CN113527660A - 人造真菌黑色素材料的制备及抗氧化应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种真菌黑色素纳米粒子及其制备方法及应用，在空气氛围下，将1，8‑二羟基萘溶于乙腈和水的混合溶液中，搅拌得A溶液；将过硫酸铵溶于水中得B溶液；在搅拌下将B溶液缓慢加入A溶液中，混合均匀，将混合液于搅拌下在金属浴上加热升温反应，得反应液；将反应液离心，沉淀清洗超声分散后再次离心，重复多次，得到真菌黑色素纳米粒子；将真菌黑色素纳米粒子在去离子水中分散保存。本发明的真菌黑色素纳米粒子的制备方法，创造性的采用了过硫酸铵分解，产生的自由基引发聚合。不需要额外加入高分子及水溶性表面活性剂，就可以调节粒径。粒径均一，大小可以根据情况进行调配，对细胞没有明显的毒性，且在自由基清除方面的能力强。

Description

人造真菌黑色素材料的制备及抗氧化应用

技术领域

本发明涉及一种人造真菌黑色素材料的制备及抗氧化应用，具体的，涉及一种真菌黑色素纳米粒子、其制备方法及应用，属于黑色素材料技术领域。

背景技术

黑色素是一种存在于动物、植物和微生物等许多生物体中的天然色素，以其在人类皮肤着色中的作用而闻名，然而，它们也以多种方式发挥作用，如金属离子络合、自由基猝灭、光保护、神经保护等。黑色素根据其结构可分为五种类型：真黑色素、褐黑色素、神经黑色素、脓黑色素、异黑色素。其中异黑色素是一种不含氮的黑色素，通常在植物、真菌等生物中存在。

以1，8-二羟基萘(DHN)为前体合成的真菌黑色素(或被称为DHN-黑色素)就是异黑素的一种，这种黑色素被发现于切尔诺贝利核电站，在大多生物无法存活的高强度的电离辐射下生长的一种真菌中(Microbiol.2008,11,525–531)。在真菌中，真菌黑色素都有助于其在恶劣的环境中生存，通过作为细胞壁的必要成分，增加其刚性，疏水性，负电荷和减少其孔隙率(Biochemistry 2005,44,3683–3693)。此外，真菌黑色素可以保护这些真菌免受高剂量辐射，在某些情况下，已证明γ辐射对在宇宙飞船上和切尔诺贝利反应堆内发现的某些种类的黑化真菌是有益的(PLoS One 2007,2,e457)。鉴于天然黑色素的无数功能和它们固有的化学性质的复杂性，合成人造黑色素材料为分析黑色素的结构和功能提供了有前途的途径。

目前已有的合成人造真菌黑色素的方法通常是利用酶催化聚合(ChemPlusChem2019,84(9),1331-1337)，强氧化剂氧化聚合(ACS Nano 2019,13,10,10980–10990)，氨气催化的固相聚合(J.Mater.Chem.B,2020,8,4412-4418)。其中酶催化聚合所得的真菌黑色素材料形貌不均一，且酶活性不同可重复性差。而强氧化剂氧化制得的真菌黑色素粒径虽然均一但可调整范围小，且氧化剂会带来较多副反应和副产物。氨气催化的固相聚合则局限于制备介质表面的涂层。所以一种产率高、粒径可控、可重复性好的人造真菌黑色素合成方法仍有待探索。

针对上述的问题，本发明提供了一种依靠自由基引发剂过硫酸铵来引发1，8-二羟基萘聚合来制备人造真菌黑色素(PDHN)的方法。该方法副反应更少，通过自由基来引发材料的聚合这一过程更加可控。可以通过调节反应条件和原料配比来调控纳米粒子的粒径，粒径在66-320nm间。配方简单，成本低，工艺流程短，易于放大。且本发明所得的纳米粒子有很强的清除自由基的能力，明显强于通常在抗氧化领域使用的聚多巴胺材料，有望作为新的抗氧化添加剂以及药物使用。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，一种人造真菌黑素纳米粒子，以及其在抗氧化中的应用。

