CN1135182A - 免疫耐受诱导剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种免疫耐受诱导剂，它包含与特异性耐受原相连接的粘膜结合分子，另外，本发明还描述了在抗特异性抗原(包括半抗原)的个体中诱导免疫耐受的方法，该抗原在所述个体中可导致不希望的免疫反应，该方法包括通过粘膜途径给所述个体施用免疫有效量的本发明的免疫耐受诱导剂。

Description

免疫耐受诱导剂
本发明涉及免疫耐受诱导剂，尤其涉及含有粘膜结合分子的诱导剂，该试剂与特异性的耐受原相连接。本发明还涉及在抗特异性抗原(包括半抗原)的个体中诱导免疫耐受的方法。本发明背景以及对现有技术的讨论
通过给脊椎动物生物体注射引入下文中称作抗原(Ag)(包括半抗原)的外源物质可以诱导免疫反应，其特征在于产生了能与所说Ag相互作用的特异性抗体(B淋巴细胞的产物)和/或生成了效应性T淋巴细胞，并在与所述Ag相遇的位点产生了被称作淋巴因子的可溶性介体。抗体和T淋巴细胞在抗敌对Ag的保护方面确实起着重要作用，但它们也参与导致宿主组织被破坏的有害过程。此为自身免疫疾病的情况，其中抗体和/或T淋巴细胞与病人自身组织Ag反应并损伤之。这也是变态反应的情况，此反应的特征在于对某一环境因素的超常免疫反应，它可导致破坏组织的炎症反应。另外，这在慢性炎症反应中的情况也是如此，此反应是由于在某些感染(如结核病、血吸虫病)中或随后引入外源颗粒(如石棉)时不能有效排除外源物质而产生的。在免疫增殖反应中情况也是如此，此反应在体内引入同种异体移植物之后发生并可导致排异现象。
开发有效治疗由不希望的或组织损伤性免疫反应(如同种异体移植排异、自身免疫疾病、对有害衍生物或外界抗原的组织损伤必变态反应)所引起疾病之方法的主要目的之一是将有害免疫过程的强度特异性地抑制或降低至可接受的水平而不影响免疫系统其余部分。
免疫耐受的主题涉及确保不存在对人体自身组分(“自身抗原”)或对任何所给外源物质的损伤性免疫反应的所有机制。
诱导免疫耐受的长期确认方法是口服抗原，这是由Wells以鸡蛋白质最先的阐明的(Wells，H.1911.Studies on the Chemistryof anaphylaxis III.Experiments with isolated proteins，especially those of hen′s egg.J.Infect.Dis.9：147)。这种常称作“口服耐受”的现象(因为最初是由口服Ag的作用证明的)的特征在于喂给或吸入抗原的动物当重新暴露于由全身途径(如注射)引入的所说抗原时会变成不应性的或降低了产生全身免疫反应的能力。概况地说，抗原结合剂粘膜或粘膜组织(如肠、肺、口腔、生殖道、鼻或眼)内可诱导全身免疫耐受现象。
与此相反，将抗原引入非粘膜组织(即例如皮肤或血液，指的是全身免疫接种)经常会导致具有上述特征的免疫反应，即全身免疫反应。
这种现象对于由粘膜途径引入的Ag是高度特异性的，在这种意义上，低反应性只能在注射过所说喂给或吸入Ag之后才能被证明，而在注射过结构不相关的Ag之后不能被证明(假如后者以前未在粘膜位点被遇到的话)。
据信吸入的抗原在肠相关的淋巴样组织中由包括肠上皮细胞和Peyer氏patch M细胞的专门化细胞吸收和加工(Owen.R.L.，andP.Nemanic.1978.Antigen processing structures of themammalian intestinal tract：an SEM study oflymphoepithelial organs.Scanning Electron Microsc.2：367-378)。据信吸入的抗原由气管上皮中类似的细胞摄入(Richardson J.Bouchard R and Ferguson CC.1976.Uptakeand transport of exogenous proteins by respiratoryepithelium.Lab.Invest 35：307-314)。当抗原与肠和肺粘膜局部微环境中的辅佐细胞、同种T辅助细胞和/或B淋巴细胞相互作用之后，会发生免疫反应，其特征在于可受几个因素影响，包括抗原的特性、所涉及辅佐细胞和淋巴细胞的类型以及宿主的遗传背景。然而，吸入抗原也会导致免疫耐受状态的产生，此种情况的特征在于：即使通过非粘膜途径(如非肠道注射)将起初在消化道粘膜或呼吸道粘膜中遇到的抗原再次引入生物体也不会在非粘膜组织产生免疫反应。由于这种现象对最初摄入或吸入的抗原而言特异性很强，因此不会影响抗其它抗原的全身免疫反应的产生，其用途已成为越来越有吸引力的策略。以预防并可能治疗与抗非粘膜组织中遇到的特异抗原而产生的不适当的和/或超常免疫反应相关的由之引起的疾病。
粘膜诱导的全身耐受现象可涉及所有类型的免疫反应，已知全身引入Ag可诱导这些免疫反应，如抗体的产生，抗所述Ag的细胞介导的免疫反应的产生。因此建议使用粘膜诱导的免疫耐受策略以防止或降低对化学药物的变态反应强度(Chase，MW.1946.Inhibitionof experimental drug allergy by prior feeding of thesensitizing agent.Proc.Soc.Exp.Boil.61：257-259)。它也可能防止或降低对全身引入的可溶性蛋白质抗原以及颗粒抗原(如通过口服红细胞引入实验动物和人的红细胞)之免疫反应的强度(Thomas HC and Parrot DMV 1974.The induction oftolerance to soluble protein antigens by oraladministration.Immunology 27：631-639；Mattingly，J.and Waksman B.1978.Immunological suppression afteroral administration of antigen.Specific suppressorcells found in rat Pryer′s patches after oraladministration of sheep erythrocytes and their systemicmigration.J.Immunol.121：1878；Bierme.S.J.，Blanc，M.，Abbal，M.，Fournie，A.1979.Oral Rh treatment forseverely immunized mothers.Lancet，1：605-606)。
使用粘膜诱导的全身耐受现象可降低或抑制抗外源抗原以及自身抗原的免疫反应，自身抗原也即宿主组织所衍生的组分。因此通过将自身抗原粘膜沉积于肠(经喂给)或呼吸道(经抗原雾化或鼻内滴注)粘膜即可降低多种动物系统中实验诱导的自身免疫疾病强度。因此已证明口服II型胶原(在关节软骨中发现的占优势的胶原类型)可抑制或降低实验性自身免疫关节炎的强度，在啮齿类动物的某些品系中通过注射II型胶原以及Freund氏完全佐剂或仅注射结核分枝杆菌(前者佐剂的成分)可诱导此病(Thompson，HSG and Staines，NA，1986，Gastric administration of type II collagen delaysthe onset and severity of collagen-induced arthritisin rats.Clin.Exp.Immunol.64：581；Nagler-Anderson.C.，Bober LA，Robinson，ME.Siskind GW，Thorbecke GJ.1986.Suppression of type II collagen-induced arthritis byintragastric administration of soluble type II collagen.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：7443；Zhang，JZ，Lee，CSY，Lider，O.and Weiner HL.1990.Suppression of adjuvantarthritis in Lewis rats by oral administration oftype II collagen.J.Immunol.145：2489-2493)。