CN113514455A - 检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，该方法包括以下步骤：S1.制备包含上皮组织脱落细胞的细胞悬液；S2.滴加细胞悬液至装载叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)的反应试管中；S3.密封反应试管，颠倒摇晃试管中的混合液体；S4.静置等待反应试管壁上包含上皮组织脱落细胞的挂壁液体显蓝色或出现蓝色颗粒。本发明的检测方法准确度高，能够广泛应用于上皮组织脱落细胞的细胞学特殊染色。本发明还提供一种本发明的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法所设计的试剂盒，包括采样工具、细胞保存液、FRD染色液、可密封的反应试管以及一次性使用吸管的组合。

Description

检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法及试剂盒。

背景技术

叶酸受体在肿瘤细胞等病变细胞表面高表达，而在正常细胞则较少表达或无表达。叶酸受体介导的特殊染色法(FRD染色法)是近年迅速发展起来的一种新的较便捷的检测方法，该方法中，染色液的主要成分是叶酸衍生物、还原态亚甲基蓝、乙酸等，呈棕黄色，由于叶酸受体介导，亚甲基蓝对肿瘤细胞及黑色素有高度的亲和性，其氧化还原性使亚甲基蓝在肿瘤组织的氧化还原态中表现不同的变色反应。其反应原理是：如果存在上皮组织脱落细胞表面的叶酸表达程度高，染色液中的叶酸就会通过细胞表面的叶酸受体，迅速进入细胞胞浆，同时还原型的亚甲基蓝也进入细胞胞浆内。叶酸被还原成四氢叶酸，参与到一碳单位的代谢过程中。而肿瘤细胞会处于强烈的氧化应激环境中，还原型的亚甲基蓝则被细胞内广泛存在的活性氧(ROS)氧化，变为蓝色的氧化型的亚甲基蓝。由于有许多生物分子的进入，使得细胞内的渗透压升高，致使氧化型的亚甲基蓝逸出细胞外，则可在染色液上显现出蓝色，就提示该样本细胞表面的叶酸受体表达增高，细胞内的活性氧压增大，铁蛋白含量高，预示着脱落细胞可能有异常病变，需要进一步检测。

目前，该染色法应用于检测宫颈上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的检测方法为：放置阴道扩张器暴露患者宫颈口处的上皮组织并擦拭干净分泌物，然后取医用棉签蘸取FRD染色液，将棉签用力涂抹在宫颈上皮组织表面3-5圈，再在宫颈口按压3-5秒，取出棉签观察其颜色变化并参照比色卡判读结果。该方法存在如下缺陷：1.用医用棉签蘸取染色液后接触宫颈处组织染色脱落细胞或用医用棉签取样宫颈脱落细胞再进行染色，都很难免出现大量假阳性。因为患者的宫颈处是一个复杂的、敏感的组织，大量的分泌物、炎症感染甚至宫颈隐性出血少量血细胞都会使进行FRD染色的棉签上出现假阳性，从而增加医生对结果准确判断的难度。2.用医用棉签蘸取染色液的方法极其容易受到外部检测环境的影响。因为FRD的染色液处于还原态，极其容易受到检测环境中空气、温度、湿度甚至检测操作者的影响，所以，该方法无法避免外部环境因素对染色液的影响，从而导致结果不准确。

因此，亟需发明一种能克服现有的FRD染色法检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的应用缺陷，能够避免外部检测环境影响，使其检测结果更加准确的检测新方法。

发明内容

发明要解决的问题

现有技术中，使用医用棉签接触宫颈处脱落细胞进行染色的检测方法具有影响因素多，对操作人员判读经验要求高，但结果准确度不高的缺点，本发明的目的是提供一种能准确检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法。本发明的又一目的是提供一种根据本发明检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法所设计的试剂盒。

