CN113509751B

CN113509751B - 一种基于烷醇低共熔溶剂的萃取-反萃取体系及其应用

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Publication number: CN113509751B
Application number: CN202110790747.1A
Authority: CN
Inventors: 肖玉秀; 黄安琪
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2021-07-13
Filing date: 2021-07-13
Publication date: 2022-07-19
Anticipated expiration: 2041-07-13
Also published as: CN113509751A

Abstract

本发明提供一种基于烷醇低共熔溶剂的萃取‑反萃取体系，包括烷醇低共熔溶剂与水或第一酸性水溶液组成的液‑液两相萃取体系和烷醇低共熔溶剂与碱性水溶液或第二酸性水溶液组成的液‑液反萃取体系。该体系品多价廉，毒性低，稳定性强，不易解离，熔点低，pH耐受范围广；本发明还提供上述基于烷醇低共熔溶剂的萃取‑反萃取体系在活性化合物提取纯化中的应用。其萃取产量高、纯化效果好且烷醇低共熔溶剂可以多次重复利用。本发明还提供一种活性化合物的提取纯化方法。其操作简单、绿色，萃取、纯化步骤少，所耗时间少，且无需使用特殊设备，对活性化合物的回收率高。

Description

一种基于烷醇低共熔溶剂的萃取-反萃取体系及其应用

技术领域

本发明专利涉及天然产物的分离提纯技术领域，尤其是指基于烷醇低共熔溶剂的萃取-反萃取体系及其应用。

背景技术

生物活性化合物通常来源于植物、真菌、藻类、水果、微生物等多种生物有机体(总称生物质)中的次级代谢产物。它们在应激反应、自然防御等重要机制中发挥着不可替代的作用。基于有机溶剂的固液萃取(如热流提取、索式萃取等)是从生物基质中提取生物活性化合物的传统手段。然而传统手段多涉及以下问题：①有机溶剂使用量大，有违绿色化学的理念；②使用有机溶剂提取时选择性差，加大后续纯化工作量；③加热回流萃取技术操作繁琐、能耗大，造成能源浪费，且温度过高易导致目标化合物活性丧失。

低共熔溶剂(DES)是由氢键给体和氢键受体，通过氢键作用力缔合形成的一种共熔溶剂，其熔点低于各组成成分。DES具备制备简单、无需纯化、溶解能力强、无毒性、可设计性等优势。近年来，基于DES的提取技术以其优异的萃取效果、简单温和的操作、绿色环保和有助于维持提取物的活性展现出传统提取方法不可比拟的优势，在活性化合物提取领域有着诸多应用。

然而，由于DES蒸汽压低、难挥发，使得DES和活性化合物难以通过旋转蒸发等传统方法回收。目前DES提取物中活性物质的进一步分离纯化方法很有限，主要有大孔树脂吸附法、固相萃取法以及反萃取剂法。但它们存在纯化过程需要额外购买或合成吸附剂，成本较高，操作流程耗时耗力，且洗脱时仍需消耗有机溶剂；DES在回收过程中因过度稀释导致结构被破坏，难以循环利用的问题。

因此，开发价格低廉、操作简单、产品易于纯化且DES可以重复利用的DES萃取-反萃取体系，并将其用于活性化合物的萃取纯化具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，在本发明的第一方面，本发明提供一种基于烷醇低共熔溶剂的萃取-反萃取体系，包括烷醇低共熔溶剂与水或第一酸性水溶液组成的液-液两相萃取体系和烷醇低共熔溶剂与碱性水溶液或第二酸性水溶液组成的液-液反萃取体系；优选地，所述烷醇低共熔溶剂包括烷醇；更优选地，所述烷醇包括如下物质中的至少一种：1-二十二烷醇、1-二十烷醇、1-十九烷醇、1-十八烷醇、1-十七烷醇、1-十六烷醇、1-十五烷醇、1-十四烷醇、1-十三烷醇、1-十二烷醇、薄荷醇。