同样，口服S-抗原(一种视网膜自身抗原，当注射给动物时可诱导一种形式的眼色素层视网膜炎)也可以抑制实验形式的自身免疫眼色素层视网膜炎(Nussenblatt，RB，Caspi，RR，Mahdi R.Chan，CC，Roberge，R.，Lider，O.，Weiner，HL.1990，Inhibition of S-antigeninduced experimental autoimmune uveoretinitis by oralinduction of tolerance with S-antigen.J.Immunol，144：1689-1695)。实验性自身免疫脑炎是慢性复发性脱髓鞘疾病，在啮齿动物的某些品系中通过注射纯化的髓鞘碱性蛋白质或粗制的脊髓组织匀浆以及佐剂可诱导此病，如果通过口服(喂给)或呼吸道(烟雾剂)途径给予动物MBP或MBP片段即可部分或完全抑制此病(Bitar DM and Whitacre CC.1988.Suppression ofautoimmune encephalomyelitis by the oral administrationof myelin basic protein.Cell Immunol.112：364；HigginsPJ and Weiner HL.1988.Suppression of experimentalautoimmune encephalitis by oral administration ofmyelin basic protein and its fragments.J.Immunol.140：440-445；Weiner HL.Al-Sabbagh A and Sobel R.1990.Antigen driven peripheral immune tolerance：suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE)by aerosol administration of myelin basicprotein.FASEB J(Abstr.)4(7)：2102)。另外据报道口服胰岛素可抑制小鼠自身免疫糖尿病(Zhang ZJ.Davidson L.Eisenbarth G and Weiner HL.1991，Suppression ofdiabetes in non obese diabetic mice by oraladministration of porcine insulin.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)88：10252-10256)。最近发现口服乙酰胆碱受体之后可达到抑制实验性自身免疫重症肌无力的目的(Wank ZY.Qiao J andLink H.1993，Suppression of experimental autoimmunemyasthenia gravis by oral administration ofacetylcholine receptor.J.Neuroimmunol.44：209-214)。
还证明了小鼠经肠施用血吸虫卵可防止肝和肠肉芽肿反应的产生或降低其强度，此反应是T细胞介导的慢性炎症免疫反应，在寄生虫血吸虫侵染的过程中，血吸虫卵周围会产生此反应(Weinstock JV.Blum AM and Kassab JT.1985.Induction of granulomamodulation in murine schistosomiasis mansoni by entericexposure to schistosome eggs.J.Immunol.135：560-563)。
同样，已建议口服抗原以防止和/或治疗对普通变应原(如居室灰尘成分或存在于禾本科植物花粉中的物质)的变态反应(RebienW.Puttonen E.Maasch HJ.Stix E and Wahn U.1982.Clinical and immunological response to oral andsubcutaneous immunotherapy with grass pollen extracts.A prospective study.Eur.J.Pediatry 138：341-344；Wortmann F.1977.Oral hyposensitization of Childrenwith pollinosis or house dust asthma.Allergol etImmunopathol.5：15-26)。
尽管上述例子表明粘膜服用外源以及自身抗原可提供一便利的方法从诱导特异性的免疫耐受，但实践中的困难始终局限了大规模治疗人的方法以及兽医药的实用性。
实际上，如果粘膜诱导的免疫耐受在临床上有广泛的实用性，那么它对疾病过程自身已确定的病人和/或可能已存在组织破坏性免疫细胞的病人必须也是有效的。当考虑到在遭受或倾向于自身免疫疾病，变态状态或对持续存在衍生物的慢性炎症反应的病人中诱导耐受的策略时，这一点尤其重要。粘膜诱导耐受的最新方法在抑制确定状态的全身免疫敏感作用表达的方面取得了有限的成功(Hansson DG，VazNM.Rawlings LA and Lynch JM.1979.Inhibition ofspecific immune responses by feeding protein antigens，II.Effects of prior passive and active immunization，J.Immunol.122：22612266)。
最重要地，由于目的在于诱导抗有害病原体之免疫应答的粘膜疫苗的相似性，通过粘膜使用大多数抗原以诱导全身免疫耐受需要相当量的耐受原/抗原，除非耐受原/抗原在长时间内重复施用，否则免疫耐受的期限相对较短。可能的解释是大多数抗原在进入粘膜组织前被广泛降解和/或以不充足的量被吸收。因此可大胆地假定只有具备已知的粘膜结合特性的分子(粘膜结合分子的例子列于下表I，也可见于文献中，如Mirelman D.1986.Microbial lectins andagglutinins，Properties and biological activity.pp.84-110，Wiley，New York)通过粘膜途径，如口服途径被施用时可诱导局部和全身免疫反应，而不会诱导全身免疫耐受(de AizpuruaHJ and Russell-Jones GJ.1988.Oral vaccination.Identification of Classes of proteins that provoke animmune response upon oral feeding.J.Exp.Med.167：440-451)。一个值得注意的例子是霍乱毒素。它是目前已知的最强的粘膜免疫原之一(Elson CO and Ealding W.1984.Generalizedsystemic and mucosal immunity in mice after mucosalstimulation with cholera toxin.J.Immunol.132：2736)，当通过口服途径将其与一非相关抗原同时施用时也可防止诱导对所述抗原的全身免疫耐受(Elson CO and Ealding W.1984.Choleratoxin did not induce oral tolerance in mice and.abrogated oral tolerance to an unrelated antigen.J.Immunol.133：2892)。