一方面，本发明提供一种真菌黑色素纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

在空气氛围下，将黑色素前体溶于溶剂中，搅拌得A溶液。

将自由基引发剂溶于水中，得B溶液。

在搅拌下将B溶液缓慢加入A溶液中，混合均匀，将混合液于搅拌下在金属浴上加热升温反应，得反应液。

将反应液离心，沉淀清洗超声分散后再次离心，重复多次，得到人造真菌黑色素纳米粒子。

将人造真菌黑色素纳米粒子在去离子水中分散保存。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，黑色素前体为二羟基萘(萘二酚)及其各类衍生物或萘酚及其各类衍生物中的任意一种或几种组合的混合物。具体的，为1，8-二羟基萘、2，7-二羟基萘、2，6-二羟基萘、1，5-二羟基萘、1，4-二羟基萘、2，3-二羟基萘、1-萘酚、2-萘酚等。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，所述黑色素前体为1，8-二羟基萘。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，所述溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃或二氧六环和水的混合溶液。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，所述溶剂为乙腈和水的混合溶液。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，所述的自由基引发剂为引发温度在100℃以下的水溶性和油溶性自由基引发剂，具体的，为过硫酸盐、偶氮二异丁脒盐酸盐、偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过氧化二苯甲酰。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，所述的自由基引发剂为过硫酸铵。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，所述1，8-二羟基萘在混合溶液中的浓度为0.5-2mg/mL。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，所述1，8-二羟基萘在混合溶液中的浓度为1-1.5mg/mL。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，混合溶液中1，8-二羟基萘和过硫酸铵摩尔比为4:1-1:2。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，混合溶液中1，8-二羟基萘和过硫酸铵摩尔比为2:1-1:1。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，所述乙腈和水的混合溶液，其中乙腈和去离子水的比例为2:15。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，反应温度为25-80℃。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，反应温度为50-65℃。

进一步的，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，反应时间为1-24h。

进一步的，本发明的真菌黑色素纳米粒子的制备方法，反应时间为12-20h。

进一步的，本发明的真菌黑色素纳米粒子的制备方法，所述A液和B液的溶剂比为5:1，及A液的溶剂和B液的水比为5:1。

进一步的，本发明的真菌黑色素纳米粒子的制备方法，得到真菌黑色素纳米粒子粒径为70-300nm。

另一方面，本发明还提供一种人造真菌黑色素纳米粒子，由上述的方法制备而成。

另一方面，本发明还提供一种人造真菌黑色素纳米粒子在抗氧化中的应用，有上述的方法制备而成的真菌黑色素纳米粒子作为抗氧化添加剂。

本发明采用上述的技术方案，取得了如下的技术效果。

本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，其反应不同于常规的氧化反应，而是创造性的采用了过硫酸铵分解，产生的自由基引发聚合。

本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，配方简单，成本低，工艺流程短，易于放大。

本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，且副反应相对氧化法和酶催化法要少，可以避免材料因过度氧化而使其抗氧化能力减弱，或是因酶进入材料中造成污染。

本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，相对氧化法和酶催化法整个聚合过程更加可控。反应快慢可通过调节自由基引发剂的分解产生自由基的速率来控制，比如用温度和浓度来控制，或是用溶剂体系加以控制。

本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，不需要额外加入高分子及水溶性表面活性剂，就可以调节粒径。

本发明的人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，在聚合过程中，交联并不是最重要的，最重要的是寡聚物之间的组装过程，本发明的溶剂体系一则可以溶解真菌黑色素的前体1，8-二羟基萘，二是可以促进其组装形成合适的聚集态，从而控制纳米粒子的形貌和大小。

本发明的人造真菌黑色素纳米粒子，作为抗氧化剂的应用，纳米粒子粒径均一，且大小可以根据情况进行调配，而且没有对细胞没有明显的毒性，且在自由基清除方面的能力强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1其为实施例1至实施例4的方法获得的人造真菌黑色素纳米粒子的SEM图，粒径统计图和产率图；