用于解决问题的方案

一种检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，包括以下步骤：

S1.制备包含上皮组织脱落细胞的细胞悬液；

S2.滴加所述细胞悬液至装载叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)的反应试管中；

S3.密封反应试管，颠倒摇晃试管中的混合液体；

S4.静置等待反应试管壁上包含上皮组织脱落细胞的挂壁液体显蓝色或出现蓝色颗粒。

进一步地，所述步骤S1中，包括以下步骤：S1-1用一次性使用采样工具进行上皮组织脱落细胞采样，得到细胞样本；优选地，采样工具为采样刷或拭子。

进一步地，所述步骤S1中，包括以下步骤：S1-2往所述细胞样本中添加细胞保存液，或将所述细胞样本添加至细胞保存液中，并将包含细胞样本的保存液瓶(管)放入振荡器中振荡3-15min，吸取1-10ml所述包含细胞样本的细胞保存液至离心管中，设置800-1500g离心力，离心3-15min，缓慢倒掉上清液，取细胞样本沉淀部分留用。

进一步地，所述步骤S1中，包括以下步骤：S1-3吸取PBS缓冲液1-5ml至含有所述细胞样本沉淀部分的离心管，用吸管吹吸或用漩涡混匀器将离心管底部的细胞打散，从而制成细胞悬液。

进一步地，所述步骤S2中，将叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)试剂瓶颠倒混匀3-30s后待用。

进一步地，所述步骤S2中，所述叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)用量为1-3ml，所述细胞悬液用量为2-10滴。

进一步地，所述步骤S3中，所述反应试管密封后静置30-120s，然后颠倒摇晃反应试管5-10下。

进一步地，所述步骤S4中，静置时间为5-30min。

进一步地，所述反应试管为透明试管。

进一步地，所述反应试管材质为塑料、玻璃或可供含脱落细胞的液体挂壁的材料。

作为优选方案，以上任一所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，所述上皮组织脱落细胞为浆膜腔积液脱落细胞、子宫颈及阴道脱落细胞、呼吸系统脱落细胞、脑脊液细胞及脱落细胞、消化系统脱落细胞、泌尿系统脱落细胞中的一种或两种以上；更为优选地，所述上皮组织脱落细胞为子宫颈及阴道脱落细胞。

一种根据以上任一所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法所设计的试剂盒，其特征在于，包括采样工具、细胞保存液试剂瓶、叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)试剂瓶、可密封的反应试管以及一次性使用吸管的组合。

发明的效果

本发明所提供的方法能够应用于上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的检测，具有以下优点：

本发明所提供的方法能够广泛应用于脱落细胞的细胞学特殊染色，该方法特别针对子宫颈、阴道、外阴等临床常规病变的粗筛检查，从而缩短检查时间，提高分检效率。

本发明提供了一种检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，使用反应试管代替医用棉签作为FRD染色法的载体，克服现有的FRD染色法使用医用棉签检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达容易导致假阳性的缺陷，并通过制备上皮组织脱落细胞悬液进行染色的方法，摆脱了医用棉签蘸取染色液后需要持续接触人体直到显色反应结束的限制，拓宽了FRD染色法可应用的场景。

本发明在密封的反应试管中进行上皮组织脱落细胞与FRD染色液的显色反应，并将显色结果显示在试管壁上，不容易受到外部检测环境中空气、温度、湿度甚至检测者结果判别经验的影响，检测结果更加准确。

本发明采用的是细胞样本通过离心达到浓缩细胞的效果，操作简单有效，无需加入其他试剂例如梯度分离液、血细胞处理液等，处理步骤简单，对环境友好，适于产业化应用。

本发明试剂盒的设计，有利于检验人员快速备齐试剂和物品供给，便于直接实施本发明的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法。