根据这些研究成果，建议粘膜施用与粘膜结合分子，如霍乱毒素或其粘膜结合片段霍乱毒素B区单位连接的抗原以诱导局部和全身免疫反应而不是全身耐受(Mckenzie SJ and Halsey JF.1984.Cholera toxin B subunit as a carrier protein tostimulate a mucosal immune response.J.Immunol.133：1818-1824；Nedrud JG.Liang X，Hague N and Lamm ME.1987，Combined oral/nasal immunization protects micefrom Sendai Virus infection.J.Immunol.139：3484-3492；Czerkinsky C.Russell MW.Lycke N.Lindblad M andHolmgren J.1989，Oral administration of a streptococcalantigen coupled to cholera toxin B subunit evokesstrong antibody responses in salivary glands andextramucosal tissues.Infect.Immun.57：1072-1077；deAizpurua HJ and Russell-Jones GJ.1988.OralVaccination Identification of classes of proteins thatprovoke an immune response upon oral feeding.J.Exp.Med.167：440-451；Lehner T.Bergmeyer LA.PanagiotidiC.Tao L.Brookes R.Klavinskis LS.Walker P.Walker.J.Ward RG et al.1992.Induction of mucosal and systemicimmunity to a recombinant simian immunodeficiencyviral protein.Science 258(5036)：1365-1369)。
本发明的描述
已确定的看法是：粘膜施用与粘膜结合分子连接的抗原可诱导局部和全身免疫反应，与此相反，本发明人惊奇地发现通过各种粘膜(口腔、鼻内、阴道、直肠)途径施用的抗原，当与粘膜结合分子连接时，可增强对所说抗原全身免疫耐受的诱导。
因此本发明涉及免疫耐受诱导剂，它包含与特异性耐受原连接的粘膜结合分子。
术语“免疫耐受”此处定义为宿主对特异性耐受抗原免疫反应性的降低。在本发明书和权利要求书中将这种耐受抗原称作耐受原，这与确立的专有名词是一致的。
在本发明的一个实施方案中，所述粘膜结合分子选自衍生于细菌毒素，细菌菌毛、病毒粘附蛋白和植物凝血素的粘膜结合结构的粘膜结合分子。所说细菌毒素的粘膜结合结构优选自含有霍乱毒素和大肠杆菌热不稳定性肠毒素的组中，在优选的实施方案中，所述粘膜结合结构是毒素的结合片段，尤其是霍乱毒素或大肠杆菌热不稳定性肠毒素的B亚单位。
可用于本发明的免疫耐受诱导剂的粘膜结合分子，其类与型的例子列于表I。
                表I
粘膜结合分子类与型的例子A.细菌毒素及其结合亚单位或片段
例如：霍乱毒素、霍乱B亚单位；
      大肠杆菌热不稳定性肠毒素(LT)、
      LT B亚单位；
      百日咳杆菌毒素、亚单位S2、S3、S4和/或S5；
    百喉毒素、DTB片段
    志贺毒素、志贺样毒素及B亚单位B.细菌菌毛例如：大肠杆菌；K88、K99、987P、F41、CFA/I、CFA/II；
    (CS1、CS2和/或CS2)、CFA/IV(CS4、CS5和/或CS6)、
    P菌毛等；
    霍乱弧菌毒素-共调节毛(TCP)、甘露糖敏感型血细胞
    凝集素(MSHA)、黑角藻糖敏感型血细胞凝集素(FSHA)
    等百日咳杆菌丝状血细胞凝集素；C.病毒吸附蛋白质例如：流感和仙台病毒血细胞凝集素
    HIV gp120D.动物凝血素和凝血素样分子例如：免疫球蛋白
    钙-依赖型(C-型)凝血素；
    可溶性乳糖结合(S-型)凝血素；
    选择蛋白；
    收集蛋白；
    螺旋pomatia血细胞凝集素E.植物凝血素例如：伴刀豆球蛋白A
    小麦胚凝集素
    植物血细胞凝集素
    相思豆毒蛋白
    蓖麻毒蛋白
在本发明的另一实施方案中，本发明免疫耐受诱导剂中与粘膜结合分子连接的特异耐受原选自包括半抗原的特异抗原，此抗原在个体中可导致不希望的免疫反应。在本发明优选的实施方案中，所说抗原选自含有蛋白质、肽类、糖类、脂类和核酸的组中。
所指的不希望的免疫反应与全身性抗体的产生和/或延迟型超敏感性相关，经常还与自身免疫疾病，变态反应性疾病，组织或细胞移植物排异事件和/或急性或慢性炎症反应或疾病相关。
在根据本发明的免疫耐受诱导剂中，特异的耐受原和粘膜结合分子直接或间接相互连接。
在本发明的实施方案中，所述耐受原和所述粘膜结合分子在下组成员之一的协助下间接地相互连接，该组包含间隔分子、含有所述耐受原/抗原(包括半抗原)的保护性载体或所说间隔分子与所述耐受原/抗原(包括半抗原)的杂合分子，该杂合分子可以经表达融合基因或核苷酸序列得到。在本发明优选的实施方案中，所述间隔分子选自对所说耐受原或含有耐受原的载体以及所述粘膜结合分子中任一者或两者具有结合亲和力的分子。这种间隔分子的特殊例子是抗体。在本发明优选的实施方案中，间隔分子是GM1的神经节苷脂、半乳糖基-N-乙酰基-氨基半乳糖基-(唾液酸)-半乳糖基葡糖神经酰胺的霍乱毒素结合结构或衍生于这些结构。
在本发明的免疫耐受诱导剂中，只要所述耐受原和所述分子可行使它们各自的功能，特异的耐受原与粘膜结合分子连接的方式就不重要。因此，用简单的化学方法即可将它们直接相互连接。将诸如霍乱毒素B亚单位(CTB)或大肠杆菌热不稳定性肠毒素B亚单位(LTB)的蛋白质连接到脂类、半抗原、糖类、核酸以及包括抗体和合成肽类的其它蛋白质上的化学方法是本技术已知的(例见Carlsson J etal 1978.Biochem.J.173：723-737；Cumber JA et al.1985.Methods in Enzymology 112：207-224，Walden Pet al.1986.J.Mol.Cell Immunol.2：191-197；GordonRD et al.1987.Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84：308-312；Avrameas S and Ternynck T.1969.Immunochemistry6：53；Joseph KC.Kim SU.Stieber A.Gonatas NK.1978.Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：2815-2819；Middlebrook JLand Kohn LD(eds).1981.Receptor-mediated binding andinternalization of toxins and hormones.Academic Press.New York.pp 311-350)。耐受原基因也可与CTB(或LTB)基因融合(Sanchez J.Svennerholm A-M and Holmgren J.1988.Genetic fusion of a non-toxic heat-stableenterotoxin-related deca-peptide antigen to choleratoxin B subunit.FEBS Letters241：110-114)，然后可在适当的表达系统，如细菌、酵母或病毒中表达所得的嵌合基因。另外，耐受诱导剂可含有编码耐受原的核酸序列(DNA或RNA)或合成多聚核苷酸的片段，利用宿主粘膜组织细胞确保将相应的基因转录和/或翻译成成熟蛋白质的能力。可将得到的耐受原与粘膜结合分子化学连接(Rohrbaugh ML and McGowan JJ.1993.Gene-transferfor therapy and prophylaxis of HIV-1 infection.Ann.N.Y.Acad.Sci.Vol 685.pp 697-712；Nabel GJ andFelgner PL.1993.Direct gene-transfer for immunotherapyand immunization.Trends in Biotechnology Vol 11 No.5.pp 211-215；Robinson HL.Hunt LA.Webster RG.1993.Protection against a lethal influenza-virus challengeby immunization with a hemagglutinin-expressing plasmidDNA.Vaccine 11：957-960；Martinon F.Krishnan S.LenzenG.Magne R.Gomard E.Gruillet JG.Levy JP and MeulienP.1993.Eur.J.Immunol.23：1719-1722)。另一种可选择的呈递形式为将耐受原或其核酸前体掺入保护性载体(如脂质体或等量的可生物降解的载体)中。粘膜结合物质已经或将要吸附到载体上以使含有耐受原的载体有效结合到粘膜表面以改善耐受原的效力。以这种呈递形式，耐受原可以是游离的或与其它分子相连接。
