CN113533315A - 一种显微成像技术评价地黄炮制质量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于显微成像技术评价地黄炮制质量的方法，具体为分别称取生地黄与熟地黄粉末置载玻片上，加水合氯醛试液，盖上盖玻片后于烘箱内加热，冷却后于显微镜下拍摄其显微特征图，提取显微特征色度值L*、a*、b*，计算总色度值E*ab，利用偏最小二乘‑判别分析确定主要差异性显微特征，通过Fisher判别分析建立生地黄与熟地黄的判别函数和判别规则，根据判别函数和判别规则确定炮制质量；本发明利用显微成像技术测定生地黄与熟地黄的显微特征颜色，可以有效的运用于以生地黄与熟地黄为原料的丸剂、散剂、胶囊剂等中成药的质量评价，为生地黄与熟地黄质量评价研究提供借鉴和参考，在一定程度上解决了现有判别手段主观性强样品处理复杂、检测成本高的问题。
Description
技术领域
本发明属于中药品质分析技术领域，具体涉及一种显微成像技术评价地黄炮制质量的方法。
背景技术
中药炮制是中医临床用药特色，中药炮制品质量关乎中医临床疗效。中药经过炮制后，除外观性状、化学成分及药理作用与生品有显著性差异外，其显微特征颜色也发生了显著变化，但目前鲜有针对中药生、制品显微特征颜色的量化研究报道。
生地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥块根，熟地黄为生地黄经酒蒸或清蒸法炮制而成。生地黄炮制成熟地黄后，药性由寒性转变为温性，作用由清转化为补，味由苦转甜。生地黄具有清热凉血，养阴生津的作用，熟地黄则具有滋阴补血的作用。《中国药典》2020年版一部收载了熟地黄的炮制方法，但对蒸制时间无明确规定，多数仅以“黑如漆，甜如饴”等笼统的性状变化作为达到炮制终点的标准，实际生产中难以掌握。《中国药典》2020年版规定：生地黄中梓醇含量不得少于0.20%，地黄苷D含量不得少于0.10%；熟地黄中地黄苷D含量不得少于0.050%。研究表明，地黄经酒蒸或清蒸后地黄苷D含量降低，因此，以地黄苷D含量作为熟地黄含量测定指标难以反映地黄炮制后药效的改变。
中药质量传统经验鉴别法依赖于人的感官评价，而个人存在感官敏感程度的差异，主观性强、个体差异大，尤其是当粉末作为丸剂、散剂、胶囊剂等中成药的原料入药后，更难以评价投药饮片的质量。现代仪器检测手段又存在样品处理过程繁琐，仪器操作复杂，检测成本高的问题。目前对生地黄与熟地黄的显微鉴别内容多用主观性词汇对显微特征颜色进行描述，如木栓细胞淡棕色，这种描述依赖感官评判，主观性强。为了增强生地黄与熟地黄显微鉴别的客观性，提升生地黄与熟地黄的质量评价标准，有必要对生地黄与熟地黄显微特征颜色的差异性进行数字化研究，建立生地黄与熟地黄的显微特征客观化、数字化的质量评价指标，为生、熟地黄质量标准研究提供借鉴。
发明内容
针对现有技术中对生、熟地黄显微鉴别主观性强，未见生地黄与熟地黄显微鉴别的客观指标的问题，本发明提供了一种基于显微成像技术评价地黄炮制质量的方法，通过显微特征颜色的数字化表达有效地对生地黄与熟地黄进行判别，为生、熟地黄质量标准研究提供客观依据。
本发明通过以下技术方案实现：
一种基于显微成像技术评价地黄炮制质量的方法，包括以下步骤：
（1）分别称取生地黄与熟地黄粉末置于载玻片上，滴加水合氯醛试液，盖上盖玻片，置于烘箱内加热，冷却后置于显微镜下拍摄其显微特征图，提取显微特征的色度值L*、a*、b*，并计算总色度值E*ab，利用偏最小二乘-判别分析确定主要差异性显微特征，通过Fisher判别分析建立生地黄与熟地黄的判别函数和判别规则；
（2）分别称取待测生地黄或熟地黄粉末置于载玻片上，滴加水合氯醛试液，盖上盖玻片，置于烘箱内加热，冷却后置于显微镜下拍摄其差异性显微特征图，提取显微特征的色度值L*、a*、b*，并计算总色度值E*ab，根据步骤（1）中确定的判别函数和判别规则确定地黄的炮制质量；