附图说明

图1：本发明检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法的流程图。

图2：本发明实施例1的方法检测宫颈脱落细胞阳性样本的细胞表面叶酸受体表达的显色结果。

图3：本发明实施例2的方法检测宫颈癌Hela细胞株的细胞表面叶酸受体表达的显色结果。

图4：本发明实施例3的方法检测宫颈癌Hela细胞株的细胞表面叶酸受体表达的显色结果，以及与实施例2的方法对应显色结果的对比。

图5：本发明对比实验1的对比实验结果。

图6：本发明对比实验2的对比实验结果。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

本发明的方法中，所使用的细胞保存液为市售可得的细胞保存液或根据现有常规配方自行配制的细胞保存液；所使用的特殊染色液为市售可得的叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)或根据现有常规配方自行配制的上皮组织脱落细胞特殊染色液，其主要组成成份为叶酸、亚甲基蓝、葡萄糖、纯化水等；所使用的PBS缓冲液也为常规市售可得产品或常规实验室配制品。本发明的所述阳性样本为经过其他途径证实为叶酸受体高表达的细胞样本，或使用上述特殊染色液实施本发明检测方法的结果显示出明显蓝色的细胞样本；所述阴性样本为经过其他途径证实为叶酸受体低表达或不表达的细胞样本，或使用上述特殊染色液实施本发明检测方法的结果未显示出明显蓝色的细胞样本。需要说明的是，叶酸受体表达的高低与亚甲蓝逸出量即显色程度呈正相关性，本发明中所述的检测可以为定性检测，定量检测或半定量检测中的一种。

发明第一方面

本发明的一方面，提供以下方法测定叶酸受体的表达，主要步骤有：

步骤S1：制备包含上皮组织脱落细胞的细胞悬液。

本发明的上皮组织脱落细胞可以是指自然管腔器官内表面粘膜正常情况下，人体器官粘膜上皮细胞经常有脱落更新，有病变的粘膜上皮细胞，如阴道上皮，子宫颈上皮、肾盂膀胱移行上皮等都是自然脱落的上皮的细胞，可以通过自然分泌液采集，也可以是通过人工刷取、蘸取等方式直接采集从上皮组织剥离的细胞。本发明将所述上皮组织脱落细胞放在细胞保存液中，制成细胞悬液。在一些实施例中，可以使用一次性采样工具进行上皮组织脱落细胞采样。采样刷或拭子是目前市面上成熟的宫颈液取样方式，本发明在FRD检测方法中使用采样刷或拭子采样，有利于将本发明的检测方法和其他宫颈检查方式联用。例如在妇科液基细胞学检查中，采用采样刷从宫颈处刷取采集脱落的细胞样本和宫颈分泌物。此外，女性的宫颈部位对一些化学物质会较为敏感的，特别是怀孕、炎症出血的女性，使用采样刷或拭子进行上皮组织脱落细胞采样，可以避免染料直接接触宫颈部位而导致化学物质刺激的风险。

在一些实施例中，将采集到的细胞样本进行震荡离心富集所述脱落细胞：往所述细胞样本中添加细胞保存液，或将细胞样本添加至细胞保存液中。优选地，采样完毕，迅速将采样刷或拭子放入装有细胞保存液的瓶(管)中，将高出瓶(管)的部分折断，旋紧管盖。接着，将装有细胞样本的保存液瓶(管)放入振荡器中振荡3-5min，使得细胞样本充分从采样刷或拭子中脱落，收集到细胞保存液中，使用一次性吸管吸取1-10ml细胞保存液至离心管中，例如，可以是1ml，2ml，3ml，5ml，8ml，10ml，再将离心管转移到离心机内，设定离心机为800-1500g离心力，离心3-15min。优选地，设定离心机为800g离心力，离心5min。离心完毕，缓慢倒掉上清液，取细胞样本沉淀部分留用。本发明通过将细胞样本充分转移至细胞保存液中，再离心取细胞样本沉淀部分留用，可以达到浓缩脱落细胞的效果，操作简单有效，无需加入其他试剂例如梯度分离液、血细胞处理液等，而后续显色更为明显。

在一些实施例中，吸取PBS缓冲液1-5ml至含有所述细胞样本沉淀部分的离心管，用吸管吹吸或用漩涡混匀器将离心管底部的细胞打散，从而制成细胞悬液。经过将细胞打散，有利于细胞接触染色液中的叶酸，避免形成细胞团导致团中间的细胞无法接触叶酸导致检查显色效果差的情况发生。

步骤S2：滴加细胞悬液至装载叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)的反应试管中。

在一些实施例中，将叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)试剂瓶颠倒混匀3-30s后待用。

在一些实施例中，所述叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)用量为1-3ml，所述细胞悬液用量为常规2ml一次性吸管的2-10滴，例如，可以是2滴，3滴，4滴，5滴，8滴，10滴。本发明也可以使用例如1ml，5ml等规格的吸管，所述的一滴溶液的体积为常规实验方法中一滴溶液的体积量，即20滴约等于1ml的量。