本发明还涉及在抗特异性抗原(包括半抗原)的个体中诱导免疫耐受的方法，所述抗原在所述个体中可引起不希望的免疫反应，该方法包括经粘膜途径给所述个体施用免疫有效量的根据本发明的免疫耐受诱导剂。可在个体中引起不希望的免疫反应并在本发明的免疫耐受诱导剂中可形成特异耐受原的特异抗原的例子是：
胰岛素或其片段，包括合成肽类或相应的核酸遗传信息。
可通过粘膜途径施用本发明的免疫耐受诱导剂以防止或抑制对胰岛素的免疫反应，因此可防止或治疗自身免疫糖尿病；
髓鞘碱性蛋白质或其片段，包括合成肽类或相应的核酸遗传信息，
本发明的试剂可用于防止或抑制对髓鞘碱性蛋白质的免疫反应，因此可防止或治疗多发性硬化症。
单链或双链DNA
施用本发明的试剂可抑制对自身DNA的免疫反应以防止和/或治疗系统性红斑狼疮，此病的免疫学特点是产生了抗自身DNA的自身抗体；
抗体或其片段，包括合成肽类或相应的核酸遗传信息。
本发明的试剂可用于防止对所述抗体的免疫反应；抗体可以是IgG分子或其片段，然后经由粘膜途径施用含完整IgG或其片段作为耐受原的免疫耐受诱导剂以防止或降低对IgG分子的免疫反应，患有风湿性关节炎和相关疾病的病人情况即为如此，这些疾病的特征在于存在与自身IgG分子反应的称为类风湿因子的自身抗体。
γ球蛋白或其片段，包括合成的肽类或相应的核酸遗传信息，
经由粘膜途径施用本发明的试剂可防止或降低对所述γ球蛋白的免疫反应，情况同静脉注射γ球蛋白之前一样有利；
移植抗原或其片段，包括合成的肽类或相应的核酸遗传信息，或表达所述移植抗原的细胞，如红血细胞、血小板或淋巴细胞，
经由粘膜途径施用本发明的试剂可防止或降低对所述移植抗原的免疫反应，因此可防止排异和/或延长同种异体移植体的存活期；
如豚草花粉的变态反应性物质，
经由粘膜途径施用本发明的试剂可防止和/或降低对所述变应性物质的免疫反应，因此可预防或治疗变态反应，
细菌毒素或其片段，包括合成肽类或相应的核酸遗传信息，
经由粘膜途径施用本发明的试剂可防止对所述毒素的免疫反应，该毒素是在导致炎症和组织损伤的全身位点处遇到的；这种情况的例子是由全身施用内毒素(由革兰氏阴性细菌产生的一组脂多糖)和某些外毒素(如葡萄球菌肠毒素)而诱导的败血症样中毒性休克综合症。在这种情况下，粘膜施用本发明试剂中与粘膜结合分子相连接的所说毒素或其片段可以避免组织损伤性免疫反应的产生。实验
本发明通过使用CTB和LTB作为粘膜结合分子，使用绵羊红血细胞(SRBC)和人γ-球蛋白(HGG)作为抗原/耐受原来举例说明。而本发明不以任何方式限于抗SRBC或HGG的耐受诱导，这些抗原分别被选作颗粒和可溶性抗原的模型，因为它们是关于抗体形成和细胞介导的免疫反应方面鉴定得最好的口服耐受的，典型的延迟型超敏(DTH)反应使后一反应成为代表。在自身免疫疾病、变态反应性反应，移植物排异和其它炎症疾病的产生中已涉及到这些类型的免疫反应。使用髓鞘碱性蛋白质和同种异体鼠胸腺细胞可进一步举例说明本发明，当前者与CTB连接并经口服时可抑制实验性自身免疫脑炎，后者与CTB连接并经口服时可延长同种异体移植体的存活期。
提供下列实验目的是阐明本发明，而不会以任何方式限制本发明范围。材料和方法小鼠：近交的Balb/c雌性小鼠，得自瑞典。Gteborg大学医学微生
物学及免疫学系的动物管理所，所使用的小鼠为6-8周龄。粘膜结合分子CTB和LTB的纯化：
在缺失霍乱毒素基因并经编码CTB亚单位的质粒转染的霍乱弧菌突变体菌株中生产重组霍乱毒素B亚单位(CTB)(Sanchez J.andHolmgren J.1989.Recombinant system for overexpressionof cholera toxin B subunit in Vibrio cholerae as abasis for vaccine development.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：481-485)。类似地，在缺失霍乱毒素基因并经编码大肠杆菌LTB的质粒转染的霍乱弧菌突变体菌株中生产大肠杆菌热不稳定性肠毒素(LTB)的重组B亚单位(Hirst T.R.Sanchez J.Kaper J.B.，Hardy S.J.S.and Hol mgren J.1984.Mechanism oftoxin secretion by Vibrio cholerae ihvestigated instrains harbouring plasmids that encode heat-labileenterotoxins of Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：7752-7756)。在这些表达系统中，CTB和LTB以分泌蛋白质的形式从细菌培养基中被回收。以每分钟8000rev的转速离心细菌培养物20分钟，收集上清液，用稀HCl调节pH值至4.5。在23℃用六偏磷酸盐(终浓度为2.5g/l)沉淀2小时后以每分钟8000rev的转速离心，用0.1M磷酸钠缓冲液(pH8.0)溶解沉淀物，并对0.01M磷酸缓冲盐水(pH7.2)透析。然后以每分钟15000rev的转速离心透析液以除去残留的不溶性物质，经由0.22μm滤网(Millipore，Bedford，MA)过滤进一步澄清上清液，最后通过Sephadex G-100柱(Pharmacia，Sweden)经标准的凝胶过滤层析纯化CTB和LTB。人γ球蛋白(HGG)的纯化：
用(NH4)2SO4溶液(终浓度40％体积∶体积)经顺序沉淀从人血清库中纯化HGG，然后在预先经磷酸盐缓冲盐水(0.2M磷酸钠，NaCl 0.1M、pH8.5)平衡的Sephacryl S-300 HR柱(Pharmacia，Sweden)上进行凝胶过滤层析，将所得HGG制品稀释至15mg/ml。与CTB连接的绵羊红血细胞(SRBC-CTB)的制备：
将绵羊红血细胞(SRBC)贮存于4℃下的Alsevier氏溶液中直至使用，使用前，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(0.01M磷酸钠、0.15M NaCl、pH7.4)以每分钟3000rev的转速离心10分钟将SRBC洗涤3次，然后重新悬浮于PBS中以使细胞浓度为5×109SRBC/ml。为了便于CTB与SRBC的连接，先将SRBC与GM1神经节苷脂连接。按1∶2(体积/体积)的比例在收集的SRBC中加入含有300nmol/ml GM1神经节苷脂(Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)的PBS溶液，37℃下在振荡水浴中保温2小时。用PBS洗涤3次以除去过量GM1后，将包裹有GM1的红细胞重新悬浮于PBS中以使细胞浓度为5×109SRBC/ml并与重组CTB(Sanchez J.and Holmgren J.1989 RecombinantSystem for overexpression of cholera toxin B subunitin Vibrio cholerae as a basis for vaccine development.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：481-485)(终浓度为50μg/ml)混合。37℃下在振荡水浴中保温2小时以使CTB与GM1包裹的SRBC结合，然后用PBS将红细胞悬液洗涤两次以除去未与细胞结合的CTB，并重新悬浮以使每ml PBS中含1×1010个细胞。为了确定CTB分子已与GM1-连接的SRBC结合并仍可以结合另外的GM1分子，可以使用固相血细胞吸附试验，该试验使用了固定于塑料孔上的GM1。用含有0.1％(重量/体积)牛血清白蛋白(BSA)(Sigma)的PBS将红细胞悬液的等分试样稀释至终浓度为1％(收集的体积/体积)，并在塑料微量滴定析(Costar)被GM1包被的U形孔中加入该等分试样。室温(22℃)下保温之后，检测孔中血细胞吸附的出现。未被GM1包被的对照孔中无血细胞吸附现象，在与红血细胞保温的过程中，在被GM1包被的孔中加入无细胞CTB则可以剂量依赖的方式阻止血细胞吸附现象，借此可确定测定法的特异性。与LTB连接的绵羊红血细胞(SRBC-LTB)的制备：