其中，E*ab=（L*2+ a*2+ b*2）1/2。
进一步地，所述的地黄或熟地黄粉末的取样量为1-2mg，加入水合氯醛试液的量为30-40μL/mg待测样品。
进一步地，所述的烘箱内温度为80~120℃，加热时间为10~20min。
进一步地，所述的生地黄和熟地黄的显微特征为木栓细胞。
进一步地，所述的生、熟地黄木栓细胞的判别函数为y=0.340×L*-0.022×b*+0.022×E*ab-4.984；所述的判别规则为当y＞0时为生地黄，当y＜0时为熟地黄。
进一步地，所述的烘箱内温度为90℃，加热时间为10min。
进一步地，所述的地黄或熟地黄为样品粉碎后过4号筛的粉末。
进一步地，进一步地，所述的显微镜下拍摄放大倍数为×200。
进一步地，所述水合氯醛试液配制方法为：水合氯醛加水和甘油溶解，每50g 水合氯醛中加入15mL水和10mL甘油。
有益效果
（1）本发明利用显微成像技术测定生地黄与熟地黄粉末的显微特征颜色，建立了一种快速、便捷判别生熟地黄的判别方法，可以有效的运用于以生、熟地黄为原料的丸剂、散剂、胶囊剂等中成药的质量评价，为生地黄与熟地黄质量评价研究提供借鉴和参考；
（2）本发明为一种数字化、简单、快速判别生地黄与熟地黄的方法，能够通过中药饮片显微特征颜色的数字化表达有效的对生、熟地黄进行判别，并归属生地黄与熟地黄所属阈值，在一定程度上解决了现有生地黄与熟地黄判别手段具有主观性、样品处理复杂、检测成本高的问题。
附图说明
图1为生地黄与熟地黄显微特征图（×200）；其中，a为生地黄显微特征图，b为熟地黄显微特征图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是进一步说明本发明的特征及优点，而不是对本发明进行限制。
下列实施例中使用的水合氯醛的配制方法为：每50g 水合氯醛中加入15mL水和10mL甘油溶解，得水合氯醛试液。
表1 10批生地黄样品信息表
表2 10批熟地黄样品信息表
实施例1
（1）分别取表1、表2中的10批生地黄和10批熟地黄，粉碎，过4号筛，称取过筛后的样品粉末2mg，置于载玻片上，滴加水合氯醛试液75μL，盖上盖玻片，置于烘箱内90℃加热10min，待冷却后置于显微镜下拍摄地黄木栓细胞和导管的显微特征图像；生地黄的显微特征图片如图1（a）所示、熟地黄的显微特征图片如图1（b）所示，与生地黄相比，熟地黄显微特征颜色呈不同程度的加深。
显微镜拍摄参数如下所示：
分辨率：预览分辨率设定为2560*1944；捕抓分辨率为2560*1944；
曝光控制：非自动曝光（目标：120；增益1；曝光时间：500.0 ms）；帧速为NORMALSP；电源频率为直流；
颜色控制：增益控制（红色增益：75；绿色增益：68；蓝色增益：165）；无颜色增强（饱和度默认100）；无单色；无自动白平衡；颜色校正OFF；
图像调整：亮度控制（亮度：115；对比度：23；伽马值：0.730；锐度0）；无降噪与3D降噪；
荧光控制：自动黑平衡（最小值24；最大值255）；无曝光检测；无过曝检测；BINNING:1x1；染色：OFF；
相机参数：Confg1。固定光圈大小为3，光源强度为3，放大倍数200倍。
（2）分别提取步骤（1）中拍摄的生地黄和熟地黄的显微特征的L*、a*、b*值，并计算E*ab值，其中，E*ab=（L*2+ a*2+ b*2）1/2，20批样本（10批生地黄和10批熟地黄）木栓细胞的L*、a*、b*及E*ab值如表3所示，导管的L*、a*、b*、E*ab色差值如表4所示；
表3生地黄与熟地黄木栓细胞颜色值测定结果（n=3）
表4生地黄与熟地黄导管细胞颜色值测定结果（n=3）