步骤S3：密封反应试管，颠倒摇晃试管中的混合液体。

在一些实施例中，反应试管密封后静置30-120s，颠倒摇晃塑料管5-10下，然后再静置5-30min，优选地，静置30-50s，颠倒摇晃塑料管5-8下；进一步优选地，静置30s，颠倒摇晃塑料管5下。本发明的适当颠倒摇晃，可以让上皮组织脱落细胞黏附在管壁，需注意过多次的颠倒摇晃并不会增加黏附效果，还可能带来一些不利于实验的因素。

本发明的检测方法通过颠倒摇晃反应试管，使脱落细胞能与染色液里面的叶酸充分接触，并粘附在试管壁上。当脱落细胞表面表达大量的叶酸受体时，染色液里面的叶酸就会通过叶酸受体介导进入细胞内产生一系列的氧化反应，致使氧化型的亚甲基蓝逸出细胞膜外，在适量空气的催化下，部分氧化型的亚甲基蓝使挂壁液体中显现蓝色，或者在挂壁液体较少时出现较多的亚甲基蓝颗粒。同时，细胞膜外聚集了亚甲基蓝颗粒也使得细胞更好地黏附于塑料管壁上，从而可以使塑料管壁出现明显蓝色。

步骤S4：静置等待反应试管壁上包含上皮组织脱落细胞的挂壁液体显蓝色或出现蓝色颗粒。

静置后，反应试管壁上的挂壁液体显现蓝色，多数情况下可见蓝色颗粒，则判断为上皮组织脱落细胞表面叶酸受体高表达；静置30min后仍无显现蓝色挂壁液体或蓝色颗粒，则判断为上皮组织脱落细胞表面叶酸受体低表达或不表达。

在一些实施例中，反应试管为透明试管，以便观察试管壁的染色液颜色变化。

在一些实施例中，反应试管材质为塑料、玻璃或可供含脱落细胞的液体挂壁的材料，如染色液及细胞不能挂壁而完全处于试管底部，则由于氧化型的亚甲蓝逸出量少且溶于过量的染色液中，不能很好地显色。

在一些实施例中，本发明检测方法可以应用的上皮组织脱落细胞为浆膜腔积液脱落细胞、子宫颈及阴道脱落细胞、呼吸系统脱落细胞、脑脊液细胞及脱落细胞、消化系统脱落细胞、泌尿系统脱落细胞中的一种或两种以上；更为优选地，应用于子宫颈及阴道脱落细胞表面叶酸受体表达的检测。

发明第二方面

本发明的又一方面，根据所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法所设计的试剂盒，包括采样工具、细胞保存液试剂瓶、叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)试剂瓶、可密封的反应试管以及一次性使用吸管的组合。

在一些实施例中，设置具有多个凹槽或试管托的吸塑盒，将采样刷或拭子、细胞保存液试剂瓶、叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)试剂瓶、可密封的反应试管以及一次性使用吸管分别放在对应的凹槽或试管托里，进行封装保存，得到试剂盒。本试剂盒的组合有利于检验人员快速备齐试剂盒物品供给，便于直接实施本发明第一方面所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法。

实施例

以下结合具体实施例和附图对本发明的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法作进一步详细的说明。下面实施例用于说明本发明并作进一步的详细描述，但不用来限制本发明的范围。本发明中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1

一种检测宫颈脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，包括如图1所示的步骤：

步骤S1，制备包含上皮组织脱落细胞的细胞悬液：选择TCT液基细胞学结果为高级别病变以上的脱落细胞样本为实验样本，用一次性使用宫颈采样刷进行上皮组织脱落细胞采样，采样完毕，迅速将采样刷放入装有细胞保存液的瓶中，将高出瓶的部分折断，旋紧管盖，即完成样本取样。

将装有细胞样本的保存液瓶放入振荡器中振荡5分钟，使用一次性吸管吸取2ml含有上皮组织脱落细胞的细胞保存液至离心管中，设置800g离心力，离心5min，缓慢倒掉上清液，取细胞样本沉淀部分留用；

