CN113522269A - 基于Zn2V2O7纳米晶的生物催化剂及其在制备仿酶制剂和抗菌药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂及其在制备仿酶制剂和抗菌药物中的用途，属于抗菌药物领域。该生物催化剂是钒掺杂ZIF‑8前驱体热处理后得到的，其中含Zn₂V₂O₇纳米晶体。该生物催化剂具有良好的仿氧化酶活性、仿过氧化物酶活性和仿卤素过氧化物酶活性，能够用来制备高催化活性的仿酶制剂。此外，该生物催化剂不仅在体外对耐药细菌MRSA具有良好的抗菌活性，还能在体内有效地杀死MRSA并促进MRSA细菌感染的动物皮肤伤口愈合。本发明提供的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂是一种非抗生素材料，而且具有优良的生物相容性，其能够解决抗生素滥用带来的细菌耐药问题，在制备仿生材料和抗菌药物中具有广阔的应用前景。

Description

基于Zn2V2O7纳米晶的生物催化剂及其在制备仿酶制剂和抗菌 药物中的用途

技术领域

本发明属于抗菌药物领域，具体涉及一种基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂及其在制备仿酶制剂和抗菌药物中的用途。

背景技术

目前，细菌耐药已成为全球范围的重大公共健康问题，抗生素的滥用是造成细菌耐药的重要原因。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcusaureus，简称“MRSA”)具有多重耐药性并伴有高发病率和高死亡率，是导致坏死性肺炎、严重败血症、坏死性筋膜炎等疾病的重要致病菌，是医院感染和社区感染的重要病原菌之一，给临床治疗带来了极大的困难。MRSA对绝大多数的抗菌药物或制剂耐药，甚至对目前临床抗耐药菌最为有效的万古霉素也开始出现耐药，一旦MRSA 发展到对万古霉素普遍耐药的程度，感染MRSA的患者将面临无药可治的危险境地。因此，针对细菌耐药日趋严重的情况，亟需开发非抗生素类药物来对抗细菌。

有研究者提出可以通过化学、光动力或声动力材料产生活性氧(ROS)来作为替代的抗菌策略。在各种ROS产生材料中，仿酶催化剂(包括纳米脂质体，金属有机骨架和无机材料等)由于能够活化过氧化氢(H₂O₂)产生ROS而获得了极大的关注。然而，当以非常低的浓度处理时，现有的仿酶催化剂往往表现出细菌杀灭能力不足的问题，而高浓度的使用又容易引起对细胞的毒性，存在生物相容性差的问题。因此，开发抗菌效果更好的、生物相容性优良的非抗生素类药物对于抗耐药细菌非常重要。

林楠等(过渡金属钒酸盐纳米带、纳米棒的合成、电化学及光催化特性，安徽工业大学硕士学位论文，2016年)以乙酸锌和钒酸钠为原料，通过水热过程合成了钒酸锌纳米棒。XRD和HRTEM图像分析表明该钒酸锌纳米棒由单晶单斜Zn₂V₂O₇晶相构成，该论文通过在太阳光照射下光催化降解MB 研究了钒酸锌纳米棒的光催化活性。研究发现，在太阳光照射4h后，浓度为10mg·L^-1的亚甲基蓝溶液可以被完全降解。在太阳光照射下，该钒酸锌纳米棒在光催化降解有机污染物方面具有良好的应用前景。但是，该钒酸锌纳米棒需要在太阳光照射下才具有催化性能，限制了其应用场所，而且，该论文完全没有报道该钒酸锌纳米棒具有抗菌性能。

也有报道称V₂O₅纳米棒具有HClO产生和仿卤代过氧化物酶(HPO)活性，但是V₂O₅潜在的细胞毒性和较差的细菌捕获能力限制了其应用。因此，开发抗菌效果优良、生物相容性优良的材料对于抗耐药细菌具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂及其在制备仿酶制剂和抗菌药物中的用途。

本发明提供了一种生物催化剂，它是钒掺杂ZIF-8前驱体热处理后得到的，所述生物催化剂中含Zn₂V₂O₇纳米晶体。

进一步地，所述钒掺杂ZIF-8前驱体是以包含Zn²⁺盐、钒酸盐、有机配体、表面活性剂和溶剂在内的原料制得的。

进一步地，所述钒掺杂ZIF-8前驱体是以Zn²⁺盐、钒酸盐、有机配体、表面活性剂和溶剂为原料制得的。

进一步地，所述Zn²⁺盐为Zn(NO₃)₂或其水合物，所述钒酸盐含VO₃ ^-，所述有机配体为2-甲基咪唑，所述表面活性剂为季铵盐，所述溶剂为水；

所述Zn²⁺盐与钒酸盐的摩尔比为1:(0.2～2.0)，所述Zn²⁺盐与季铵盐的摩尔比为1:(0.01～0.50)，所述Zn²⁺盐与2-甲基咪唑的摩尔比为1:(30～80)。