图2为实施例1，和实施例5至实施例7的人造真菌黑色素纳米粒子的SEM图，粒径统计图和产率图；

图3为实施例1，和实施例8至实施例10的人造真菌黑色素纳米粒子的SEM图，粒径统计图和产率图，

图4为实施例11至实施例17的人造真菌黑色素纳米粒子的SEM图，粒径统计图和产率图；

图5为实施例18至21的人造真菌黑色素纳米粒子的SEM图；

图6为实施例1和对比例的人造真菌黑色素纳米粒子及聚多巴胺纳米粒子的SEM图；

图7为中实施例1合成的人造真菌黑色素以及对比例合成的聚多巴胺纳米粒子的EPR谱图；

图8为对实施例1对比例的人造真菌黑色素纳米粒子及聚多巴胺纳米粒子自由基清除能力结果。

具体实施方式

申请人在研究中发现，真菌黑色素在聚合过程中，交联并不是最重要的，最重要的是寡聚物之间的组装过程，溶剂体系会极大的影响这一过程，不合适的溶剂体系一则无法溶解真菌黑色素的前体，二是无法促进其组装形成合适的聚集态，即不能控制纳米粒子的形貌和大小。因此，本发明中，在合适的溶剂条件下，自由基引发剂在加热条件下分解产生自由基，黑色素前体例如1，8-二羟基萘的酚羟基捕获自由基并发生电子转移而形成1，8-二羟基萘的自由基，该自由基之间可以通过电子的转移而偶联通过碳碳键形成1，8-二羟基萘的二聚体。进一步的可以得到三聚体、寡聚体，寡聚体通过自组装以及共价交联最终形成人造真菌黑色素纳米粒子。不需要额外加入高分子及水溶性表面活性剂，就可以调节粒径，合适的溶剂体系和反应调价，达到了控制粒径的效果。

以上为本发明的基础思路，在此基础上，通过以下实施例和实验例，对本发明的内容进行进一步的阐述。

本发明中的原料及来源：1，8-二羟基萘98％，盐酸多巴胺98％，偶氮二异丁脒盐酸盐97％，1，5-二羟基萘97％，2，7-二羟基萘97％购自安耐吉化学(萨恩化学技术(上海)有限公司)；

氨水(25％)、乙醇、乙腈、过硫酸铵(分析纯)购买于成都科隆化学品有限公司；

2，2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)97.0％购买于阿拉丁试剂(上海)有限公司。

实施例1

一种人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：

在空气氛围下，将200mg的黑色素前体1，8-二羟基萘溶于乙腈和水的溶剂中，其中乙腈20mL，去离子水150mL，搅拌约10分钟得A溶液。

将自由基引发剂过硫酸铵142mg溶于30ml水中得B溶液。

在搅拌下将B溶液缓慢加入A溶液中，混合均匀，此时1，8-二羟基萘浓度约为1mg/mL。将混合液于搅拌下在金属浴上加热升温至50℃，反应20小时，得反应液。

将反应液在离心机上以12000rpm的转速离心5分钟，沉淀用去离子水清洗超声分散后再次离心，重复三次以清洗干净得到人造真菌黑色素纳米粒子。

最后将人造真菌黑色素纳米粒子在去离子水中分散以一定浓度保存，所得的纳米粒子粒径为100±10nm，记为PDHN。

实施例2至实施例17

实施例2至实施例17基本和实施例1相同，区别在于1，8-二羟基萘和过硫酸铵的用量，以及温度和反应时间，详见下表。

实施例18至实施例21

实施例18至实施例21其余和实施例1类似，区别在于，采用的黑色素前体和引发剂不同。其中实施例18中，自由基引发剂为偶氮二异丁脒盐酸盐，黑色素前体为引发1，5-二羟基萘。实施例19中，自由基引发剂为过硫酸钾，黑色素前体为1，5-二羟基萘。实施例20中，自由基引发剂为偶氮二异丁脒盐酸盐，黑色素前体为2，7-二羟基萘。实施例21中，自由基引发剂为偶氮二异丁脒盐酸盐，黑色素前体为发2，6-二羟基萘。