使用干净的一次性吸管吸取PBS缓冲液2ml至含有细胞样本沉淀的离心管；用漩涡混匀器将离心管底部的细胞打散，从而制成细胞悬液；同时设有无细胞的空白对照样本。

步骤S2，滴加细胞悬液至装载FRD染色液的反应塑料管中：将FRD染色液试剂瓶颠倒混匀5s后待用；使用干净的一次性吸管吸取FRD染色液2ml至透明的塑料管中，再使用干净的一次性吸管吸取阳性样本细胞悬液滴加3滴的细胞量至塑料管的染色液中，盖上塑料管管盖。

步骤S3，密封塑料管，颠倒摇晃塑料管中的混合液体：滴加细胞悬液后密封塑料管并静置30s，颠倒摇晃塑料管5下。

步骤S4，静置等待塑料管壁上包含上皮组织脱落细胞的挂壁液体显蓝色或出现蓝色颗粒：静置10分钟，观察塑料管壁是否显色。

结果如图2所示，左侧塑料管中含细胞样本，塑料管壁显示蓝色挂壁液体和蓝色颗粒，而右侧塑料管无细胞样本，塑料管壁不显示蓝色。

实施例2

一种检测宫颈癌Hela细胞株的细胞表面叶酸受体表达的方法，包括以下步骤：

步骤S1，制备包含上皮组织脱落细胞的细胞悬液：由于Hela细胞是培养在细胞培养瓶中，通过胰蛋白酶消化贴壁的Hela细胞后收集得到细胞悬液，即可完成样本采集。

将装有细胞样本的的保存液瓶放入振荡器中振荡10分钟，使用一次性吸管吸取5ml含Hela细胞株的细胞保存液至离心管中，设置1000g离心力，离心3min，缓慢倒掉上清液，取细胞样本沉淀部分留用。

使用干净的一次性吸管吸取PBS缓冲液5ml至含有细胞沉淀的离心管；用漩涡混匀器将离心管底部的细胞打散，从而制成细胞悬液；同时设有无细胞的空白对照样本。

步骤S2，滴加细胞悬液至装载FRD染色液的反应塑料管中：将FRD染色液试剂瓶颠倒混匀20s后待用；使用干净的一次性吸管吸取FRD染色液3ml至透明的塑料管中，再使用干净的一次性吸管吸取阳性Hela细胞悬液滴加2滴的细胞量至塑料管的染色液中，盖上塑料管管盖。

步骤S3，密封塑料管，颠倒摇晃塑料管中的混合液体：滴加细胞悬液后密封塑料管并静置60s，颠倒摇晃塑料管5下。

步骤S4，静置等待反应试管壁上包含上皮组织脱落细胞的挂壁液体显色或出现蓝色颗粒：静置5分钟，观察到塑料管壁是否显色。

结果如图3所示，左侧塑料管中含细胞样本，塑料管壁显示蓝色挂壁液体和蓝色颗粒，而右侧塑料管无细胞样本，塑料管壁不显示蓝色。

实施例3

一种检测宫颈癌Hela细胞株的细胞表面叶酸受体表达的方法，包括以下步骤：

步骤S1，制备包含上皮组织脱落细胞的细胞悬液：由于Hela细胞是培养在细胞培养瓶中，通过胰蛋白酶消化贴壁的Hela细胞后收集得到细胞悬液，即可完成样本采集；同时设有无细胞的空白对照样本。

步骤S2，滴加细胞悬液至装载FRD染色液的反应塑料管中：将FRD染色液试剂瓶颠倒混匀20s后待用；使用干净的一次性吸管吸取FRD染色液3ml至透明的塑料管中，再使用干净的一次性吸管吸取阳性Hela细胞悬液滴加2滴的细胞量至塑料管的染色液中，盖上塑料管管盖。

步骤S3，密封塑料管，颠倒摇晃塑料管中的混合液体：滴加细胞悬液后密封塑料管并静置60s，颠倒摇晃塑料管5下。

步骤S4，静置等待反应试管壁上包含上皮组织脱落细胞的挂壁液体显蓝色或出现蓝色颗粒：静置5分钟，观察塑料管壁是否显色。

结果如图4所示，右侧两支塑料管为本实施例的显色结果，其中，右一塑料管中含细胞样本，塑料管壁显示蓝色挂壁液体和少量蓝色颗粒，而右二塑料管无细胞样本，塑料管壁不显示蓝色。另有最左侧塑料管为本发明按照实施例2的方法所做的检测宫颈癌Hela细胞株的细胞表面叶酸受体表达的显色结果，通过对比可知，实施例3的细胞悬液未经过离心浓缩步骤，虽能使塑料管壁显色，但是显色程度显然弱于同等条件下但多了离心浓缩步骤的实施例2的显色结果。