进一步地，所述Zn²⁺盐为Zn(NO₃)₂·6H₂O，所述钒酸盐为NaVO₃，所述表面活性剂为溴化十六烷基三甲胺；

所述Zn²⁺盐与钒酸盐的摩尔比为1：(0.2～1)，优选为1:1，所述Zn²⁺盐与季铵盐的摩尔比为1:0.04，所述Zn²⁺盐与2-甲基咪唑的摩尔比为1:56.7。

进一步地，所述钒掺杂ZIF-8前驱体的制备方法包括以下步骤：

(1)取Zn²⁺盐、钒酸盐、表面活性剂，加入溶剂，混合均匀，得溶液1；

(2)取2-甲基咪唑，加入溶剂，混合均匀，得溶液2；

(3)将溶液1与溶液2混合均匀，静置，分离出沉淀，即得钒掺杂ZIF-8 前驱体。

进一步地，所述热处理温度为300～500℃，优选为400℃；热处理的时间为1～3小时，优选为2小时；

和/或，所述热处理是在空气中进行的。

本发明还提供了上述生物催化剂在制备仿酶制剂中的用途。

进一步地，所述仿酶制剂为仿氧化酶制剂、仿过氧化物酶制剂或仿卤素过氧化物酶制剂。

本发明还提供了上述生物催化剂在制备抗菌药物中的用途。

本发明还提供了上述生物催化剂与双氧水联用在制备抗菌药物中的用途。

进一步地，所述抗菌药物为抗革兰氏阳性菌的药物。

进一步地，所述抗菌药物为抗耐药细菌的药物。

进一步地，所述耐药细菌为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。

关于本发明的使用术语的定义：除非另有说明，本文中术语提供的初始定义适用于整篇说明书的该术语；对于本文没有具体定义的术语，应该根据公开内容和上下文，给出本领域技术人员能够给予它们的含义。

ZIF-8是一种金属有机骨架材料。

实验结果表明，本发明提供的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂具有良好的仿氧化酶(OXD)活性、仿过氧化物酶(POD)活性和仿卤素过氧化物酶(HPO)活性，在H₂O₂存在下能够大量ROS(·OH、·O₂-和HClO)，能够用来制备高催化活性的仿酶制剂。并且，与V₂O₅和ZnO基纳米生物催化剂相比，本发明基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的催化活性更高。

本发明提供的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有优异的体外抗菌活性；并且，与V₂O₅和ZnO基纳米生物催化剂相比，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的抗菌活性更高。

本发明提供的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂能够在体内有效地杀死 MRSA并促进伤口愈合；在低浓度的H₂O₂存在下，本发明基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂对MRSA具有优异的体内抗菌活性，并能加速伤口愈合，其治疗效果与万古霉素相当。

本发明提供的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂是一种非抗生素材料，其能够解决抗生素滥用带来的细菌耐药问题，对非耐药细菌和耐药细菌均具有优良的杀灭性能。此外，本发明提供的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂具有优良的生物相容性，在制备仿生材料和抗菌药物中具有广阔的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1：形貌表征结果。基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的高分辨率TEM(a) 和AC-HAADF-STEM图像(b)，a图的比例尺是50纳米，b图的比例尺是10 纳米；c.Zn₂V₂O₇结晶单体1个晶粒尺寸为2×2×2；d.Zn、V、O元素的高分辨率TEM图像及EDX映射图像，比例尺:1nm。

图2：晶体结构表征结果。(a)ZnO基纳米生物催化剂、V₂O₅、基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的XRD谱；高分辨率XPS光谱分析结果：基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂和V₂O₅中的V(b)，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂和ZnO基纳米生物催化剂中的Zn(c)；(d)基于Zn2V2O7纳米晶的生物催化剂和ZnO基纳米生物催化剂以及V₂O₅中的Zn和V的含量比。

图3：仿酶活性研究结果。仿POD酶活性：(a)TMB溶液在H₂O₂存在下与 ZnO基纳米生物催化剂、V₂O₅和基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂共孵育后的紫外-可见光谱；(b)EPR检测到基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂和ZnO 基纳米生物催化剂的·OH信号；(c)TA检测反应体系中产生的·OH；(d)EPR 记录ZnO基纳米生物催化剂、V₂O₅和基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂反应中产生典型的·O₂ ^-信号；(e)自由基猝灭实验结果，其中·OH被TBA猝灭，·O2-被BQ猝灭。仿HPO酶活性：(f)以CB为试剂检测HPO活性，用520 nm/650nm的吸光度表示。

图4：体外抗菌活性研究结果。a.各组细菌经典平板实验；b各组细菌的活/ 死荧光图像；c.各组的抑菌率统计，其中***表示与对照组相比有显著差异， p<0.001；d.通过活/死荧光图像统计细菌生存能力；e.流式细胞术分析不同条件处理后的细菌内ROS量。