其中，黑色素前体的用量为使其在混合如液中的浓度为1mg/mL，自由基引发剂的用量为黑色素前体与其用量摩尔比为2:1。

参见图1，其为实施例1至实施例4的方法获得的纳米粒子的SEM图，粒径统计图和产率图，a，b，c，d分别对应实施例2，实施例1，实施例3和实施例4的SEM图，e为对应的SEM粒径统计图，f为对应的产率图。其中1，8-二羟基萘和过硫酸铵摩尔比分别为4:1，2:1，1:1和1:2，最终得到的粒子粒径在75～243nm。

参见图2，为实施例1，和实施例5至实施例7的纳米粒子的SEM图，粒径统计图和产率图，a，b，c，d分别对应实施例5，实施例1，实施例6和实施例7的SEM图，e为对应的SEM粒径统计图，f为对应的产率图。其中，1，8-二羟基萘浓度分别为0.5mg/mL，1mg/mL，1.5mg/mL，2mg/mL，最终得到的粒子粒径在84～320nm。

参见图3，为实施例1，和实施例8至实施例10的纳米粒子的SEM图，粒径统计图和产率图，其中附图5中，a，b，c，d分别对应实施例8，实施例1，实施例9和实施例10的SEM图，e为对应的SEM粒径统计图，f为对应的产率图。其中，其反应温度分别为25℃，50℃，65℃，80℃，最终得到的粒子粒径在86～124nm。

参见图4，为实施例11至实施例17的纳米粒子的SEM图，粒径统计图和产率图，其中附图7中，a，b，c，d，e，f，g分别对应实施例11至17的SEM图，e为对应的SEM粒径统计图，f为对应的产率图。其中，其反应时间分别为1h，2h，4h，6h，8h，12h，24h，最终得到的粒子粒径在66～109nm。

参见图5，为实施例18至21的纳米粒子的SEM图。其中a，b，c，d，分别对应实施例18至实施例21的SEM图。

在抗氧化方面粒径小的纳米粒子拥有更大的比表面积因而能在相同质量下拥有更好的抗氧化能力，在合成时还需要考虑产率和粒径均一性的问题。

通过上述图可以看出，单体和自由基引发剂的比例越低，即引发剂越多的情况下，粒径和产率均会随之增加，但引发剂过多会使反应过快，容易导致组装过程出现二次成核而使粒径分布不均。控制其摩尔比在1：2和1：1条件下产率和粒径都能获得一个良好的平衡。

保持单体和引发剂摩尔比不变增加单体浓度也可以有效增加粒径和产率，从产率来看单体浓度在1～1.5mg/mL比较合适，浓度太大首先单体无法溶解，其次过大的粒径不利于其在抗氧化方面的应用。

温度越高自由基引发剂分解产生自由基越快，同时单体的聚合过程也越快，综合来说粒径和产率都随温度上升而缓慢增加，其中粒径在温度较高时会基本不变，考虑到能源消耗以及安全性，控制温度在50～65℃间较为合适。当然如果换用其他引发剂和溶剂体系，具体的温度本领域人员可以视引发剂引发温度而定。

延长反应时间也可以在一定程度上增加粒径和产率，但随着自由基引发剂分解完全再延长反应时间没有意义，所以综合考虑下在12-20小时是比较合适的。

对比例

为了证明材料PDHN在自由基清除方面的优势，制备粒径相近的聚多巴胺纳米粒子(PDA)进行对比。

聚多巴胺纳米粒子制备方法：于空气氛围中，将250mg盐酸多巴胺溶于100mL去离子水中，加入40mL乙醇，搅拌30分钟混合均匀。

搅拌下加入氨水0.8mL调节pH，反应12小时后对反应液离心处理。

转速为14000rpm，用去离子水清洗3次。

所得的聚多巴胺纳米粒子(记做PDA)尺寸为114±10nm。

实验例：

SEM图

参见图6，为实施例1和对比例的纳米粒子的SEM图。

抗氧化活性测试

电子顺磁共振(EPR)方法被广泛应用于黑色素这类拥有抗氧化活性材料的研究中，通过对合成的人造真菌黑色素纳米粒子EPR的测定和自由基清除实验可以评估其抗氧化活性。

EPR的测定方式如下：仪器为Bruker EPR EMX_Plus。波谱仪在X-band(9.85GHz)下运行，并且在0.1mW的功率下以100kHz场调制获得谱图。其中实施例1合成的人造真菌黑色素以及对比例合成的聚多巴胺纳米粒子的谱图如图7所示，与曾报道过的人造真菌黑色素以及聚多巴胺的EPR谱图类似。该谱图表明了本申请的人造真菌黑色素中存在稳定的自由基。

