测定法(1.0×105CFU/mL)。该方法检测过程复杂，使用的反应试剂复杂，再生条件苛刻。
与上述现有技术中的检测方法相比，本发明通过调控介孔膜的孔径大小，实现荧光标记生物识别分子和病原菌在均相溶液中的有效筛分。因此，本发明通过在光纤表面上自组装的介孔膜来实现病原微生物和荧光标记生物识别分子的原位分离，利用倏逝波诱导激发荧光的方法来完成病原菌的快速灵敏检测。这样不仅可以避免传统生物传感器固定生物识别分子造成诸多不足，提高生物识别分子与病原菌的亲和反应效率；也无需苛刻的再生条件，无需采用夹心法的检测方式，这样不仅可以大大简化病原菌检测步骤，减少检测时间和反应试剂的使用，有效降低检测成本，而且也有利于实际样品病原菌的快速灵敏检测。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国人民大学
<120> 一种基于介孔膜尺寸效应的病原菌生物传感分析方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgggaatag gatgcggctg gaaggagagg tgttggtggg tggtg 45
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tatggcggcg tcacccgacg gggacttgac attatgacag 40

Claims (10)

1.一种能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头，其特征在于，所述光纤探头的一端为分离段，所述分离段的外表面具有一层介孔膜。
2.根据权利要求1所述的光纤探头，其特征在于，所述介孔膜的孔径为100nm。
3.根据权利要求1所述的光纤探头，其特征在于，所述光纤探针为石英光纤探针。
4.根据权利要求1所述的光纤探头，其特征在于，所述石英光纤探针光纤纤芯的折射率为1.456，光纤的数值孔径为0.22，光纤的芯径为600μm，所述分离段的芯径为225μm,光纤探头的长度为5.5cm，所述分离段的长度为2.5cm。
5.一种能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头的制备方法，其特征在于，包括：
1)去除光纤探头上的一端的涂覆层；
2)将去光纤探头去除涂覆层的部分浸泡在腐蚀液中，形成表面具有介孔膜的分离段；
3)去除光纤探头剩余的涂覆层，得到本发明的能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的光纤探头的长度为5.5cm，所述去除涂覆层的长度为2.5cm，芯径为600μm。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的所述腐蚀液为质量分数为50％的HF水溶液、浸泡温度为25℃；所述分离段的芯径为225nm，所述介孔膜的孔径为100nm。
8.根据权利要求5-7任一所述的制备方法，其特征在于，所述光纤探头由石英光纤制成。
9.权利要求1-4所述的能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头或权利要求5-8任一所述制备方法制备的能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头在制备病原菌检测产品或者病原菌检测设备中的应用。
10.权利要求1-4所述的能够实现介孔膜尺寸效应的光纤探头或权利要求5-8任一所述制备方法在检测环境样品中病原菌中的应用。
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