更优选地，所述烷醇由1-十二烷醇和薄荷醇组成。更优选地，所述烷醇由1-十二烷醇和薄荷醇按摩尔比为1：(2～3)组成。

本发明还提供一种基于烷醇低共熔溶剂的萃取体系，包括烷醇低共熔溶剂与水或第一酸性水溶液；优选地，所述烷醇低共熔溶剂包括烷醇；更优选地，所述烷醇包括如下物质中的至少一种：1-二十二烷醇、1-二十烷醇、1-十九烷醇、1-十八烷醇、1-十七烷醇、1-十六烷醇、1-十五烷醇、1-十四烷醇、1-十三烷醇、1-十二烷醇、薄荷醇。

本发明还提供一种基于烷醇低共熔溶剂的反萃取体系，包括烷醇低共熔溶剂与碱性水溶液或第二酸性水溶液；优选地，所述烷醇低共熔溶剂包括烷醇；更优选地，所述烷醇包括如下物质中的至少一种：1-二十二烷醇、1-二十烷醇、1-十九烷醇、1-十八烷醇、1-十七烷醇、1-十六烷醇、1-十五烷醇、1-十四烷醇、1-十三烷醇、1-十二烷醇、薄荷醇。

在本发明的一个或多个实施例中，所述第一酸性水溶液为盐酸水溶液，所述第二酸性水溶液选自盐酸水溶液、磷酸水溶液、草酸水溶液中的一种。

在本发明的第二方面，本发明提供一种在本发明第一方面所述的基于烷醇低共熔溶剂的萃取-反萃取体系和/或基于烷醇低共熔溶剂的萃取体系和/或所述的基于烷醇低共熔溶剂的反萃取体系在活性化合物提取纯化中的应用。

在本发明的一个或多个实施例中，所述活性化合物为蒽醌类化合物。优选地，所述蒽醌类化合物包括1,8-二羟基蒽醌、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。

在本发明的第三方面，本发明提供一种活性化合物的提取纯化方法，包括如下步骤：

步骤一：活性化合物的萃取

1)将含有活性化合物的生物质加入水或第一酸性水溶液中；

2)步骤1)得到的混合液中加入烷醇低共熔溶剂，萃取，离心，得到液-液-固三相体系，上相为烷醇低共熔溶剂萃取相；

步骤二：活性化合物的反萃取

将步骤一得到的烷醇低共熔溶剂萃取相与碱性水溶液或第二酸性水溶液混合，离心，得到两相，收集碱性水溶液相或第二酸性水溶液；

步骤三：活性化合物的沉淀与干燥

将步骤二得到的碱性水溶液或第二酸性水溶液相中加入酸性或碱性物质中和，混合，离心，干燥固相，得到活性化合物；

所述烷醇低共熔溶剂包括烷醇；优选地，所述烷醇包括如下物质中的至少一种：1-二十二烷醇、1-二十烷醇、1-十九烷醇、1-十八烷醇、1-十七烷醇、1-十六烷醇、1-十五烷醇、1-十四烷醇、1-十三烷醇、1-十二烷醇、薄荷醇。

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤一的步骤1)中，第一酸性水溶液为盐酸溶液，所述盐酸溶液的浓度为0～20％(w/v)。

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤一的步骤2)中，加入的烷醇低共熔溶剂与含有活性化合物的生物质的体积质量比为2.5～50mL/g，所述萃取在25～100℃、200～800rpm搅拌条件下进行10～60min；所述离心为在3000～10000rpm下离心3～10min。

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤二中，所述第二酸性水溶液选自盐酸水溶液、磷酸水溶液、草酸水溶液中的一种；步骤一得到的烷醇低共熔溶剂萃取相与碱性水溶液或第二酸性水溶液的体积比为(10:1)～(1:10)，所述混合为涡旋混合5～300s，所述离心为在3000～10000rpm下离心3～10min。