按上述SRBC与CTB连接的方法将被GM1包被的SRBC(5×109GM1-SRBC/ml)与重组LTB(50μg/ml)连接。与CTB连接的人γ-球蛋白(HGG-CTB)的制备：
分别以1∶5和1∶10摩尔比将CTB和HGG与N-琥珀酰亚胺基(3-(2-吡啶基-二硫代)丙酸酯(SPDP)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)Carlsson，J.，H.Drewin，and R.Axen.1978.Proteinthiolation and reversible protein-protein conjugation，N-succinimidyl 3-(2-pyridyl-dithio)propionate：anew heterobifunctional reagent.Biochem.J.173：723-737.1)在HGG中加入SPDP，23℃下将混合物搅拌保温30分钟，在经用醋酸盐缓冲液(0.1M醋酸钠、0.1M NaCl、pH4.5)平衡的Sephadex G-25柱上(Pharmacia，Sweden)凝胶过滤以除去过量的SPDP。23℃下用二硫苏糖醇(DTT)(终浓度为50mM)将SPDP衍生化的HGG还原20分钟，使所得制品流过经磷酸盐缓冲盐水(0.2M磷酸钠、NaCl 0.1M、pH8.5)平衡的Sephadex G-25柱以除去过量的DTT以及在还原SPDP-衍生化的HGG过程中释放的吡啶-2-硫酮。
用磷酸盐缓冲盐水(0.2M磷酸钠、NaCl 0.1M、pH8.5)将CTB稀释至2mg/ml，用HGG按上述但以5∶1(SPDP∶CTB)的摩尔比制备SPDP衍生化的CTB。将所得制品流过经相同缓冲液预平衡的SephadexG-25柱以除去过量的未反应的SPDP。
以等摩尔比混合SPDP衍生化的HGG和CTB，于23℃保温16小时。用Sephacryl S-300柱凝胶过滤除去游离的CTB和/或HGG以纯化所得的CTB-HGG连接物。使用ELISA显示出所得连接物具有GM1神经节苷脂结合能力并同时保留了CTB和HGG的血清学反应性，所述ELISA使用Gm1(Sigma St Louis.MO)作为固相捕捉系统(Svennerholm，A.-M.and J.Holmgren.1978.Identification of Escherichiacoli heat-labile enterotoxin by means of aganglioside immunosorbent assay(GM1-ELISA)procedure.Curr.Microbiol.1：19-23。使用CTB和HGG的单克隆和多克隆抗体作为检测试剂(见下文)。在预先被GM1神经苷脂包被的聚苯乙烯孔以及经抗HGG的兔多克隆IgG抗体包被的孔中将连接物与纯化的CTB-和HGG-SPDP衍生物的系列两倍稀释物保温，然后，依次使用与辣根过氧化物酶(HRP)连接的兔抗-HGG或鼠单克隆抗-CTB抗体(大致稀释于含0.05％吐温20的PBS中)以及酶底物以检测结合于固相的HGG和CTB。参照用已知量的SPDP衍生化抗原校正的标准曲线以测定游离和结合的HGG和CTB的量。一般说来，上述SPDP连接步骤和纯化方法生产出的制品所含的游离HGG量可忽略不计，游离CTB的量低于10％。免疫方法：用SRBC免疫接种：
首次全身免疫接种：用含107SRBC的40μl无致热原的盐水注射小鼠的左右足垫。
二次全身免疫接种：首次免疫接种五天后，用含108SRBC的40μl无致热原的盐水注射小鼠的右后足垫以攻击小鼠。用HGG免疫接种：
接种前，于63℃加热30分钟以聚集HGG。首次全身免疫接种：将0.2ml乳化于Freund氏完全佐剂(Difco，St Louis.MO)中的聚集HGG(500μg)皮下注射到小鼠肋间以施用给小鼠。
二次全身免疫接种：首次免疫接种五天后，用含1mg HGG的40μl无致热原的盐水注射小鼠的左右足垫以攻击小鼠。口服耐受诱导方法：
在用SRBC首次全身免疫接种之前或之后的不同时间，将单一剂量或每天连续剂量的SRBC或SRBC-CTB施用给小鼠。每种剂量含有于0.5ml PBS中的2.5×109个SRBC或SRBC-CTB，这些剂量是通过使用婴儿导管喂养管的胃内途径施用的。对照动物仅施用0.5ml PBS。
为诱导对HGG的耐受，可在用HGG首次全身免疫接种前一周，经胃内导管将单一口服剂量的未连接的HGG或与CTB连接的HGG施用给小鼠，所试验的未连接的HGG剂量为1mg和5mg，与CTB连接的HGG剂量为60μg。对延迟型超敏(DTH)反应的评价：对SRBC的DTH：
在用SRBC二次全身免疫接种前以及2、4、24和48h之后立即用刻度厚度测量器(Oditest.H.C.Kplin.Schluchtern.Essen.Germany)测量右足垫的厚度。通过从攻击后不同时间所得值中减去攻击前所得值可测定各个动物的DTH反应强度。对HGG的DTH：
按上述对SRBC的方式评价对注射于右足垫的HGG的DTH反应强度。血清抗体反应的评价：
血清抗-SRBC抗体反应：
经施用于左足垫的SRBC首次全身免疫接种之前和二次全身免疫接种1-2周后，立即从各个小鼠的尾静脉中收集血样并于室温下凝集60分钟，于56℃下加热血清45分钟以使补体失活，然后通过直接和间接血凝测定法检测抗SRBC的抗体水平。对于直接血凝测定法，可在微量滴定板的U形底孔中用含有0.1％(重量体积)牛血清白蛋白的PBS(PBS-BSA)制备血清样品的系列2倍稀释液。在所有孔中加入50μl 0.5％(收集体积/体积)SRBC于PBS-BSA中的悬液，将培养板于室温下保温1小时，再于4℃下保温过夜，然后检查孔中的血细胞凝集现象。
为了检测已与SRBC结合但未血凝的抗体，可在对应于直接血凝测定法中血清稀释液阴性的孔中加入25μl含有热失活(56℃，45分钟)的兔抗小鼠IgG和小鼠IgA的抗血清(最终稀释度1∶50)混合物的PBS。然后振荡培养板以使SRBC重新悬浮，并在4℃下静止保温2小时。再检查孔中的血细胞凝集现象。测定直接导致或加入抗小鼠抗血清(在间接血凝测定法中)之后导致血凝现象的任何所给小鼠血清的相互最高稀释度并将之定义为所述小鼠血清的抗-SRBC抗体的效价。
血清抗-HGG抗体反应：
通过标准固相ELISA测定抗HGG的血清IgM和IgG抗体水平，该ELISA使用被HGG包被的聚苯乙烯微乳作为固相捕捉系统，使用与HRP连接的经亲和纯化的山羊抗小鼠IgG和小鼠IgM的抗体(SouthernBiotechnology Associates，Birmingham，AL)作为检测试剂。用含0.05％吐温20的PBS制备小鼠血清的系列5倍稀释液，于23℃在被HGG包被的孔中保温2小时，用含0.05％吐温20的PBS洗涤5次后，加入大致稀释的抗小鼠IgM或IgG的HRP-抗体。两小时后，用PBS冲洗培养板，通过加入发色团底物即可显示出固相结合酶的活性，该底物含有ABTS药片(Southern Biotechnology Associates)，此药片溶解于柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中(pH5.0并含有H2O2)。30分钟后用自动分光光度计(Titerscan，Flow Laboratories)监测吸光值，将给出的吸光值至少两倍于对照孔值(只暴露于缓冲液中而无血清)的相互最高稀释度定义为鼠血清的抗-HGG抗体效价。体外淋巴细胞增殖试验：