图5：体内抗菌能力研究结果。a.15天内感染伤口治疗过程照片；b.各组在治疗过程中的新生血管的增殖情况统计；c、d.从H₂O₂组和基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂组的创面皮肤中提取MRSA细胞，平板计数；各组治疗后表皮组织切片的H&E染色(e)，Masson染色(f)。

图6：V掺杂ZIF-8前驱体以及热处理后基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的 SEM图像及粒径分布。a为实施例1步骤1制得的V掺杂ZIF-8前驱体的SEM 图像，b为实施例1步骤2制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的SEM 图像，c为图b的粒径分布。

图7：纯立方ZIF-8前驱体和热处理后ZnO基纳米生物催化剂的SEM图像及粒径分布。a为对照例1步骤1制得的纯立方ZIF-8前驱体的SEM图像， b为对照例1步骤2制得的ZnO基纳米生物催化剂的SEM图像，c为图b的粒径分布。

图8：V₂O₅的SEM图像。

图9：基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的TEM图像。

图10：基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的HR-HAADF STEM图像。

图11：基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂合成示意图以及抗耐药菌示意图。

图12：BET测定结果。

图13：仿氧化酶活性测试结果。其中，VO_x-AE表示实施例1制得的基于 Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂，ZnO表示对照例1制得的ZnO基纳米生物催化剂，V₂O₅为市售的V₂O₅。

图14：基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂在不同气体中的OXD活性。

图15：CCK-8法检测不同浓度基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂作用下脐静脉内皮细胞的细胞存活率。

图16：活/死荧光染色法检测不同浓度基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂作用下脐静脉内皮细胞的细胞存活情况。

图17：不同Zn、V比例下所得样品的SEM图。其中，“ZIF-8”表示对照例1 的样品，“Zn-V＝5-1”表示实施例2的样品，“Zn-V＝1-1”表示实施例1的样品，“Zn-V＝1-2”表示实施例3的样品。

图18：仿POD酶活性测试结果：TMB溶液在H₂O₂存在下与ZnO基纳米生物催化剂、实施例2制得的生物催化剂和实施例1制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂共孵育后的紫外-可见光谱。其中，“Control”表示对照组，“ZnO”表示ZnO基纳米生物催化剂，“V-ZnO”表示实施例2制得的生物催化剂，“Zn₂V₂O₇”表示实施例1制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂。

具体实施方式

本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。

其中，CTAB是十六烷基三甲基溴化铵的简称。

实施例1制备基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂

1、制备V掺杂ZIF-8前驱体

将Zn(NO₃)₂·6H₂O(0.3626g)、NaVO₃(NaVO₃与Zn(NO₃)₂·6H₂O的摩尔比为1：1)和CTAB(0.0175g)溶于18mL去离子水中，得溶液1。将2-甲基咪唑(5.6752g)溶于82mL去离子水中，得溶液2。将溶液1快速注入溶液2 中，搅拌5分钟以达到充分分散，得到悬浮液。将悬浮液在28℃下静置3 小时，离心得到沉淀，将沉淀用乙醇和纯水的混合溶液洗涤3次，然后冻干得到V掺杂ZIF-8前驱体。

2、制备基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂

将V掺杂ZIF-8前驱体在空气中加热至400℃，于400℃保持2小时后自然冷却至室温，制得基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂。

实施例2制备生物催化剂

1、制备前驱体

参照实施例1步骤1的方法，区别仅在于将NaVO₃与Zn(NO₃)₂·6H₂O 的摩尔比由1：1修改为1：5，制得前驱体。

2、制备生物催化剂

以本实施例步骤1制得的前驱体为原料，按照实施例1步骤2的热处理方法，制得对应的生物催化剂。

实施例3制备生物催化剂

1、制备前驱体

参照实施例1的方法，区别仅在于将NaVO₃与Zn(NO₃)₂·6H₂O的摩尔比由1：1修改为2：1，制得前驱体。

2、制备生物催化剂

以本实施例步骤1制得的前驱体为原料，按照实施例1步骤2的热处理方法，制得对应的生物催化剂。

为了与本发明基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂进行对照，制备了以下对照样品：

对照例1制备ZnO基纳米生物催化剂

1、制备制备纯立方ZIF-8前驱体

将Zn(NO₃)₂·6H₂O(0.3626g)和CTAB(0.0175g)溶于18mL去离子水中，得溶液1。将2-甲基咪唑(5.6752g)溶于82mL去离子水中，得溶液2。将溶液1快速注入溶液2中，搅拌5分钟以达到充分分散，得到悬浮液。将悬浮液在28℃下静置3小时，离心得到沉淀，将沉淀用乙醇和纯水的混合溶液洗涤3次，然后冻干得到纯立方ZIF-8前驱体。

2、制备ZnO基纳米生物催化剂

将纯立方ZIF-8前驱体在空气中加热至400℃，于400℃保持2小时后自然冷却至室温，得到ZnO基纳米生物催化剂。

以下通过实验例证明的有益效果。

实验例1形貌表征

1、测试样品

实施例1制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂，实施例2、3制得的生物催化剂，对照例1制得的ZnO基纳米生物催化剂，市售的V₂O₅。