在本发明的一个或多个实施例中，所述步骤三中，所述酸性或碱性物质以水溶液形式加入，所述酸性或碱性物质的水溶液的浓度为0.01～2M；所述混合为涡旋混合5～300s，所述离心为在3000～10000rpm下离心3～10min。

在本发明的一个或多个实施例中，所述活性化合物为蒽醌类化合物。优选地，所述蒽醌类化合物包括1,8-二羟基蒽醌、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚。图1为利用本发明基于烷醇低共熔溶剂的萃取-反萃取体系对活性化合物进行提取纯化的流程示意图。

本发明利用基于烷醇的低共熔溶剂首次构建了基于疏水性低共熔溶剂的液-液两相萃取体系和反萃取体系，并将其用于活性成分的分离纯化中。本发明的体系绿色环保、成本低廉；体系应用操作简单，且疏水性低共熔溶剂可以重复利用，解决了传统疏水性低共熔溶剂萃取时活性成分纯化操作复杂且低共熔溶剂难以回收利用等关键问题。此外，本发明创造性的发现了利用长链烷醇与烷醇形成的低共熔溶剂具有优异的pH稳定性。相比于目前已经报道的疏水性低共熔溶剂，本发明烷醇-低共熔溶剂在pH为2-14的范围内均能保持稳定，因此非常适合构建低共熔溶剂-酸/碱溶液液-液反萃取体系。

本发明的方法采用烷醇低共熔溶剂-水两相萃取体系和烷醇低共熔溶剂-酸/碱溶液液-液反萃取体系对生物质中活性化合物进行萃取及纯化，萃取后低共熔溶剂位于上相、易于收集，萃取产量高；所得低共熔溶剂相只需通过简单的操作即可完成纯化过程，反萃取效率和回收率高，可获得高纯度的活性化合物；回收所得化合物活性得到保持，低共熔溶剂能够重复利用。该基于烷醇低共熔溶剂的萃取及反萃取体系应用于萃取纯化活性化合物的方法操作简便、成本低廉、绿色环保、适合工业化生产。

与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：

1、本发明提供一种基于烷醇低共熔溶剂的萃取-反萃取体系，该体系品多价廉、毒性低；该体系包括烷醇-低共熔溶剂，其不含双键，稳定性强，具备氢键供/受体位点，具有不易解离，熔点低，pH耐受范围广等特点；

2、本发明还提供上述基于烷醇低共熔溶剂的萃取-反萃取体系在活性化合物提取纯化中的应用。其萃取产量高、纯化效果好且烷醇低共熔溶剂可以多次重复利用。烷醇-低共熔溶剂能够破坏生物质细胞壁，使其中的活性化合物释放，显著地提高了活性成分的提取效果；低共熔溶剂会通过疏水相互作用、氢键相互作用等分子间作用力高效溶解目标活性化合物。

3、本发明还提供一种活性化合物的提取纯化方法，其使用上述基于烷醇低共熔溶剂的萃取-反萃取体系，萃取过程操作简单、绿色，基于烷醇低共熔溶剂的萃取、纯化步骤少，所耗时间少，且无需使用特殊设备。低共熔溶剂粘度低，便于收集；萃取溶剂毒性小，萃取和反萃取过程中无需使用任何额外固相萃取材料或有机溶剂，方法环保无害，并同时节约了时间、人力和耗材等成本。本方法对活性化合物的回收率高，通过调节pH能排除低共熔溶剂萃取相中杂质，不仅可以回收得到高纯度的活性成分，还能回收低共熔溶剂且回收的低共熔溶剂可以重复使用至少5次。