（3）将10批生地黄与10批熟地黄的木栓细胞和导管E*ab值导入SIMCA14.1 软件中，启动偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）程序，变量重要性投影值图（VIP图）可直观的表现出各显微特征影响生地黄与熟地黄分类的权重大小， VIP＞1表明该变量对模型分类的贡献度具有统计学意义。2种显微特征细胞中，VIP＞1的为木栓细胞，认为该显微特征是造成生熟地黄具有差异的主要显微特征。
（4）基于地黄木栓细胞色差值的判别分析
将样本分为生地黄、熟地黄两组，共20批作为训练样本，利用SPSS 21.0软件，以组别为因变量，以地黄木栓细胞的L*、a*、b*、E*ab值为自变量进行Fisher判别分析，建立判别函数，
建立判别函数为：
y=0.340×L*-0.022×b*+0.022×E*ab-4.984
该函数判别规则为：y＞0判为生地黄，y＜0判为熟地黄。
（5）可靠性检查
将20批样本带入判别函数进行验证，对判别函数进行可靠性检验，验证结果见表5，结果表明，判别函数对生地黄正判率为100%、熟地黄正判率为90%，平均正判率高达95%；
表5 训练集样本回顾性检验结果
实施例2
精密称取生地黄粉末（过4号筛）2mg置于载玻片上，滴加水合氯醛试液75μL，盖上盖玻片，置于烘箱内分别于80℃、90℃、100℃加热10min、20min，显微镜视野及显微特征分析如表6所示；
表6不同烘制条件下生地黄粉末的透化效果分析
Claims (9)
1.一种基于显微成像技术评价地黄炮制质量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分别称取生地黄与熟地黄粉末置于载玻片上，滴加水合氯醛试液，盖上盖玻片后于烘箱内加热，冷却后置于显微镜下拍摄其显微特征图，提取显微特征的色度值L*、a*、b*，并计算总色度值E*ab，利用偏最小二乘-判别分析确定主要差异性显微特征，通过Fisher判别分析建立生地黄与熟地黄的判别函数和判别规则
（2）分别称取待测生地黄或熟地黄粉末置于载玻片上，滴加水合氯醛试液，盖上盖玻片，置于烘箱内加热，冷却后置于显微镜下拍摄其差异性显微特征图，提取显微特征的色度值L*、a*、b*，并计算总色度值E*ab，根据步骤（1）中确定的判别函数和判别规则确定地黄的炮制质量；
其中，E*ab=（L*2+ a*2+ b*2）1/2。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述的地黄或熟地黄粉末的取样量为1-2mg，加入水合氯醛试液的量为30-40μL/mg待测样品。
3.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述的烘箱内温度为80~120℃，加热时间为10~20min。
4.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述的生地黄和熟地黄的显微特征为木栓细胞。
5.根据权利要求4所述的评价方法，其特征在于，所述的生地黄与熟地黄木栓细胞的判别函数为y=0.340×L*-0.022×b*+0.022×E*ab-4.984；所述的判别规则为当y＞0时为生地黄，当y＜0时为熟地黄。
6.根据权利要求3所述的评价方法，其特征在于，所述的烘箱内温度为90℃，加热时间为10min。
7.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述的地黄或熟地黄为样品粉碎后过4号筛的粉末。
8.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述的显微镜下拍摄放大倍数为200倍。
9.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述水合氯醛试液配制方法为：水合氯醛加水和甘油溶解，每50g 水合氯醛中加入15mL水和10mL甘油。
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