2、实验方法

表征各测试样品的形貌。使用Apreo S HiVoc(Thermo Fisher Scientific, FEI)获得扫描电镜(SEM)图像。透射电子显微镜(TEM)图像和映射通过Talos F200x TEM显微镜(FEI有限公司，美国)在200kV下运行获得。用Bruker D8 聚焦x射线衍射(XRD)仪在电压为40kv的Cu辐射下，分析晶体的相态。

3、实验结果

结果如图1、图6-图10所示。可以看出，V离子的掺杂对ZnO基纳米生物催化剂的形貌有明显的影响(图7)，ZnO基纳米生物催化剂表现出均匀的收缩立方结构，而基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂表现出更大的平均尺寸和更圆的内部中空结构(100.5nm，图6)。此外，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的形貌与V₂O₅也截然不同(图8)。高分辨率高角度-环-暗场扫描透射电镜(HR-HAADF-STEM)图像(图9)进一步证实了基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂空心立方的形貌。为了进一步研究Zn₂V₂O₇晶体的原子结构，进行了畸变校正(AC)-HAADF-STEM表征。Zn₂V₂O₇纳米晶在视场上均匀分散，Zn₂V₂O₇晶粒为2×2×2尺寸的超级单体结构。标准Zn₂V₂O₇晶胞呈四面晶状体结构，由四面体配位的VO₄层状结构和扭曲的三棱锥状ZnO₅多面体组成，原子分辨率AC-HAADF-STEM所观察到的[022]、[002]和[-202]晶面的图像分别显示在图1中。Zn₂V₂O₇晶体的原子柱层序明确，显示出原子有序的金属间化合物结构，这与Zn₂V₂O₇金属间化合物相应的原子排列一致。对应的晶面距离和快速傅里叶变换(FFT)剖面显示Zn₂V₂O₇相沿[0 1-1]轴以指定的平面呈现单斜相，表明Zn₂V₂O₇晶粒的形成。原子分辨EDX图显示了对应Zn₂V₂O₇晶体中Zn和V原子的良好堆积序列。从图10中还可以推断，Zn、 V和O点均匀地分散在C-N衬底上。

另外，比较实施例1～3制得的前驱体和生物催化剂的SEM图片(图17) 可以看出，本发明实施例1所得基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂形貌更规则。

上述测试结果表明，本发明实施例1成功制得了具有空心立方形貌的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂。

实验例2晶体结构表征

1、测试样品

实施例1制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂，对照例1制得的ZnO 基纳米生物催化剂，市售的的V₂O₅。

2、实验方法

晶体的相态分析：用Bruker D8聚焦x射线衍射仪在电压为40kv的Cu 辐射下，分析晶体的相态。样品在5°～80°的2θ范围内进行扫描。过x射线光电子能谱(XPS,ESCAL 250)来检测基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的组成并确认金属的成功引入。并进行x射线吸收近边结构(XANES)和扩展x射线吸收精细结构(EXAFS)的测量。

Brunauer-Emmett-Teller(BET，比表面积)测定：氮气吸附分析是在配备了自动表面积的TriStar 3020加速表面积和孔隙测量仪上进行的，在77K 下，使用布鲁诺尔-埃米特-泰勒计算表面积和孔径分布。

3、实验结果

结果如图2和图12所示。基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂中的碳在x 射线衍射中没有衍射峰，从x射线衍射(XRD)结果可以看出(图2a)，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的所有衍射峰都与单斜晶相Zn₂V₂O₇ (JCPDS no.29-1396)相符；晶格参数

β＝111.37°，与α-Zn₂V₂O₇的晶格参数一致；此外，在2θ＝25.80°和28.59°处发现了两个明显的峰，分别对应于(022)晶面和(-202)晶面。因此，结合前文的形貌表征结果和XRD表征结果可以看出，本发明实施例1制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂中含有Zn₂V₂O₇纳米晶体。

通过x射线光电子谱(XPS)进一步证实基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂中V的价态远低于V₂O₅，说明相比于V₂O₅，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂中V已经降低了化学价态。与此同时，高分辨率观察锌元素的XPS 谱中可见锌离子的价态相比ZnO没有明显的差异，这与Zn是一种氧化态稳定的过渡金属的事实是一致的。从XPS数据计算可知，实施例1制得的基于 Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂中V原子的含量约为2.76wt.％，表明其在N-C 衬底上呈分散状态。理论上，Zn与V的原子比远高于1，这可能是ZnO在 N-C衬底上共存的结果。为了探究基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的局部配位，本发明进行了x射线吸收近边结构(XANES)和扩展x射线吸收精细结构(EXAFS)的测量。在K-edge处的XANES光谱显示，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂中V的线位置(吸收边)位于V₂O₅附近，表明V元素的价态接近V⁵⁺，这与XPS结果一致。V的傅立叶变换(FT)k3加权EXAFS谱显示主峰位于