附图说明

图1为利用本发明基于烷醇低共熔溶剂的萃取-反萃取体系对活性化合物进行提取纯化的流程示意图。

图2为1-十二烷醇：薄荷醇低共熔溶剂的固液相图；L表示液相；S表示固相。

图3a实施例4得到的富含蒽醌的低共熔溶剂相的液相色谱图；图3b为用实施例5经过纯化步骤后得到的蒽醌配制成0.5mg/mL的蒽醌乙醇溶液，进行液相色谱分析得到的色谱图；其中，色谱峰1,2,3,4,5分别为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的色谱峰。

图4为经过不同处理手段后大黄粉末表面的扫描电子显微镜图：图4a是未经处理；图4b是经1-十二烷醇:薄荷醇低共熔溶剂提取；图4c是经过1-十二烷醇:薄荷醇低共熔溶剂-水(盐酸浓度13％,w/v)萃取；每张图像放大倍数为2000。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

实施例1：基于烷醇的低共熔溶剂的固液相图绘制

分别精密称取一系列摩尔比例的1-十二烷醇和薄荷醇(1-十二烷醇与薄荷醇的摩尔比例依次为9:1,4:1,3:1,2:1,3:2,1:1,2:3,1:2,1:3,1:4,1:9)于玻璃小瓶中混匀、加热至形成均一液体。通过描绘不同摩尔比例的共熔混合物所对应的熔点来绘制低共熔溶剂的固液相图。熔点(Tm)的测定通过记录液态低共熔溶剂开始凝固时的温度。如图2所示，随着氢键受体—薄荷醇的摩尔分数增加，低共熔溶剂的熔点均呈现先下降至一个最低点再上升的趋势，所达到的最低点即为低共熔溶剂的低共熔点。1-十二烷醇:薄荷醇低共熔溶剂(熔点：-4.7℃)在低共熔点(1:3)处的熔点均明显低于其单个组分1-十二烷醇(熔点：24℃)和薄荷醇(熔点：34℃)的熔点。并且，1-十二烷醇-薄荷醇低共熔溶剂的熔点在室温以下，可以直接作为萃取剂使用。

实施例2：基于烷醇的低共熔溶剂的理化性质测定

1)1-十二烷醇:薄荷醇摩尔比为1：3的低共熔溶剂的制备

精密称取低共熔比例(1-十二烷醇和薄荷醇摩尔比为1:3)下的1-十二烷醇和薄荷醇于玻璃小瓶中并加热(40～80℃)至形成均一液体，即为成功合成的1-十二烷醇-薄荷醇低共熔溶剂。

2)测定上述烷醇低共熔溶剂的粘度和密度

使用旋转流变仪测定粘度，测试条件为：温度25℃、剪切速率0.1-1000s^-1、平行板间距40mm、测试时间11min；密度的测定：室温下，用移液枪吸取100μL低共熔溶剂，然后使用分析天平称量枪头所增加的质量(Δm)，重复该过程六次，并根据ρ＝Δm/V计算密度。

3)测定上述烷醇低共熔溶剂的极性

使用芘法测定低共熔溶剂的极性，具体方法如下：首先，用无水乙醇配制1.25mM的芘储备溶液。然后，将50μL的芘储备液加入到1.5mL离心管中，真空干燥以除去乙醇。再将残留的芘溶解在1mL低共熔溶剂中，超声10min、涡旋2min，通过荧光分光光度计在335nm的激发波长下测量发射光谱。将荧光光谱中的第一峰(I₁,373.5±0.5nm)和第三峰(I₃,384.5±0.5nm)的荧光强度比(I₁/I₃)定义为低共熔溶剂的极性。

4)研究上述烷醇低共熔溶剂的pH稳定性

对烷醇低共熔溶剂的pH稳定性进行表征，并将其与已报道的五种代表疏水DESs(四丁基氯化铵:癸酸，利多卡因:癸酸，薄荷醇:癸酸，薄荷醇:乙酸，甜菜碱:六氟异丙醇)进行比较。