实施例4

一种试剂盒，设置一个具有多个凹槽或试管托的吸塑盒，将采样工具、细胞保存液试剂瓶、叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)试剂瓶、可密封的反应试管，以及一次性使用吸管分别放在对应的凹槽或试管托里，进行封装保存，得到试剂盒。

对比实验1：

细胞样本来源选择：阳性样本选择高表达叶酸受体的宫颈癌Hela细胞株；阴性样本选择TCT液基细胞学结果为阴性的低表达叶酸受体的脱落细胞样本；对照样本为无细胞的空白样本。分别使用常规FRD方法和本发明的检测方法对所述三份细胞样本进行检测细胞表面叶酸受体表达。

第一组检测方法为完全参照实施例2的方法检测细胞表面叶酸受体表达。

第二组检测方法为模拟现有常规的FRD染色方法检测细胞表面叶酸受体表达：将三份细胞样本添加细胞保存液，制备得到包含上皮组织脱落细胞的细胞悬液，并将三份细胞悬液转移至离心管，置于离心机内，并设置800g离心力，离心10min，细胞样本沉淀到离心管底，取一根医用棉签蘸取FRD染色液后再接触离心管底的细胞沉淀按压3～5s，取出棉签，观察其颜色变化。

结果如图5所示，图5a为第一组检测方法的显色结果，其中，左边塑料管为Hela细胞阳性样本的显色结果，中间塑料管为空白对照样本的显色结果，右边塑料管为阴性样本的显色结果，可见左边塑料管壁上呈现蓝色非常明显，而空白对照样本和阴性样本的试管壁并不显示蓝色，挂壁液体基本维持了染色液原有的颜色。而图5b为第二组检测方法的显色结果，其中，左侧棉签为Hela细胞阳性样本的显色结果，中间棉签为空白对照样本的显色结果，右边棉签为阴性样本的显色结果，可见三根棉签均有不同程度的蓝色显现，猜测是由于棉签的物质特性容易使染料氧化，当棉签蘸取染色液后与空气接触面积大就会使棉签上的还原型亚甲基蓝氧化而显示蓝色，因而空白对照组和细胞阴性样本组也有蓝色显现，呈现假阳性，不利于操作人员进行正确的结果判读。

对比实验2

第三组检测方法为完全参照实施例2的方法检测宫颈癌Hela细胞株细胞表面叶酸受体表达。

第四组检测方法为参照实施2的方法检测宫颈癌Hela细胞株细胞表面叶酸受体表达，区别在于，无步骤S3，制备Hela细胞株的细胞悬液，用干净的一次性吸管吸取阳性Hela细胞株的细胞悬液滴加2滴的细胞量至塑料管的染色液中，盖上塑料管管盖，静置60s，不进行颠倒摇晃塑料管，直接静置5分钟后观察塑料管壁是否显色。

结果如图6所示，最左侧的塑料管为第三组检测方法的显色结果，中间塑料管为第四组检测方法的显色结果，最右侧塑料管为空白对照样本的显色结果，可见，左侧试管壁上具有明显的蓝色颗粒显示，挂壁液体显示蓝色，而中间塑料管和右侧塑料管无蓝色显示，染色液维持原有颜色。

以上对比实验1充分说明了现有的FRD染色方法即使用医用棉签蘸取染色液后直接接触细胞等待显色，容易出现假阳性的结果；而对比实验2证明本发明将细胞样本先处理成细胞悬液，和染色液充分接触后，还必需经过颠倒摇晃操作，才能使脱落细胞及少量染色液在试管壁上滞留一段时间，其中逸出的亚甲蓝在试管壁上显色，使得挂壁液体呈现蓝色，或者部分形成蓝色颗粒，与阴性样本及空白对照样本的显色结果差别明显，不容易出现假阳性的情况。