属于V-O配位，几乎与理论Zn₂V₂O₇晶胞的计算距离相同。为了验证这一结果，本发明进行了小波变换(WT)分析，发现与V箔中V-V 键产生的强度最大值≈

不同的是，与V₂O₅标准样品类似，V-O键产生的强度最大值约为

Brunauer-Emmett-Teller(BET)N₂吸附-脱附等温线表明，Zn₂V₂O₇纳米晶体具有介孔结构；因此它具有更高的表面积，为23.51m² g^-1。高的比表面积和孔隙率有利于生物催化性能，并使其与基体有较大的接触面积(图12)。

上述实验结果表明，本发明实施例1成功制备了原子级掺杂Zn/V复合氧化物的Zn₂V₂O₇微晶生物催化剂，该生物催化剂中含Zn₂V₂O₇纳米晶体。

实验例3仿酶活性研究

1、测试样品

受试催化剂：实施例1制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂，实施例2制得的生物催化剂，对照例1制得的ZnO基纳米生物催化剂，市售的 V₂O₅。

2、实验方法

(1)用TMB测定仿过氧化物酶活性。将受试催化剂溶液(2mg·ml^-1,25 μL)加入含H₂O₂(0.1M,25μL)和TMB(10mg·ml^-1,24μL)的NaOAc-HOAc 缓冲液(100mM,pH 4.0)中。用NaOAc-HOAc缓冲液调整混合物的最终体积至2mL。然后，取混合物在652nm的吸光度下进行紫外-可见光谱测量。

(2)测定仿氧化酶活性。除了不加H₂O₂外，其余操作与仿过氧化物酶活性测定方法相同。

(3)测定仿卤素过氧化物酶活性。首先，在NaOAc/HOAc缓冲液(pH 5.8)中制备200μM的CB溶液。在1980μL的CB溶液中加入17μL受试催化剂、3μL H₂O₂和NaCl引发反应。CB、NaCl、H₂O₂和受试催化剂的最终浓度分别为200.0mM、100.0mM、0.1M和17.0μg mL^-1。通过测定天青石蓝(CB)在645～520nm波长范围内的吸收变化，研究受试催化剂的催化活性。

3、实验结果

3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)是一种典型的检测POD催化活性的比色探针。在H₂O₂存在下，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂催化TMB氧化生成氧化产物(oxTMB)，其特征吸收峰位于652nm处，强度高于ZnO基纳米生物催化剂和V₂O₅(图3)。

另外，根据图18可以看出，与实施例2制得的生物催化剂相比，实施例 1制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的POD催化活性明显提高。

对基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂、ZnO基纳米生物催化剂和V₂O₅三种受试催化剂进行Michaelis-Menten动力学曲线分析。可以看出，在一定TMB或H₂O₂浓度范围内，随着TMB或H₂O₂浓度的增加，催化反应速率也随之增加。对于底物H₂O₂，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的V_max值是 ZnO基纳米生物催化剂的近4倍，是V₂O₅的2倍；而对于TMB为底物，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的V_max值也明显高于ZnO基纳米生物催化剂和V₂O₅。也就是说，无论以TMB还是H₂O₂作底物，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的Km值都远低于ZnO基纳米生物催化剂和V₂O₅(图3)。

此外，对于基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂，从XPS数据计算出其中钒wt.％是2.76％，根据方程式TON＝V_max/[E₀]计算出TON(最大数量的单位活性催化中心)是26×10^{- 3}s^-1，明显高于大多数具有POD样活性金属氧化物和已报道过的一些单原子催化剂，如CeO₂，Fe₃O₄，MnO₂，CuO，Au，Pd， Pt。

本发明还发现，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂可以在没有H₂O₂的情况下加速TMB的氧化，模拟氧化酶(OXD)的性质(图13)。与基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂在空气饱和缓冲液中的652nm吸光度相比，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂催化的TMB氧化反应速率在O₂饱和条件下显著升高，而在Ar₂饱和条件下显著降低(图14)。

为了进一步阐明基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的催化机理，本发明采用电子顺磁共振(EPR)和特异荧光探针测定了自由基产物的类型。以5,5- 二甲基-1-吡咯啉-氧化物(DMPO)作为·OH捕获剂，在基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂和ZnO基纳米生物催化剂催化反应中观察到·OH(1:2:2:1)的特征信号。利用非发光的对苯二甲酸(TA)可以与·OH快速反应生成发光的2- 羟基对苯二甲酸(TAOH)(λem＝435nm)的原理证明了该反应体系中·OH的原位生成。从实验结果可以看出，在H₂O₂存在下，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的相对荧光强度高于ZnO基纳米生物催化剂。在H₂O₂存在下的三种催化反应中观察到·O₂ ^-的特征峰，其中基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的强度最强。然后用·O₂ ^-特异性探针氢乙二胺(HE)也证实了基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂产生·O₂ ^-的能力。HE可与·O₂ ^-反应生成荧光乙锭，乙锭可发出以610nm为中心的强荧光。此外，通过自由基猝灭实验中叔丁醇(TBA)淬灭·OH，苯醌(BQ)淬灭·O₂ ^-催化TMB的氧化过程，验证了在H₂O₂存在时，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的催化产物是·OH和·O₂ ^-，其中·OH为主要产物。