具体过程如下：首先，配制一系列pH为2-14的水溶液。室温下，将各低共熔溶剂与上述系列梯度pH的水溶液分别以体积比1:1(150μL/150μL)涡旋混合1min，然后以6000rpm离心5min，观察体系的宏观相行为。

1-十二烷醇与薄荷醇摩尔比为1:3的1-十二烷醇-薄荷醇低共溶溶剂的熔点、粘度、密度、极性的测量结果如下表1所示，由表可知，低共熔溶剂的粘度为29.55mPa.s，较低的粘度使得待萃取目标活性化合物在固体基质和萃取溶剂之间转移更加容易，以该低共熔溶剂作为萃取剂有利于其从固体基质中萃取活性化合物。1-十二烷醇-薄荷醇低共熔溶剂的密度小于1，说明其与水形成两相后位于上相，便于萃取后收集低共熔溶剂相。1-十二烷醇-薄荷醇低共熔溶剂极性为0.803，弱极性的特性使得其对于疏水型活性化合物的萃取效果良好。

1-十二烷醇-薄荷醇低共溶溶剂和已报道疏水低共熔溶剂的pH稳定性对比如表2所示，由结果可知，现有技术中，已报道的疏水低共熔溶剂在强碱性条件(pH＝13-14)时会发生上下相体积不一致，生成凝胶、沉淀、单相等现象，均无法在强碱条件下保持稳定。而本发明所提出的1-十二烷醇和薄荷醇组成的低共熔溶剂在pH＝2-14范围内均能以1:1体积比稳定分相，适合构建低共熔溶剂-酸/碱溶液液-液反萃取体系。

表1 1-十二烷醇-薄荷醇低共熔溶剂的理化性质

表2 1-十二烷醇-薄荷醇低共熔溶剂和已报道疏水低共熔溶剂的pH稳定性

注：V_上<V_下和V_上>V_下分别表示上相体积小于下相体积和上相体积大于下相体积

实施例3：基于烷醇的低共熔溶剂的纯化方法构建

精密称取5mg 1,8-二羟基蒽醌溶解于5mL1-十二烷醇与薄荷醇摩尔比1:3的低共熔溶剂中，以配制浓度为1mg/mL的1,8-二羟基蒽醌的低共熔溶剂溶液。精密量取500μL上述1,8-二羟基蒽醌的低共熔溶剂溶液与1mL 0.1M NaOH溶液，混合，涡旋5min，6000rpm离心5min，记为反萃取1次；用1mL注射器吸去NaOH水相后，重新加入1mL 0.1M NaOH溶液涡旋混合、离心，记为反萃取2次；重复上述操作分别进行反萃取3次和反萃取4次。分别取反萃取不同次数(0，1，2，3，4次)时所得低共熔溶剂相，定量检测并计算反萃取不同次数时1,8-二羟基蒽醌的反萃取率。结果如表3所示，反萃取1-4次后对1,8-二羟基蒽醌的反萃取效率依次为94.49％，99.47％，99.95％和99.96％，表现出优异的反萃取效果。

接着在反萃取4次1,8-二羟基蒽醌的NaOH水溶液中加入1M盐酸溶液进行酸化处理，计算1,8-二羟基蒽醌析出的回收率。回收率如表3所示，由表可知，回收率在99％以上。

这是由于1,8-二羟基蒽醌的pKa为6.27(±0.20)，logP为4.003(±0.821)，因此在偏中性的弱极性低共熔溶剂中，分子状态的1,8-二羟基蒽醌能很好地溶解，但当弱极性低共熔溶剂中的1,8-二羟基蒽醌与强碱性水溶液接触后，1,8-二羟基蒽醌因酚羟基解离为离子状态而更倾向于分配到水相中。加入1M盐酸溶液后，由于体系被中和，1,8-二羟基蒽醌重新转变为难溶于水的分子状态，因此可以从水溶液中大量析出，回收率在99％以上。