将得自二次全身免疫接种后1-2周的淋巴细胞于Iscove氏培养基(Gibco Europe.U.K.)中切碎并压过无菌尼龙筛-目屏以产生单细胞悬液。将细胞洗涤两次并以2×106个细胞/ml的浓度重新悬浮于Iscove氏培养基中，该培养基中补加了5％热灭活的胎牛血清(FBS)，L-谷氨酰胺(1％)、丙酮酸钠(1％)、非必需氨基酸(1％)、2-疏基乙醇(5×10-5M)和庆大霉素(20μg/ml)。在含有预先滴定量SRBC(总体积为200ml)的平底微量滴定(Nunc，Denmark)孔中加入淋巴结细胞，然后于37℃在5％CO2的空气中将培养板保温3天，在最后16小时的过程中用3H胸苷(2.0mCi/mM，Amersham，Stockholm)脉冲培养物，使用96孔自动细胞收集器(Inotech，Basel，Switzerland)收集各个孔中的细胞，用氩-激活的闪烁计数器(Inotech)测量放射性核苷酸的掺入。
3H-胸苷掺入的水平计算为受激指数(S.I.)＝淋巴结细胞的CPM+仅仅淋巴结细胞的SRBC/CPN。
实施例1
口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的绵羊红血细胞(SRBC)以预防早期和晚期延迟型超敏(DTH)反应：
在给小鼠左后足垫注射SRBC的首次全身免疫接种前1至8周给小鼠喂单一剂量的SRBC-CTB、仅喂SRBC或盐水。注射后5天，攻击小鼠右后足垫以产生DTH反应。只喂给SRBC的小鼠产生的DTH反应的强度与只喂给盐水的对照小鼠记录到的强度差不多(表2)，相反，在所有记录时间处，喂给与粘膜结合分子CTB连接的SRBC之小鼠记录到的DTH反应有相当程度的降低，因此，用SRBC攻击后2小时，即对应子对照(只喂给盐水)动物中所见DTH反应早期峰出现的时间，在预先喂给单一剂量SRBC-CTB的小鼠中未发现足垫肿胀。另外，与喂给盐水的对照动物以及仅喂给SRBC的动物相比，攻击后24小时的小鼠之晚期DTH反应峰显著降低。
在第二套实验中，给小鼠喂单一剂量或每天连续剂量的SRBC-CTB或SRBC，最后一次口服后一周，如上所述在小鼠左足垫全身注射SRBC，5天后再在左足垫注射以致敏和攻击动物，已发现需要每天口服SRBC达3-4周才能使抑制24小时DTH反应的水平同一服用一剂与CTB连接的SRBC所达到的水平相当(表3)。然而应指出在4周的期间内用SRBC连续喂给达20次之久对DTH反应早期(2-4小时)的产生并无影响，这与喂给单一剂量与CTB连接的SRBC而不会产生早期DTH反应的动物中所看到的情况相反。
实施例2在免疫小鼠中通过口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的绵羊红血细胞(SRBC)以抑制早期和晚期DTH反应：
为了测定粘膜施用与CTB连接的抗原是否可抑制预先被所述抗原全身致敏之动物的DTH反应，首先用SRBC注射小鼠的左后足垫以诱导首次全身免疫状态，四天后，喂给小鼠单一口服剂量的与CTB相连接的SRBC，只喂给SRBC或盐水。后一次喂给后两天，第二次用SRBC注射小鼠的右足垫以产主DTH反应。在再次全身免疫接种后的不同时间监测后期的DTH反应。仅喂给SRBC的小鼠所产生的DTH反应与仅喂给盐水的对照动物中所见的DTH反应没有区别，而喂给了与CTB连接之SRBC的小鼠对SRBC的早期和晚期DTH反应显著降低。因此，这表明口服与CTB连接之SRBC甚至可在预先被SRBC全身致敏的动物中诱导对全身注射SRBC所致的早期和晚期DTH反应的抑制。
实施例3
口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的绵羊红血细胞(SRBC)以抑制淋巴细胞增殖：
为了测定口服与CTB连接的抗原是否可导致淋巴结细胞对所述抗原的增殖反应有所降低，给小鼠喂单一剂量与CTB连接的SRBC，然后用SRBC注射左足垫(首次全身体内免疫接种)。一周后，检查小鼠淋巴结细胞体外暴露于同种抗原(SRBC)之后的增殖能力。与仅喂给盐水的对照动物和仅喂给单一剂量SRBC的动物相比，得自喂给与CTB连接之SRBC的动物的淋巴结细胞当与SRBC一起培养时，增殖反应降低(表4)。这种降低对服用的抗原而言是特异性的，因为在喂给SRBC-CTB、仅喂给SRBC或盐水的动物中，淋巴结细胞对促细胞分裂剂伴刀豆球蛋白A的增殖反应差不多(表4)。
实施例4
口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的绵羊红血细胞(SRBC)以抑制血清抗体反应：
为了测定口服与CTB连接的抗原是否可导致对全身服用抗原的抗体反应有所降低，在用SRBC注射左后足垫以进行首次全身免疫接种前1至8周，给小鼠喂单一剂量的SRBC-CTB、只喂SRBC或盐水。注射后5天，攻击小鼠的右后足垫，一周后从尾静脉收集血液，内直接和间接血细胞凝集试验测定抗SRBC的血清抗体水平。如表5所示，与仅喂给盐水或单一剂量SRBC的动物相比，喂给了单一剂量SRBC-CTB的动物抗SRBC的血清抗体反应有所降低。必需每天口服SRBC达3周才能使其抑制对全身服用SRBC的血清抗体反应的水平同只服用与CTB连接之SRBC所能达到的水平差不多(表5)。
实施例5
口服与大肠杆菌热不稳定性肠毒素B亚单位(LTB)连接的绵羊红血细胞(SRBC)以抑制早期和晚期DTH反应：
为了测定粘膜服用与其它粘膜结合分子，即大肠杆菌热不稳定性肠毒素B亚单位(LTB)连接的SRBC是否也可抑制对全身服用的SRBC的DTH反应，在用SRBC首次足垫注射前一周，给小鼠喂单一剂量的SRBC-LTB或盐水。为进行对比，给另一组小鼠喂SRBC-CTB，首次注射后5天，用SRBC攻击所有小鼠的对侧足垫以产生DTH反应。攻击后24小时，喂给了SRBC-LTB的小鼠与喂给盐水的对照小鼠相比，记录下的DTH反应显著降低(表6)。然而，喂给了SRBC-LTB的小鼠的早期(2-4小时)DTH反应并未降低，这与喂给了SRBC-CTB的小鼠在攻击后2-4小时无DTH反应而在24-48小时DTH反应显著降低的情况相反(表6)。这些研究成果表明口服与LTB连接的SRBC可诱导对全身注射的SRBC之晚期DTH反应的抑制，但不会影响这种反应的早期成分。
实施例6
口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的HGG以抑制对人γ球蛋白(HGG)的早期和晚期延迟型超敏(DTH)反应：
为了测定经粘膜施用与CTB连接的抗原是否可抑制对可溶性蛋白质抗原的DTH反应，在使用于Freund氏完全佐剂中的HGG皮下注射以进行首次全身免疫接种前一周，给各组小鼠喂单一剂量与CTB连接的HGG，仅喂HGG或盐水。此次注射后5天，用HGG攻击小鼠右后足垫以产生DTH反应。攻击后的检查的所有时间处，仅喂给1mg HGG的小鼠所产生DTH反应的强度与仅喂给盐水的对照小鼠差不多(表7)。喂给小鼠5mg HGG可在24-48小时处导致DTH反应降低但不会影响这些反应早期(2-4小时)相的强度。与此相反，在仅喂给15μg与CTB连接之HGG(比HGG的量低300多倍)的小鼠中监测到的DTH反应具有类似的效果，它在24小时处而不是在早期时间(2和4小时)处比对照(喂给盐水)动物的相应反应低很多。然而，给小鼠喂66μg与CTB连接的HGG可在所有记录时间处导致显著降低的DTH反应，因此，在喂给了66μg与CTB连接的HGG的小鼠中有效抑制了早期(2-4小时)和晚期(24-48小时)DTH反应。这些研究成果表明口服少量与粘膜结合分子CTB连接的可溶性蛋白质抗原可诱导对随后用所述蛋白质抗原全身注射所产生的早期和晚期DTH反应的抑制。
实施例7
口服与CTB连接的髓鞘碱性蛋白质以抑制实验性自身免疫脑炎(EAE)。髓鞘碱性蛋白质(MBP)的纯化：
如Deibler等人所述(Deibler GE.Martenson RE.Kies MW.1972，Large scale preparation of myelin basic proteinfrom central nervous tissue of several mammalianspecies，Prep.Biochem.2：139-165)由豚鼠的脊髓和脑制得MBP。通过在约20kD处显现单一的标准SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定MBP的纯度，在类似于已描述的HGG与CTB连接的条件下，使用SPDP法将MBP与CTB连接。通过GM1-ELISA确证连接物中MBP的存在，该ELISA使用的血清来自被FCA中的MBP免疫的大鼠。使用标准固相夹心ELISA(对于MBP)和GM1-ELISA(对于CTB)将所试验的CTB和MBP纯化制品一一进行比较即可测定连接物中MBP和CTB的相对比例，这两种EISA分别使用抗-MBP和GM1作为固相捕捉试剂，分别使用与HRP连接的大鼠抗-MBP抗血清和小鼠抗-CTB单克隆抗体以检测捕捉到的MBP和CTB。实验性自身免疫脑炎(EAE)的诱导：