本发明还发现，除了具有仿POD和OXD酶活性外，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂还可模拟钒卤代过氧化物酶(V-HPOs)产生次氯酸。CB(天青石蓝)水溶液的特征吸收光谱在650nm处达到最大，在次卤酸存在时，650 nm处的吸光度下降，同时520nm处吸收峰升高，这是由于在氧化过程中CB 变成了一种粉红色产物。本发明以520nm/650nm的吸光度比作为判断 V-HPO活性的指标。可以看出，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂、V₂O₅和ZnO基纳米生物催化剂中，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的V-HPO 活性最高。

上述实验结果表明，本发明制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂同时具有良好的仿氧化酶活性、仿过氧化物酶活性和仿卤素过氧化物酶活性；并且，与V₂O₅和ZnO基纳米生物催化剂相比，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的催化活性更高；与实施例2制得的生物催化剂相比，实施例1制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的POD催化活性明显提高。

实验例4体外抗菌活性研究

1、测试样品

实施例1制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂，对照例1制得的ZnO 基纳米生物催化剂，市售的V₂O₅。

2、实验方法

抗菌活性检测：以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCC 43300，革兰氏阳性)为实验菌，研究模拟酶催化体系的细菌清除能力。

实验分组：(Ⅰ)Control，(Ⅱ)H₂O₂，(Ⅲ)ZnO基纳米生物催化剂+H₂O₂， (Ⅳ)V₂O₅+H₂O₂，(Ⅴ)基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂+H₂O₂。浓度：基于 Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂200μL(2mg·mL^-1)，H₂O₂ 10μL(20mM)，菌液1.79mL(1x10⁶ CUF·mL^-1)。菌液和不同材料混合后放在37℃，180转每分钟的摇床孵育2小时后将样品溶液稀释1000倍接种到在琼脂平板上，37℃孵育箱中培养24h，进行CFU计数。该实验是重复3遍。细菌存活率计算公式如下：存活率％＝C/C₀×100％

其中，C为细菌的终末数量，C₀为实验中对照组的数量。

活/死荧光染色法：荧光核酸染料碘化丙啶(PI)(λ_ex＝536nm，λ_em＝617 nm)只能穿透受损的细胞壁，用来标记死亡细菌。绿色荧光核酸染料SYTO 9(λ_ex＝488nm，λ_em＝498nm)可以穿透整个细胞膜，作为活细菌细胞的标记物。用H₂O₂或纳米晶处理后，离心采集细菌，用SYTO 9和PI在室温黑暗下染色30分钟。然后用显微镜(OLYMPUS，日本)观察细胞。

细菌形态观察：不同样品处理后，用含4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲液 (PBS)溶液在4℃下固定12h，然后用乙醇/水梯度脱水。然后，获得扫描电镜图像，观察细菌形态。

细菌体内ROS检测：按照上述步骤进行不同处理后，立即收获细菌，用 DCFH-DA在37℃黑暗中孵育30分钟。使用流式细胞仪(Beckman,Cytoflex) 观察细菌细胞，激发波长为488nm。

细菌膜通透性检测：按照上述步骤进行不同处理后，立即收获细菌，用 PI(10μg·mL-1)在黑暗中染色30分钟。用流式细胞仪(Beckman,Cytoflex)在 630nm的激发下观察染色细菌细胞的膜通透性。

3、实验结果

前文的实验结果证实了基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂表现出优异的仿POD、OXD和V-HPO性质，能够将H₂O₂转化为·OH、·O₂ ^-和ClO^-。本实验例以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)为模型细菌，研究了基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的抗菌特性。基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂被认为是通过诱导活性氧(ROS)的形成来杀死细菌的。