以上结果说明，碱性溶液能对1-十二烷醇:薄荷醇低共熔溶剂中的1,8-二羟基蒽醌实现优异的反萃取效果；并且将NaOH水相酸化之后1,8-二羟基蒽醌会重新析出。

表3 1,8-二羟基蒽醌在1-十二烷醇:薄荷醇低共熔溶剂中的反萃取率、回收率

实施例4：基于烷醇的低共熔溶剂萃取大黄实际样品中蒽醌

准确称取0.1g大黄粉末(65目)，加入1mL去离子水，再加入565μL浓盐酸使水相中酸浓度为13％(w/v)。随后，以低共熔溶剂与大黄粉末的体积质量比为12.5mL/g加入1.25mL1-十二烷醇:薄荷醇(1:2)低共熔溶剂到上述混合物中。整个体系在69℃，500rpm条件下充分搅拌萃取15min，提取完成后以6000rpm离心10min，得到液-液-固三相体系。其中，上相为富含蒽醌的低共熔溶剂相，中间相为水相，下相为大黄粉末。利用HPLC-DAD定量检测低共熔溶剂相中的蒽醌产量。如表4所示，对各蒽醌(芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚)的萃取产量分别为2.81、4.29、3.91、8.25、2.48mg/g，总蒽醌产量为21.74mg/g，表明本发明所提供的方法能够成功从大黄生物质中提取蒽醌类活性化合物。

表4基于烷醇低共熔溶剂的萃取方法对大黄中蒽醌的萃取产量

实施例5：基于烷醇的低共熔溶剂中蒽醌的纯化

采用两步法纯化实施例4得到的富含蒽醌的低共熔溶剂相中的蒽醌，具体步骤为：1)取100μL实施例4得到的提取大黄生物质后富含蒽醌的低共熔溶剂于1mL离心管中，以体积比1:2(v/v)加入0.75M NaOH溶液，将混合溶液涡旋混合30s，6000rpm离心5min，得到低共熔溶剂-NaOH溶液两相体系；2)收集NaOH水相于另一离心管中，以体积比1:1(v/v)加入1M的HCl溶液，涡旋混合30s，此时离心管内出现大量黄色悬浮小颗粒，再以6000rpm离心5min，离心管底部即出现蒽醌的固体沉淀。分别计算第一步各蒽醌的反萃取率以及第二步各蒽醌的回收率。如表5所示，对芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的反萃取率分别为97.03％,99.26％,98.50％,97.74％,92.17％，展现出了优异的反萃取效果；对各蒽醌的回收率依次分别可达到95.26％,96.47％,95.93％,98.64％,97.99％，表明本发明所提供的纯化方法有效，能够成功纯化出低共熔溶剂中的蒽醌化合物。

表5基于烷醇低共熔溶剂的纯化方法对蒽醌的反萃取率及回收率

实施例6：基于烷醇的低共熔溶剂的回收

重复实施例4和实施例5中步骤1进行大黄生物质中蒽醌的萃取和反萃取，收集低共熔溶剂相。在回收的低共熔溶剂中再次加入相同液固比的新鲜大黄粉末，继续进行下一次提取-反萃取过程。整个提取-反萃取过程连续重复五次，分别计算每次提取后对各蒽醌的提取产量以及每一次反萃取后各物质的反萃取率。如表6所示，回收的低共熔溶剂重复提取大黄粉末至少五次后对总蒽醌的提取产量仍有20.76mg/g，没有明显损失，并且经过每一次NaOH溶液反萃取后各物质的反萃取效率也没有显著下降，仍能保持在80％以上。以上结果表明，本发明所提供的方法能够保证所使用的低共熔溶剂在连续的提取和回收过程中性能有效保持，可重复利用至少五次以上。