为诱导EAE(Kies MW.Murphy JB.Alvord EC.1960，Fractonation of guinea pig proteins withencephalitogenic activity.Fed.Proc.19：207)，可在乙醚麻醉下，用总量为100微克且乳化于Freund氏完全佐剂(FCA)(Difco，Detroit，MI.USA)(1∶1.体积∶体积)中的豚鼠MBP注射8-10同龄(体重为170-240g)的雌性路易斯大鼠(Zentral Institutfür Versuchstierzucht，Hannover，Germany)的两只后足垫(大约有50微克MBP经过足垫)。此次注射后，每天对动物如此注射达30天。每隔两天，检查动物临床症状的出现及其测定的体重。使用标准临床分级系统测定疾病的强度(Miller A.Lider 0.Alsabbagh A.Weiner HL.1992，Suppression of experimentalautoimmune encephalomyelitis by oral administration ofmyelin basic protein.V.Hierarchy of suppression bymyelin basic protein from different species，J.Neuroi mmunol.39：243-250)：
0级：无疾病
1级：尾部无力
2级：轻微的后肢麻痹
3级：严重的后肢麻痹伴有四肢外张
4级：影响到全部四只足垫的完全后肢麻痹
5级：死亡口服耐受方法：
在足垫注射MBP以诱导EAE之前，给各组动物施予下列试剂：
组1：在足垫注射MBP(指的是第0天)前的第-7天给动物施用0.5mlMBP-CTB连接物，其相当于溶于0.6M碳酸氢盐缓冲液中的20微克MBP和100微克CTB；
组2：在足垫注射MBP前的5个连续的时间，即第-11天、第-9天、第-7天、第-5天，第-3天，给动物施用0.5ml含有5mgMBP和10mg大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)的0.6M碳酸氢盐缓冲液以使对MBP的蛋白酶裂解降解的程度最低(Whitacre CC.Gienap IE.Orosz CG，Bitar D.1991，Oral tolerance in experimentalautoimmune encephalitis，III.Evidence for clonal anergy.J.Immunol.147：2155-63)：
组3：按照组2限定的时间表，在5个连续的时间给动物施用0.5ml盐水(对照)；
组4：按照组2限定的时间表，在5个连续的时间给动物施用0.5ml只含有10mg大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)的0.6M碳酸氢盐缓冲液(对照)。口服与CTB连接的MBP以抑制EAE：
用乳化于FCA的MBP或仅用FCA注射动物组的后足垫，这些组各包括5只成年雌性路易斯大鼠。在足垫注射MBP＋FCA前11、9、7、5和3天，预先用大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)喂养的对照动物(组4)，注射后12至14天所出现的神经系统症状最严重，所有动物都出现严重的麻痹现象(表8)。以单一剂量喂给少量20微克与CTB相连接之MBP的动物(组1)不出现(5只大鼠中的4只)或仅出现轻微的症状(在另一只大鼠中出现的与右后足垫轻瘫相关的短暂尾部轻瘫)(表8)。在5个连续时间喂给5mg MBP与STI的动物(MBP的总量为25mg，比组1动物MBP的剂量高1250倍)也不会产生严重的EAE病(组2)(表8)。因此，口服少量与CTB连接的MBP可抑制EAE。
实施例8
口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的同种异体胸腺细胞以延长鼠同种异体移植的存活期鼠胸腺细胞与CTB的连接：
为增强CTB与鼠淋巴细胞的结合，首先于37℃下将5×107个胸腺细胞与10nmol GM1神经节苷脂在总体积为0.5ml的Iscove氏最低必需培养基(IMEM)中混合2小时，从而使C57BL/6小鼠(主要组织相容性复合体(MHC)单倍体型H-2b)的胸腺细胞与GM1神经节苷脂衍生化。然后用无致热原的无菌盐水将细胞洗涤3次以除去未结合的GM1，37℃下以0.5ml的总体积与25微克CTB一起再保温2小时。最后用盐水洗涤细胞以除去未结合的过量CTB，保存于冰上直至使用。通过对与不同量GM1衍生化并暴露于不同浓度经四甲基若丹明-标记的CTB(List Biological Laboratories Inc.，Campbell，CA.USA)中的鼠胸腺细胞进行流式细胞计数分析，测定出所需GM1和CTB的浓度应能使胸腺细胞达到最大饱和量。异位鼠心脏移植：
从新生(出生后不超过36小时)C57BL/6小鼠中收集供体心脏并沿着室间隔切开，将心脏的各一半插入6至8周龄Balb/c小鼠(MHC单元型H-2d)的一只耳或两只耳背侧部分的皮下囊处。为了进行比较，各组Balb/c受体小鼠接受同系Balb/c新生小鼠的心脏。每天用Tektronix心脏镜测量移植物的电活性以评价移植体功能。排异时间被定义为心肌收缩完全停止已发生的那一天。口服耐受的方法：
同种异体移植植入之前和/或之后的不同时间，用婴儿导管式喂养管给成年Balb/c受体小鼠喂体积为0.5ml的无致热原盐水，它可含有：——在移植前3天和移植后1和4天，施予新生C57BL/6小鼠的未
连接的胸腺细胞；——在移植前7、4和1天施予新生C57BL/6小鼠的未连接的胸腺
细胞；——在移植前7、4和1天施予新生C57BL/6小鼠的与CTB连接的胸
腺细胞；——在移植前片刻(30-60分钟)施予新生C57BL/6小鼠的与
CTB连接的胸腺细胞；——或仅施予盐水。口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的同种异体胸腺细胞以延长鼠异位心脏同种异体移植的存活期：
在H-2位点处接受了组织不相容的新生C57BL/6供体小鼠之异位心脏移植的Balb/c小鼠平均在8天内即对它们的移植物排异(表9)，与此相反，接受了H-2组织相容性心脏移植的小鼠可将有功能的移植物保持2个多月。在植入同种异体移植心脏前(-7、-4和-1天)和/或后(-3、+1和+4)口服作为供体小鼠的同种新生H-2组织不相容性小鼠的胸腺细胞不会延长，在某些情况下甚至会降低Balb/c小鼠受体的移植存活期(表9)。与此相反，在同种异体植入前(-7、-4和-1天)口服3剂量与CTB连接的胸腺细胞，则基本上可提高(平均为56％)心脏移植的存活率(表9)。而且，在移植前立即施用单一口服剂量的与CTB连接的C57BL/6胸腺细胞可在同种异体必脏移植的受体小鼠中延长(平均为39％)移植物存活期(表9)。总之，这些实验结果表明口服与CTB连接的组织不相容性淋巴细胞可延长同种异体移植的存活期。
表2.口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的绵羊红血细胞
       (SRBC)以防止早期和晚期延迟型超敏反应
 喂给  喂给的数目          足垫厚度增加量的平均值×10-3cm(±1标准差)
SRBC-CTBSRBCSRBCSRBCSRBCSRBC盐水 115101520   4小时11±2.0*45±4.234±9.134±7.632±7.431±13.035±10.8      24小时23±12.1**50±10.659±6.041±3.833±8.1*25±5.5**50±12.7   48小时16±4.6*30±4.634±6.129±8.624±6.316±4.4*32±8.3
星号表示试验组(每组6只动物)和包括仅喂给盐水的动物(7
只小鼠)的对照组所测定的值之间有显著差异：*p＜0.05，