为了评价抗菌活性，本实验例采用经典平板计数法对抗菌性能进行定量分析。结果显示，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的最小杀菌浓度(MBC) 值为0.25mg/mL，低于ZnO基纳米生物催化剂(0.35mg/mL)和V₂O₅ (0.3mg/mL)。为进一步比较基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂和V₂O₅的抗菌性能，实验分为以下五组:I)空白组，II)H₂O₂组，III)ZnO基纳米生物催化剂 +H₂O₂组，IV)V₂O₅+H₂O₂组，Ⅴ)基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂+H₂O₂组。结果显示，V组抗菌活性最高(抗菌率达95±5％)，这是因为基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂在H₂O₂作用下可产生大量ROS(·OH、·O₂ ^-和HClO)。通过引入ROS荧光探针2′，7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)对MRSA细胞进行染色，再进行流式细胞术证明了基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂+H₂O₂组产生的ROS水平高于其他各组。为进一步研究基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的抗菌活性，采用荧光法测定其活性。红色荧光核酸染料PI(λex＝536 nm，λem＝617nm)只能穿透受损的细胞壁，用来标记死亡的细菌。相比之下，绿色荧光核酸染料SYTO 9(λex＝488nm，λem＝498nm)可以穿透完整细胞膜作为活细菌细胞的标记物。I-III组细菌大部分存活，V₂O₅组细菌大部分染成红色，而基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂组细菌几乎全部染成红色，说明基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂对MRSA的杀伤效果最好，与铺板结果一致。流式细胞计数再次证实基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂对MRSA 的杀伤力最大(死亡率为94.13％；同时，当ZnO基纳米生物催化剂和V₂O₅作用于MRSA时，细菌的死亡率下降到76.7％和85.04％。扫描电镜(SEM) 观察到未经处理的MRSA细胞呈球菌状，细胞壁光滑完整。经ZnO基纳米生物催化剂和H₂O₂处理后，一小部分细胞膜变得粗糙，而在基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂和V₂O₅组中可看到更多的细菌皱缩，细胞膜变得粗糙、凹陷。高分辨率透射电镜(HRTEM)成像揭示了基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂引起的不可逆损伤。经基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂+H₂O₂处理后，大部分细菌发生变形，甚至细胞膜碎片化，说明基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂+H₂O₂具有清除细菌能力，而ZnO基纳米生物催化剂+H₂O₂组只有一小部分细菌发生变形。

上述实验结果表明，本发明制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有优异的体外抗菌活性；并且，与V₂O₅和ZnO基纳米生物催化剂相比，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的抗菌活性更高。

实验例5体内抗菌活性研究

1、测试样品

实施例1制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂，对照例1制得的ZnO 基纳米生物催化剂，市售的V₂O₅。

2、实验方法

(1)细胞毒性评估

本实验例评估了待测样品与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的生物相容性。实验步骤如下：

CCK-8法：人脐静脉内皮细胞(HUVECs)在96孔板中孵育24h，每孔包含1×10⁵个细胞。丢弃96孔板中的培养基，然后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗。随后，将含有基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂的完全培养基连续浓度为 0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg·mL^-1加入96孔板，孵育12h。根据标准方案进行细胞计数试剂盒-8(CCK8)检测，以确定细胞活力。

活/死荧光染色法：将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以0.05、0.1、0.15、 0.2、0.25、0.3mg·mL-1的浓度与基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂共孵育 12h，分别用钙黄素-AM(calcein-AM，活细胞，绿色)染色30min。碘化丙啶 (PI,死细胞,红色)染色2-5分钟。然后在显微镜下(OLYMPUS IX83，日本)观察细胞。

(2)体内抗菌活性研究

选取雄性兔，麻醉后在背部用手术刀去除直径约1cm的皮肤组织，注入 MRSA菌液(剂量:100μL，浓度:1×10⁸CFU·mL^-1)。1天后全层皮肤内形成严重感染创面，伤口周围组织红肿，有些伤口甚至渗出脓液。在本实验中使用的H₂O₂的终浓度为0.1mM。万古霉素是现有的最有效的抗生素，在本实验中它被用来模拟传统的抗生素治疗。

将已成模的实验兔分为5组:I)PBS组，II)H₂O₂组，III)万古霉素组，IV) 基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂组，Ⅴ)基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂 +H₂O₂组。直接向脓肿区注射相应物质(基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂: 2.5mg mL^-1，100μL；万古霉素:16mg)后，观察15天内各组创面愈合过程。

3、实验结果

首先，本实验例评估了待测样品与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的生物相容性，结果表明基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂对HUVECs细胞表现出极微的毒性，特别是在低浓度(1mM)H₂O₂的情况下(图15、图16)。

从图5可以看出，治疗过程中，对照组创面愈合比其他组缓慢，基于 Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂组、基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂+H₂O₂组与万古霉素组化脓性创面逐渐恢复，表皮组织逐渐再生，其中基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂+H₂O₂组在第15天的创面愈合效果最佳。创面愈合率显示，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂+H₂O₂组第15天的创面愈合率接近 100％。第15天从创面皮肤采集MRSA细胞，用平板计数统计。可以看出，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂+H₂O₂组几乎没有菌落，而H₂O₂组有较多的菌落(约600CFU)。

本实验进一步利用病理组织学实验评估了基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂在抗感染及伤口愈合中的作用。H&E染色显示对照组炎性细胞浸润较多，部分细胞核呈分叶状(矩形框)，而基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂 +H₂O₂组与万古霉素组相似，炎性细胞浸润较少，和外周血白细胞和中性粒细胞百分比(NEUT)的含量统计相符合。用Masson染色验证在伤口愈合过程中胶原纤维的形成(蓝色)。结果显示，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂组、基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂+H₂O₂组和万古霉素组创面表皮胶原含量丰富、致密；基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂组、基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂+H₂O₂组和万古霉素组胶原体积分数(CVF)平行，高于对照组和 H₂O₂组。