表6重复利用1-十二烷醇:薄荷醇低共熔溶剂一至五次对蒽醌的产量及反萃取效率

实施例7：回收所得蒽醌的鉴定分析

使用DPPH法评估回收得到的总蒽醌的抗氧化活性。首先，配制1.5mM DPPH乙醇溶液，使吸光值A₀在0.6-1.0之间；另配制0.5mg/mL的回收所得总蒽醌乙醇溶液及1,8-二羟基蒽醌标准品溶液。将1mL DPPH溶液和2mL 0.5mg/mL的回收所得总蒽醌乙醇溶液以及1,8-二羟基蒽醌标准品溶液分别混合，避光室温反应30min，记录在515nm处的吸光值。每组实验平行三份。计算样品对DPPH自由基的清除作用。另配制0.5mg/mL的回收所得总蒽醌的乙醇溶液，进行HPLC-DAD分析，记录在全波长扫描模式下总蒽醌乙醇溶液的色谱图。结果显示，0.5mg/mL回收所得总蒽醌乙醇溶液及1,8-二羟基蒽醌标准品乙醇溶液对DPPH溶液的褪色能力分别为36.34±2.96％和35.90±3.60％，表明通过本发明所提供的萃取纯化方法从大黄生物质中得到的蒽醌具有和标准蒽醌相当的抗氧化活性，萃取纯化过程不会对蒽醌化合物的活性造成影响。实施例4得到的富含蒽醌的低共熔溶剂相的液相色谱图如图3a所示，由图可知，提取大黄生物质后低共熔溶剂相中在10分钟内还分布大量的杂质峰，采用面积归一化法计算杂质含量为29.6±0.8％；用实施例5经过纯化步骤后得到的蒽醌，配制0.5mg/mL的蒽醌乙醇溶液，进行液相色谱分析，检测结果如图3b所示，由图可知，杂质峰明显减少，杂质含量下降至6.7±0.5％(蒽醌纯度为93.3％)，下降幅度达77.4％。以上结论说明，本发明所提供的方法具有明显的纯化、除杂效果。

实施例8：生物质表面形貌分析

制备经过不同方式处理的大黄样品：1)未处理的大黄粉末(作为空白对照)；2)0.1g大黄粉末与1.25mL1-十二烷醇:薄荷醇(1:2)低共熔溶剂混合并于69℃、500rpm条件下处理15min；3)经过实施例4全过程处理。处理结束后，分别在6000rpm离心10min，倒去上清液，粉末于-80℃下冷冻干燥两天，得到处理后的大黄样品。将处理后的大黄样品或未处理的大黄粉末分别固定在硅片上并喷金，采用分辨率为1nm、加速度电压为5kV的扫描电子显微镜观察大黄表面形貌。结果如图4所示，和对照大黄样品相比(图4a)，1-十二烷醇:薄荷醇低共熔溶剂单独处理后的大黄表面表现为多孔结构(图4b)，孔直径大约为10μm，表明低共熔溶剂可以很大程度地破坏细胞壁。而经过实施例4萃取过程后的大黄表面则形成了长条孔状(孔长度20μm以上)形貌(图4c)，这是因为，本发明所提供的萃取方法不但对细胞壁有进一步的破坏作用，进一步地，该萃取方法可以使低共熔溶剂进入细胞壁内并与目标化合物充分接触，从而有利于萃取，对活性化合物萃取效果好，进而得到的大黄样品形貌更规则，整齐。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种基于烷醇低共熔溶剂的萃取-反萃取体系在蒽醌类活性化合物提取纯化中的应用，其特征在于，所述基于烷醇低共熔溶剂的萃取-反萃取体系由烷醇低共熔溶剂与水或第一酸性水溶液组成的液-液两相萃取体系和烷醇低共熔溶剂与碱性水溶液或第二酸性水溶液组成的液-液反萃取体系组成；所述烷醇低共熔溶剂为烷醇；所述烷醇选自如下物质：1-二十二烷醇、1-二十烷醇、1-十九烷醇、1-十八烷醇、1-十七烷醇、1-十六烷醇、1-十五烷醇、1-十四烷醇、1-十三烷醇、1-十二烷醇、薄荷醇；所述第一酸性水溶液为盐酸水溶液，所述第二酸性水溶液选自盐酸水溶液、磷酸水溶液、草酸水溶液中的一种。