EPR谱图中本发明的人造真菌黑色素的EPR信号明显强于对比例的聚多巴胺，表明其具有更好的稳定自由基的能力。侧面可以反应其拥有更好的抗氧化能力。

自由基清除实验

自由基清除实验操作方式如下：使用纯度为97.0％的2，2-二苯基-1-苦肼基(DPPH)测定来评估人造真菌黑色素纳米粒子(PDHN)的自由基清除活性。现配浓度为0.1mM的DPPH乙醇溶液，取8mL，往其中加入50μL 1mg/mL的人造真菌黑色素纳米粒子水分散液。通过测量反应体系随时间推进在517nm处的吸光度变化来评估清除活性，5分钟取一个样品点进行测试，持续30分钟。

对实施例1对比例得到的聚多巴胺纳米粒子进行上述相同的自由基清除能力测试。对比例PDA和实施例1的PDHN的自由基清除能力结果如图8所示。

自由基清除实验中同时间下清除程度越高就表明材料的抗氧化能力越好，其中本发明实施例的1，8-二羟基萘聚合得到的人造真菌黑色素纳米粒子有着明显强于对比例的聚多巴胺的自由基清除能力，表明其具有更好的抗氧化能力。

结果表明，本发明利用自由基引发剂可成功合成具有优异抗氧化能力的人造真菌黑色素材料，通过扫描电镜可以观察到材料在大多反应条件下粒径均一，并且通过参数调整可以得到明显不同的粒径大小，可以此来调控粒径获得所需尺寸的人造真菌黑色素纳米粒子。

进一步地，本发明的人造真菌黑色素纳米粒子具有明显强于聚多巴胺的自由基清除能力，在抗氧化方面或许会有比聚多巴胺更好的应用前景。

本说明书中各个实施例采用并列和递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (11)

1.一种人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

在空气氛围下，将黑色素前体溶于溶剂中，搅拌得A溶液；

将自由基引发剂溶于水中得B溶液；

在搅拌下将B溶液缓慢加入A溶液中，混合均匀，将混合液于搅拌下在金属浴上加热升温反应，得反应液；

将反应液离心，沉淀清洗超声分散后再次离心，重复多次，得到人造真菌黑色素纳米粒子；

将人造真菌黑色素纳米粒子在去离子水中分散保存。

2.根据权利要求1所述的一种人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述黑色素前体为二羟基萘及其各类衍生物或萘酚及其各类衍生物中的任意一种或几种组合的混合物；

所述自由基引发剂为过硫酸盐、偶氮二异丁脒盐酸盐、偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯或过氧化二苯甲酰；

所述溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、四氢呋喃或二氧六环和水的混合溶液。

3.根据权利要求1所述的一种人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述黑色素前体为1，8-二羟基萘，所述自由基引发剂为过硫酸铵，所述溶剂为乙腈和水的混合溶液。

4.根据权利要求3所述的一种人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述黑色素前体在混合液中的浓度为0.5-2mg/mL。

5.根据权利要求2或3所述的一种人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，其特征在于：混合溶液中黑色素前体和自由基引发剂摩尔比为4:1-1:2。

6.根据权利要求2或3所述的一种人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述乙腈和水的混合溶液，其中乙腈和去离子水的比例为2:15。

7.根据权利要求2或3所述的一种人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，其特征在于：反应温度为25-80℃。

8.根据权利要求2或3所述的一种人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，其特征在于：反应时间为1-24h。

9.根据权利要求2或4所述的一种人造真菌黑色素纳米粒子的制备方法，其特征在于：所述A液和B液的溶剂比为5:1。

10.一种人造真菌黑色素纳米粒子，其特征在于：由权利要求1至9任一的方法制备。

11.一种人造真菌黑色素纳米粒子在抗氧化中的应用，其特征在于：上述的方法制备而成的人造真菌黑色素纳米粒子作为抗氧化添加剂。

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