**p＜0.01(Student′t检验)表3.在免疫小鼠中通过口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的绵
   羊红血细胞(SRBC)以抑制早期和晚期DTH反应
用SRBC全身致敏第0天) 喂给(第4天)1剂量的： 用SRBC全身攻击后(第7天)足垫厚度增加量的平均值×10-3cm(±1标准差)
+++- SRBC-CTBSRBC盐水盐水  4小时23±3.3**50±8.261±7.428±1.0  24小时20±7.1**44±7.453±4.729±0.5  48小时12±3.8*28±5.425±6.212±3.5
星号表示试验组(每组6只动物)和包括攻击前用SRBC致敏但仅
喂给盐水的动物对照组(6只小鼠)所测定的值之间有显著差异：
*p＜0.05，**p＜0.01(Student′t试验)表4.口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的绵羊红血细胞(SRBC)
      以抑制抗原特异性淋巴细胞增殖
喂给1剂量的：     培养物中的平均S.I.值±1标准差，该培养物暴露于
SRBC-CTB(n＝6只小鼠)SRBC(n＝6只小鼠)盐水(n＝6只小鼠)         SRBC1.06±0.29*7.88＋4.528.94±3.89 伴刀豆球蛋白A119±32108＋5676±35
*表示给SRBC-CTB的试验动物和仅喂给SRBC或仅喂给盐水的动
物之间有显著的差异(p＜0.01；Student′t试验)表5.口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的SRBC之后可抑制对SRBC
的血清抗体反应
喂给1剂量的：     血清抗-SRBC的平均效价±1标准差
SRBC-CTBSRBC无         40±20*1000±2501000±200
*表示给SRBC-CTB的试验动物(n＝6只小鼠)和仅喂
给SRBC(n＝6只小鼠)或盐水(n＝5只小鼠)的动物之间
有显著的差异(p＜0.001；Student′t试验)表6.口服与大肠杆菌热不稳定性肠毒素B亚单位(LTB)连接的绵
羊红血细胞(SRBC)以防止晚期延迟型超敏反应
喂给     足垫厚度增长量的平均值×10-3cm(±1标准差)
SRBC-LTBSRBC-CTB盐水     2小时4±100±0*7±5.5      4小时16±8.26±5.4*14±2.3     24小时38±12*22±6.7*50±4.3       48小时13±2.2*7.1±3**24±3.5
星号表示试验组(每组7只小鼠)和仅喂给盐水的对照动物(n
＝6只小鼠)之间有显著的差异：*p＜0.05，**p＜0.01
(Student′t试验)表7.口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的人γ-球蛋白(HGG)
         以防止早期和晚期延迟型超敏反应
Figure A9419418900371
ξ皮下注射0.5mg于Freund氏完全佐剂中的热一聚集HGG以使动物致敏，用1mg于盐水中的HGG注射右足垫以攻击动物。星号表示试验组(组I-IV，n＝每组6只小鼠)和仅喂给盐水的对照动物(组V，n＝6只小鼠)之间有显著的差异：*p＜0.05，**p＜0.01(Student′t试验)表8.口服与CTB连接的髓鞘碱性蛋白质以抑制路易斯大鼠的实验性
      自身免疫脑炎(EAE)
 动物组     喂给  剂量数目  足垫注射     EAE的临床分  麻痹a的发生率
 1     MBP(20μg)-CTB     1 MBP＋FCA     1.1±0.4        0/5
 2    MBP 5mg(+STI)     5 MBP＋FCA     0.6±0.5        0/5
 3     盐水     5 FCA         0        0/5
 4     STI     5 MBP＋FCA     3.9±0.5        5/5
a)临床级别≥2表9.口服与霍乱毒素B亚单位(CTB)连接的同种异体胸腺细胞以
延长鼠异位心脏同种异体移植的存活期
心脏移植的供体(MHC II类单倍体型)      喂给a       喂给的时间(天)    平均排斥时间±标准差(天数)  心脏移植的数目     ％增加的移植存活时间b
C57BL/6(H-2D)    胸腺细胞     -3，+1，+4      7.9±1.0     8      -4，8％
C57BL/6(H-2D)    胸腺细胞     -7，-4，-1      6.5±0.5     10       -21％
C57BL/6(H-2D)  与CTB(25μg)连接的胸腺细胞     -7，-4，-1      13±0     16        56％
C57BL/6(H-2D)  与CTB(25μg)连接的胸腺细胞          0      11.6±1.3     14        39％
C57BL/6(H-2D)      盐水          0      8.3±1.3     19        0％
Balb/c(H-2d)同系的对照      盐水          0      ＞64     26
a在标明的时间给成年Balb/c小鼠受体喂5×107个新生胸腺细胞或与CTB连接的胸腺细胞(每只小鼠25μg)，在第0天使小鼠接受心脏移植。b按下列方法计算移植存活期的相对增长：(喂给了胸腺细胞之小鼠的平均排异时间减去喂给了盐水之对照小鼠的平均排异时间，其差值除以喂给了盐水之对照小鼠的平均排异时间)×100。
从上述实施例可明显看出本发明的免疫耐受诱导剂可有效抑制对全身免疫反应的诱导并可防止其表达。另外，该试剂还可使口服诱导耐受化的已报道方法所必需的抗原/耐受原的绝对量和/或剂量的数目降至最低。从上述实施例可推断出，使用本发明的免疫耐受诱导剂可预防或延迟与延迟型超敏反应的早期和晚期相相关的炎症免疫反应、自身免疫疾病(实施例8)和同种异体移植排异(实施例9)的产生。

Claims (16)

1.免疫耐受诱导剂，它包含与特异耐受原相连接的粘膜结合分子。
2.根据权利要求1的试剂，其中所述粘膜结合分子选自衍生于细菌毒素的粘膜结合结构、细菌菌毛、病毒粘附蛋白质和植物凝集素的粘膜结合分子。
3.根据权利要求2的试剂，其中所述细菌毒素的粘膜结合结构选自包含霍乱毒素和大肠杆菌热不稳定性肠毒素的组中。
4.权利要求3的试剂，其中所述粘膜结合结构是毒素的结合片段。
5.根据权利要求4的试剂，其中所述毒素的结合片段是霍乱毒素或大肠杆菌热不稳定性肠毒素的B亚单位。
6.根据权利要求1的试剂，其中所述特异耐受原选自特异抗原，包括半抗原，它可导致个体中不希望的免疫反应。
7.根据权利要求6的试剂，其中所述不希望的免疫反应与全身抗体的产生相关。
8.根据权利要求6的试剂，其中所述不希望的免疫反应与延迟型超敏反应相关。
9.根据权利要求6的试剂，其中所述不希望的免疫反应与自身免疫疾病、变应性疾病、组织或细胞移植排异事件和/或急性或慢性炎症反应或疾病相关。
10.根据权利要求6的试剂，其中所述抗原选自包含蛋白质、肽类、糖类、脂类和核酸的组中。
11.根据权利要求1的试剂，其中所述耐受原和所述粘膜结合分子直接或间接相互连接。
12.根据权利要求11的试剂，其中所述耐受原和所述粘膜结合分子在下组成员之一的帮助下间接地相互连接，该组包含间隔分子，含有所述耐受原/抗原(包括半抗原)的保护性载体或所述间隔分子与所述耐受原/抗原(包括半抗原)的杂合分子，该杂合分子可以经表达融合基因或核苷酸序列得到。
13.根据权利要求12的试剂，其中所述间隔分子选自对所述耐受原或含有耐受原的载体以及所述粘膜结合分子中任一者或两者具有结合亲和力的分子。
14.根据权利要求13的试剂，其中所述间隔分子是抗体。
15.根据权利要求13的试剂，其中所述间隔分子是或衍生于GM1神经节苷脂、半乳糖基-N-乙酰基-氨基半乳糖基-(唾液酸)-半乳糖基葡糖神经酰胺的霍乱毒素结合结构。
16.在抗特异性抗原，包括半抗原的个体中诱导免疫耐受的方法，所述抗原在所述个体中可引起不希望的免疫反应，该方法包括经粘膜途径给所述个体用免疫有效量的根据权利要求1的试剂。
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