2.一种基于烷醇低共熔溶剂的萃取体系在蒽醌类活性化合物提取纯化中的应用，其特征在于，所述基于烷醇低共熔溶剂的萃取体系由烷醇低共熔溶剂与水或第一酸性水溶液组成；所述烷醇低共熔溶剂为烷醇；所述烷醇选自如下物质：1-二十二烷醇、1-二十烷醇、1-十九烷醇、1-十八烷醇、1-十七烷醇、1-十六烷醇、1-十五烷醇、1-十四烷醇、1-十三烷醇、1-十二烷醇、薄荷醇；所述第一酸性水溶液为盐酸水溶液。

3.一种基于烷醇低共熔溶剂的反萃取体系在蒽醌类活性化合物提取纯化中的应用，其特征在于，所述基于烷醇低共熔溶剂的反萃取体系由烷醇低共熔溶剂与碱性水溶液或第二酸性水溶液组成；所述烷醇低共熔溶剂为烷醇；所述烷醇选自如下物质：1-二十二烷醇、1-二十烷醇、1-十九烷醇、1-十八烷醇、1-十七烷醇、1-十六烷醇、1-十五烷醇、1-十四烷醇、1-十三烷醇、1-十二烷醇、薄荷醇；所述第二酸性水溶液选自盐酸水溶液、磷酸水溶液、草酸水溶液中的一种。

4.一种蒽醌类活性化合物的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：蒽醌类活性化合物的萃取

1)将含有蒽醌类活性化合物的生物质加入水或第一酸性水溶液中；

步骤二：蒽醌类活性化合物的反萃取

将步骤一得到的烷醇低共熔溶剂萃取相与碱性水溶液或第二酸性水溶液混合，离心，得到两相，收集碱性水溶液或第二酸性水溶液相；

步骤三：蒽醌类活性化合物的沉淀与干燥

将步骤二得到的碱性水溶液或第二酸性水溶液相中加入酸性或碱性物质中和，混合，离心，干燥固相，得到蒽醌类活性化合物；

所述烷醇低共熔溶剂为烷醇；所述烷醇选自如下物质：1-二十二烷醇、1-二十烷醇、1-十九烷醇、1-十八烷醇、1-十七烷醇、1-十六烷醇、1-十五烷醇、1-十四烷醇、1-十三烷醇、1-十二烷醇、薄荷醇。

5.根据权利要求4所述的蒽醌类活性化合物的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤一的步骤1)中，第一酸性水溶液为盐酸溶液，所述盐酸溶液的浓度为0～20％(w/v)。

6.根据权利要求4所述的蒽醌类活性化合物的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤一的步骤2)中，加入的烷醇低共熔溶剂与含有蒽醌类活性化合物的生物质的体积质量比为2.5～50mL/g，所述萃取在25～100℃、200～800rpm搅拌条件下进行10～60min；所述离心为在3000～10000rpm下离心3～10min。

7.根据权利要求4所述的蒽醌类活性化合物的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤二中，所述第二酸性水溶液选自盐酸水溶液、磷酸水溶液、草酸水溶液中的一种；步骤一得到的烷醇低共熔溶剂萃取相与碱性水溶液或第二酸性水溶液的体积比为(10:1)～(1:10)，所述混合为涡旋混合5～300s，所述离心为在3000～10000rpm下离心3～10min。

8.根据权利要求4所述的蒽醌类活性化合物的提取纯化方法，其特征在于，所述步骤三中，所述酸性或碱性物质以水溶液形式加入，所述酸性或碱性物质的水溶液的浓度为0.01～2M；所述混合为涡旋混合5～300s，所述离心为在3000～10000rpm下离心3～10min。