CD31是一种在早期血管生成中表达的跨膜蛋白，主要用于证明内皮细胞组织的存在，并可用于评估血管生成。新生血管通常伴随着伤口愈合的过程，而新生血管内皮细胞可被CD31和DAPI染色。实验结果显示，共焦激光扫描显微镜(CLSM)借助CD31免疫荧光染色进行三维(3D)重建反映新生血管再生过程，与对照组(9±2支/mm²)和H₂O₂组(15±6支/mm2)相比，基于 Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂+H₂O₂(64±支血管/mm2)，基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂(60±3支血管/mm²)和万古霉素(63±3支血管/mm²)治疗组新毛细血管数量明显更多，创面愈合效果更好。

上述实验结果表明，本发明制得的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂能够在体内有效地杀死MRSA并快速促进伤口愈合，其治疗效果与万古霉素相当。

综上，本发明提供了一种基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂。该材料具有良好的仿氧化酶活性、仿过氧化物酶活性和仿卤素过氧化物酶活性，能够用来制备高催化活性的仿酶制剂。该材料不仅在体外对耐药细菌MRSA具有良好的抗菌活性(MBC值为0.25mg/mL)，还能在体内有效地杀死MRSA并促进MRSA细菌感染的动物皮肤伤口愈合；在低浓度的H₂O₂存在下，本发明基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂对MRSA具有优异的体内抗菌活性，并能加速伤口愈合，其治疗效果与万古霉素相当。本发明提供的基于Zn₂V₂O₇纳米晶的生物催化剂是一种非抗生素材料，而且具有优良的生物相容性，其能够解决抗生素滥用带来的细菌耐药问题，在制备仿生材料和抗菌药物中具有广阔的应用前景。

Claims (14)

1.一种生物催化剂，其特征在于：它是钒掺杂ZIF-8前驱体热处理后得到的，所述生物催化剂中含Zn₂V₂O₇纳米晶体。

2.根据权利要求1所述的生物催化剂，其特征在于：所述钒掺杂ZIF-8前驱体是以包含Zn²⁺盐、钒酸盐、有机配体、表面活性剂和溶剂在内的原料制得的。

3.根据权利要求2所述的生物催化剂，其特征在于：所述钒掺杂ZIF-8前驱体是以Zn²⁺盐、钒酸盐、有机配体、表面活性剂和溶剂为原料制得的。

4.根据权利要求3所述的生物催化剂，其特征在于：所述Zn²⁺盐为Zn(NO₃)₂或其水合物，所述钒酸盐含VO₃ ^-，所述有机配体为2-甲基咪唑，所述表面活性剂为季铵盐，所述溶剂为水；

所述Zn²⁺盐与钒酸盐的摩尔比为1:(0.2～2.0)，所述Zn²⁺盐与季铵盐的摩尔比为1:(0.01～0.50)，所述Zn²⁺盐与2-甲基咪唑的摩尔比为1:(30～80)。

5.根据权利要求4所述的生物催化剂，其特征在于：所述Zn²⁺盐为Zn(NO₃)₂·6H₂O，所述钒酸盐为NaVO₃，所述表面活性剂为溴化十六烷基三甲胺；

所述Zn²⁺盐与钒酸盐的摩尔比为1：(0.2～1)，优选为1:1，所述Zn²⁺盐与季铵盐的摩尔比为1:0.04，所述Zn²⁺盐与2-甲基咪唑的摩尔比为1:56.7。

6.根据权利要求5所述的生物催化剂，其特征在于：所述钒掺杂ZIF-8前驱体的制备方法包括以下步骤：

(1)取Zn²⁺盐、钒酸盐、表面活性剂，加入溶剂，混合均匀，得溶液1；

(2)取2-甲基咪唑，加入溶剂，混合均匀，得溶液2；

(3)将溶液1与溶液2混合均匀，静置，分离出沉淀，即得钒掺杂ZIF-8前驱体。

7.根据权利要求1～6任一项所述的生物催化剂，其特征在于：所述热处理温度为300～500℃，优选为400℃；热处理的时间为1～3小时，优选为2小时；

和/或，所述热处理是在空气中进行的。

8.权利要求1～7任一项所述生物催化剂在制备仿酶制剂中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述仿酶制剂为仿氧化酶制剂、仿过氧化物酶制剂或仿卤素过氧化物酶制剂。

10.权利要求1～7任一项所述生物催化剂在制备抗菌药物中的用途。

11.权利要求1～7任一项所述生物催化剂与双氧水联用在制备抗菌药物中的用途。

12.根据权利要求10或11所述的用途，其特征在于：所述抗菌药物为抗革兰氏阳性菌的药物。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述抗菌药物为抗耐药细菌的药物。

14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于：所述耐药细菌为耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌。

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