准确度实验

选择24例TCT液基细胞学结果为高级别病变以上的脱落细胞样本为阳性样本，24例TCT液基细胞学结果为正常的的脱落细胞样本为阴性样本，以上阳性样本的患者均经过活检验证TCT结果符合。检测方法为完全参照实施例1的方法检测细胞表面叶酸受体表达，并计算其方法敏感度、特异性、阳性预测值、阴性预测值。

计算方法：在确认为阳性样本中，通过本发明检测方法检测结果为阳性的记为真阳性，检测结果为阴性的记为假阴性。在确认为阴性样本中，通过本发明检测方法检测结果为阳性的记为假阳性，检测结果为阴性的记为真阴性，通过下列公式进行计算：

灵敏度＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％；

特异性＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％；

阳性预测值＝真阳性人数/(真阳性人数+假阳性人数)*100％；

阴性预测值＝真阴性人数/(真阴性人数+假阴性人数)*100％。

结果：检测24例确认为阳性样本，通过本发明检测方法检测结果为阳性(真阳性)的有20例，阴性(假阴性)有4例。检测24例确认为阴性样本，通过本发明检测方法检测结果为为阳性(假阳性)的有2例，阴性(真阴性)有22例。可计算得到本发明检测方法的准确度结果为灵敏度为83.3％，特异性为91.7％，阳性预测值为90.9％，阴性预测值为84.6％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.制备包含上皮组织脱落细胞的细胞悬液；

S2.滴加细胞悬液至装载叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)的反应试管中；

S3.密封反应试管，颠倒摇晃试管中的混合液体；

S4.静置等待反应试管壁上包含上皮组织脱落细胞的挂壁液体显蓝色或出现蓝色颗粒。

2.根据权利要求1所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，其特征在于，所述步骤S1中，包括以下步骤：S1-1.用一次性使用采样工具进行上皮组织脱落细胞采样，得到细胞样本；优选地，采样工具为采样刷或拭子。

3.根据权利要求2所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，其特征在于，所述步骤S1中，包括以下步骤：S1-2.往所述细胞样本中添加细胞保存液，或将所述细胞样本添加至细胞保存液中，并将包含细胞样本的保存液瓶(管)放入振荡器中振荡3-15min，吸取1-10ml所述包含细胞样本的细胞保存液至离心管中，设置800-1500g离心力，离心3-15min，缓慢倒掉上清液，取细胞样本沉淀部分留用。

4.根据权利要求3所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，其特征在于，所述步骤S1中，包括以下步骤：S1-3.吸取PBS缓冲液1-5ml至含有所述细胞样本沉淀部分的离心管，用吸管吹吸或用漩涡混匀器将离心管底部的细胞打散，从而制成所述细胞悬液。

5.根据权利要求1所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，其特征在于，所述步骤S2.中，将叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)试剂瓶颠倒混匀3-30s后待用。

6.根据权利要求1所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，其特征在于，所述步骤S2.中，所述叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)用量为1-3ml，所述细胞悬液用量为2-10滴。

7.根据权利要求1所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，其特征在于，所述步骤S3.中，所述反应试管密封后静置30-120s，然后颠倒摇晃反应试管5-10下。

8.根据权利要求1所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，其特征在于，所述步骤S4.中，静置时间为5-30min。

9.根据权利要求1所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，其特征在于，所述反应试管材质为塑料、玻璃或可供含脱落细胞的液体挂壁的材料。

10.根据权利要求1～9任一所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法，其特征在于，所述上皮组织脱落细胞为浆膜腔积液脱落细胞、子宫颈及阴道脱落细胞、呼吸系统脱落细胞、脑脊液细胞及脱落细胞、消化系统脱落细胞、泌尿系统脱落细胞中的一种或两种以上；优选地，所述上皮组织脱落细胞为子宫颈及阴道脱落细胞。

11.一种根据权利要求1～10任一所述的检测上皮组织脱落细胞表面叶酸受体表达的方法所设计的试剂盒，其特征在于，包括采样工具、细胞保存液试剂瓶、叶酸受体介导的特殊染色液(FRD染色液)试剂瓶、可密封的反应试管以及一次性使用吸管的组合。

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